六君子发酵物的制造方法及含其的中草药化妆品组成物与流程

1.本发明是有关于一种中药材发酵物的制造方法，特别是关于一种六君子发酵物的制造方法及含其的中草药化妆品组成物。


背景技术：

2.六君子，或称为六君子汤，是常用的中药方剂，其中六君子的具体配方在不同的医书中略有不同，但常见的配方包含人参、白术、茯苓、甘草、陈皮及半夏，且部分配方还包含生姜及大枣。六君子的主要功效为补气，特别是补益脾胃之气，故临床上，六君子经口服可用来改善脾胃虚弱、食欲不振、胸脘痞闷及/或呕吐泄泻等症状。
3.然而，含有六君子萃取物的组合物颜色深，且触感不佳，故少用于化妆品组成物中。此外，目前未有针对六君子的化妆品功效的研究。
4.有鉴于此，亟需一种用于化妆品的六君子发酵物及其制造方法，以改善上述缺点。


技术实现要素：

5.因此，本发明的一态样是提供一种六君子发酵物的制造方法。前述制造方法包含利用酵母菌对六君子的干粉及水的悬浮液进行发酵步骤，以获得触感佳且有益皮肤的六君子发酵物，其中六君子发酵物没有现有六君子萃取物色深的问题。
6.本发明的另一态样是提供一种具抗氧化功效的中草药化妆品组成物，可包含上述六君子发酵物。
7.本发明的又一态样是提供一种具保湿功效的中草药化妆品组成物，可包含上述六君子发酵物。
8.本发明的再一态样是提供一种具控油功效的中草药化妆品组成物，可包含上述六君子发酵物。
9.根据本发明的上述态样，提出一种六君子发酵物的制造方法。首先，提供发酵基质，其中发酵基质可例如为由六君子的干粉与水所组成的悬浮液，且六君子可例如由人参、白术、茯苓、甘草、陈皮及生姜所组成。
10.接着，于20℃至50℃下利用酵母菌对上述发酵基质进行发酵步骤达10小时至50小时，从而获得六君子发酵物，其中六君子发酵物可兼具抗氧化、保湿及控油功效。
11.根据本发明的另一态样，提出一种具抗氧化功效的中草药化妆品组成物，其中中草药化妆品组成物可包含上述制造方法制得的六君子发酵物做为有效成分。
12.根据本发明的又一态样，提出一种具保湿功效的中草药化妆品组成物，其中中草药化妆品组成物可包含上述制造方法制得的六君子发酵物做为有效成分。
13.根据本发明的再一态样，提出一种具控油功效的中草药化妆品组成物，其中中草药化妆品组成物可包含上述制造方法制得的六君子发酵物做为有效成分。
14.依据本发明的一实施例，基于干粉为100重量百分比(wt％)，人参的含量可例如为10wt％至30wt％、白术的含量可例如为10wt％至50wt％、茯苓的含量可例如为10wt％至
30wt％、甘草的含量可例如为10wt％至30wt％、陈皮的含量可例如为10wt％至30wt％，且生姜的含量可例如为10wt％至20wt％。
15.依据本发明的一实施例，酵母菌可例如为酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)。
16.依据本发明的一实施例，上述发酵基质中，每100ml的水中可例如含有 1.67g至20g的干粉。
17.依据本发明的一实施例，上述发酵基质中，每10g的干粉可例如含1ml 至30ml的酵母菌，且酵母菌的菌体浓度可例如为105cfu/ml至108cfu/ml。
18.依据本发明的一实施例，六君子发酵物的ph值可例如为4.5至6.8。
19.依据本发明的一实施例，六君子发酵物的制造方法可选择性包含对六君子发酵物进行灭菌步骤及/或固液分离步骤。
20.应用本发明的六君子发酵物的制造方法，可获得兼具抗氧化、保湿及控油功效的六君子发酵物，并可应用于中分别或兼具抗氧化、保湿及控油功效的草药化妆品组成物。
附图说明
21.为让本发明的上述和其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，附图的详细说明如下：
22.图1是绘示根据本发明一实施例的六君子发酵物不同体积浓度的羟自由基清除百分率的折线图。
23.图2是绘示根据本发明一实施例的受试者皮肤施用六君子发酵物后在不同时间点的经皮水分散失量的折线图。
24.图3是绘示根据本发明一实施例的受试者皮肤施用六君子发酵物后在不同时间点的皮肤油脂含量的直条图。
具体实施方式
25.本发明提供一种六君子发酵物的制造方法，其可例如利用酵母菌对发酵基质进行发酵步骤时，从而获得六君子发酵物，其中发酵基质可例如为由六君子的干粉与水所组成的悬浮液，且所获得的六君子发酵物可兼具抗氧化、保湿及控油功效。
26.上述六君子可例如为由人参、白术、茯苓、甘草、陈皮及生姜所组成的中草药复方。前述人参(panax ginseng)属于五加科人参属，一般以肉质根入药。人参具有大补元气、补脾益肺、生津及安神的功效。此外，人参的化妆品功效包含止痒、维持皮肤弹性及防止皮肤老化等。
27.白术(atractylodes macrocephala)属于菊科苍术属，一般以根茎入药。白术具有补气健脾、燥湿利水、止汗及安胎等功效。此外，白术的化妆品功效包含润肤、美白及祛斑等。
28.茯苓(poria cocos)属于多孔菌科茯苓属，一般以菌核(菌丝体特化而成的坚硬结构)入药。茯苓具有利水渗湿及健脾安神的功效，且茯苓的化妆品功效包含紧肤抚纹、皮肤弹性、保湿、抗菌、皮肤调理及镇静等。
29.甘草(glycyrrhiza uralensis)属于豆科甘草属，其根及根茎皆可药用。甘草具有
补中益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和药性等功效，且甘草的化妆品功效包含抗皮肤炎、抗菌、美白、抗冻疮、改善手足皲裂、抗痘疮、保湿、维持皮肤柔软、抗氧化及抗过敏等。
30.陈皮是芸香科柑属中橘子(citrus reticulata)的果皮。陈皮具有健脾、开胃、调理气机、止咳化痰、去湿气(去除水份)及理气等作用，且陈皮的化妆品功效特性包含抗发炎、抑菌(葡萄球菌、卡他奈菌、溶血性嗜血杆菌、表皮真菌等)、促进血液循环、软化皮肤、抗紫外线、清除自由基及抗脂质过氧化等。
31.生姜是姜科姜属的一种植物(zingiber officinale)的新鲜根茎，其具有发散、止呕、止咳等功效。生姜的化妆品功效包含抑菌、抗皮肤过敏、美白及抗氧化等。
32.对上述中草药材料进行干燥步骤及研磨步骤，以获得六君子的干粉。上述干燥步骤的方法不限，可例如为任何现有干燥方法，如：晒干法、阴干法、烘干法、真空冻干法、远红外光干燥法及微波干燥法。在一实施例中，干燥方法可例如为在70℃至80℃进行烘干处理。上述研磨步骤的方法不限，可例如利用任何现有研磨器具进行(如：研钵和研杵或粉碎机)，以获得粒径为30目至80 目的干粉。在一较佳实施例中，干粉的粒径可例如为70目，以利后续操作(如：固液分离)，并提供与酵母菌反应的较佳比表面积，且使六君子发酵物具有较佳的粘度。
33.上述中草药材料的比例不限。在一实施例中，基于干粉为100重量百分比 (wt％)，人参的含量可例如为10wt％至30wt％、白术的含量可例如为10wt％至 50wt％、茯苓的含量可例如为10wt％至30wt％、甘草的含量可例如为10wt％至30wt％、陈皮的含量可例如为10wt％至30wt％，且生姜的含量可例如为10 wt％至20wt％，以使六君子发酵物具有较佳的功效。
34.上述发酵基质中，六君子的干粉及水的比例不限。在一实施例中，每100ml 的水中可例如含有1.67g至20g的干粉。在一实施例中，六君子的干粉及水的重量体积比为5～20：100：300(g：ml)。在一较佳实施例中，每100ml的水中可例如含有5g的干粉。
35.上述酵母菌具有特定酵素，藉由代谢发酵基质中的蛋白质、脂质及淀粉，从而获得富含醣、胺基酸及/或其他特定成分及特定比例的发酵物。酵母菌为任何酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)，如于2021年03月16日寄存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)(地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编号：100101)，且寄存编号为cgmcc no.22020的酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)c-lye-6。在一实施例中，酵母菌可例如在25℃至45℃下进行液态培养，直到光密度(opticaldensity，od)值达0.5至1.0，其中此时酵母菌处于对数期而具有较佳的活性，且菌液中的酵母菌的菌体浓度是105cfu/ml至108cfu/ml。
36.上述酵母菌的接种量不限，在一实施例中，每10g的六君子的干粉可例如接种1ml至30ml的酵母菌。在一实施例中，酵母菌的接种量与六君子的干粉的体积重量比为5～30：5～30(ml：g)。在一较佳实施例中，每10g干粉的酵母菌接种量可例如为15ml。
37.接着，对上述发酵基质进行发酵步骤，以获得六君子发酵物，其中发酵步骤的温度可例如为20℃至50℃，且发酵步骤的时间可例如为10小时至50小时。在上述温度范围下，酵母菌的发酵效率较佳。如果发酵时间过短，则获得的有效成分含量低，但如果发酵时间过长，则可能有杂菌生成的疑虑。在一较佳实施例中，发酵步骤的温度可例如为25℃，且发酵步骤的时间可例如为40小时。
38.利用上述方法制得的六君子发酵物呈现无色至棕色。经检测后，六君子发酵物含有1.0wt％至5.0wt％的可溶性固形物，且每毫升的六君子发酵物可含有 1.0mg至5.0mg的蛋白质、2.0mg至10.0mg的粗多醣、0.1mg至0.8mg总黄酮及0.1mg至0.8mg的总酚。此外，六君子发酵物呈弱酸性(ph值为4.5至6.8)，且六君子发酵物具有100cp至800cp的粘度。
39.在一实施例中，对上述六君子发酵物进行灭菌步骤及/或固液分离步骤，以获得含不活化菌体的六君子发酵物或不含菌体的六君子发酵物。上述灭菌步骤的方法不限，可例如为高压蒸汽处理、干热处理或紫外线处理。上述固液分离的方法不限，可例如重力沉降处理、过滤处理或离心处理。在一实施例中，固液分离可例如以4000rpm至12000rpm的转速进行离心处理达15分钟至30分钟。在一较佳实施例中，固液分离可例如以4500rpm的转速进行离心处理达 20分钟。
40.值得注意的是，上述制造步骤排除利用有机溶剂进行萃取步骤，因此没有有机溶剂的残留。再者，使用上述特定菌株可缩短发酵步骤的时间，而可避免长时间发酵造成的杂菌污染问题，也可避免降低有效成分的活性。
41.经实验证实，上述六君子发酵物兼具有抗氧化、保湿及控油功效。前述抗氧化指清除自由基的能力。前述保湿指经皮水分散失量下降。前述控油是指调节皮肤分泌的油脂含量，以维持皮肤的清爽、滋润而不干燥。此外，上述六君子发酵物具有安全性，其中安全性是指不具刺激性，意即六君子发酵物施用于皮肤后，不会出现红斑、浸润、水肿、丘疹及疱疹反应等。
42.上述六君子发酵物的剂型可例如为含活化菌、含不活化菌体或不含菌体的六君子发酵物。
43.上述六君子发酵物可应用在分别或兼具抗氧化、保湿及控油功效的中草药化妆品组成物中。在一实施例中，上述中草药化妆品组成物的剂型可例如为液剂、乳剂、霜剂、安瓿、胶囊、丸剂、锭剂、粉末、颗粒、凝胶。在一实施例中，上述中草药化妆品组成物可例如用在乳液、化妆水、精华液、隔离霜、洗面奶、面膜或防晒乳上。
44.以下利用数个实施例以说明本发明的应用，然其并非用以限定本发明，本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰。
45.实施例一、制备六君子发酵物
46.六君子的干粉的制造过程如下：自传统中药房购得生产自华中平原的人参、白术、茯苓、甘草、陈皮及生姜。接着，将上述药材在75℃
±
5℃的烘箱中分别进行烘干处理，再利用粉碎机进行研磨，以获得50目的干粉。
47.酵母菌的制造方法如下：将酿酒酵母c-lye-6(cgmcc no.22020)接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar，pda)上，以于30℃下进行固态培养，从而获得酵母菌的菌落，其中该菌落为点状，表面边缘光滑，且颜色呈乳白色而不透明。上述酿酒酵母c-lye-6是细胞形式单独存在。接着，挑选菌落并将菌落接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养水溶液(potato dextrose water，pdw)中，以于20℃至35℃下进行液态培养，从而获得od值为0.5至1.0的菌液，此时菌液中的菌体浓度为105cfu/ml至108cfu/ml。
48.然后，将15g的干粉及300ml的水混合成悬浮液，以做为发酵基质。将 5ml的上述酵母菌菌液接种至发酵基质中，并在25℃下进行发酵步骤达40小时，以获得含菌体的六君子发酵物。接下来，以高压蒸汽处理(121℃的温度、 1.1kg/cm2的压力)对六君子发酵物进行
灭菌步骤，再利用9cm的离心半径、4500 rpm的转速进行离心处理达20分钟，以搜集上清液，其中上清液为不含菌体的六君子发酵物(以下简称六君子发酵物)。
49.在制备例1中，基于干粉为100wt％，白术含量为50wt％，且人参、茯苓、甘草、陈皮及生姜的含量分别为10wt％。在制备例2中，基于干粉为100wt％，茯苓及甘草的含量分别为30wt％，且人参、白术、陈皮及生姜的含量分别为10 wt％。在制备例3中，基于干粉为100wt％，白术含量为30wt％，人参及生姜的含量分别为20wt％，且茯苓、甘草及陈皮的含量分别为10wt％。在制备例4 中，人参及陈皮的含量分别为30wt％，且白术、茯苓、甘草及生姜的含量分别为10wt％。制备例1至制备例2的菌体浓度约为106cfu/ml，制备例3的菌体浓度约为107cfu/ml，且制备例4的菌体浓度约为108cfu/ml。
50.利用现有方法，如：利用旋转粘度测定计及酸碱度计定法，以测量制备例 1至制备例4的六君子发酵液的粘度及ph值，其中六君子发酵物的粘度为100 cp至800cp，且ph值为4.5至6.8，表示六君子发酵物的触感佳且呈弱酸性，适合用于化妆品。补充说明的是，上述六君子发酵液无致病菌检出，因此具有生物安全性。
51.经测量，制备例1至制备例4的六君子发酵液含有0.9wt％至2.0wt％的可溶性固形物。其次，利用层析法检测，每毫升六君子发酵物含有1.0mg至5.0mg 的蛋白质、2.0mg至10.0mg的粗多醣、0.1mg至0.8mg总黄酮及0.1mg至 0.8mg总酚。前述总黄酮及总酚可能包含具有清除自由基功效的物质，而使六君子发酵物具有抗氧化的潜力。补充说明的是，制备例1至制备例4的六君子发酵液是以相似的制造方法制得，且具有上述组成(蛋白质、粗多醣、总黄酮及总酚)，虽然以下仅以制备例1做为示例，但以相同的方法评估，制备例2至制备例4具有相同的功效，故不再赘述。
52.实施例二、评估六君子发酵物的抗氧化能力
53.利用芬顿反应及水杨酸捕获羟自由基的呈色反应来测量六君子发酵物清除羟自由基的能力，从而评估其抗氧化能力，其中芬顿反应利用过氧化氢及亚铁离子制造羟自由基，且水杨酸与羟自由基反应后可产生紫色产物。由于此紫色产物对510nm的光具有较大吸光值，因此如果六君子发酵物具有抗氧化功效，则六君子发酵物加入含有过氧化氢、亚铁离子及水杨酸的反应溶液后，可降低反应溶液对510nm的光的吸光值。
54.依照表1配制实施例1、比较例1、对照例1及对照例2的样本，并于37℃进行水浴达15分钟。接着，以分光亮度计测量各样本于510nm的吸光值。其中，表1中的feso4的浓度为9mmol/l，h2o2的浓度为8.8mmol/l，水杨酸为 9mmol/乙醇(l)，且实施例1中的六君子发酵物是由上述制备例1制得，其浓度为10wt％、20wt％或30wt％。
55.表1
56.试剂(ml)实施例1对照例1比较例1对照例2feso43333h2o23030水杨酸3333六君子发酵物1100蒸馏水0314测量次数3131
57.分别以对照例1及对照例2的吸光值做为实施例1及比较例1的空白(blank) 背景
值，以排除呈色反应以外的因素造成的吸光值的变化(如：六君子发酵物的吸光值)，从而获得标准化后的相对吸光值。接着，利用式(i)计算不同浓度的六君子发酵物的羟自由基清除百分率。
58.x％＝[1-(au/au0)]
×
100％
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
式(i)
[0059]
其中，x％表示羟自由基清除百分率，au表示实施例1的相对吸光值，au0表示比较例1的相对吸光值。
[0060]
图1是根据本发明一实施例的不同六君子发酵物的体积百分浓度的羟自由基清除百分率的折线图，其中横轴表示体积百分浓度，纵轴表示羟自由基清除百分率。如图1所示，10体积百分浓度(vol％)、20vol％及30vol％的六君子发酵物的羟自由基清除百分率别为16.15％、37.42％及50.03％，显示羟自由基清除百分率与六君子发酵物的体积百分浓度呈正相关，故可推算29.12vol％的六君子发酵物的羟自由基清除百分率为50％。由上述可知，六君子发酵物具有抗氧化的功效。
[0061]
实施例三、评估六君子发酵物的保湿能力
[0062]
利用经皮水分散失量(trans-epidermal water loss，tewl)做为皮肤表层含水量的指标，以评估六君子发酵物的保湿能力。
[0063]
首先，在受试者(3人)的手臂的皮肤设定对照区域及实验区域(各为3cm
×
3 cm)，并利用市售经皮水分散失测定仪tewameter tm300(制造商：德国courage khazaka electronic gmbh公司)检测对照区域及实验区域的皮肤的经皮水分散失量。
[0064]
接着，单次涂抹上述六君子发酵物(使用量：2.0
±
1.0mg/cm2)于实验区域的皮肤，但不对对照区域的皮肤进行任何处理。在2小时、4小时及8小时后再次测量经皮水分散失量，并将结果记录于图2。
[0065]
图2是绘示根据本发明一实施例的受试者皮肤施用六君子发酵物后在不同时间点的经皮水分散失量的折线图，其中横轴表示时间，纵轴表示经皮水分散失量，且折线201及折线203分别表示对照区域及实验区域。如图2所示，相较于未使用六君子发酵物的对照区域(折线201)，使用六君子发酵物的实验区域 (折线203)的经皮水分散失量较少，显示六君子发酵物可降低经皮水分散失量，因此六君子发酵物具有保湿的功效。
[0066]
实施例四、评估六君子发酵物的控油能力
[0067]
在受试者(3人)的额头的皮肤上设定实验区域及对照区域(3cm
×
3cm)，并利用市售的皮肤油脂测试仪(型号：sebumeter sm300；制造商：德国 courage khazaka electronic gmbh公司)测试油脂含量。接着单次涂抹六君子发酵物于受试者皮肤的实验区域(施予量：2.0
±
1.0mg/cm2)，但不对对照区域进行任何处理。在单次涂抹后第2小时、第4小时及第6小时再次测量受试者皮肤的油脂含量，并将结果记录于图3。
[0068]
图3是绘示根据本发明一实施例的受试者皮肤施用六君子发酵物后在不同时间点的皮肤的油脂含量的直条图，其中横轴表示时间，纵轴表示油脂含量，且直条301及直条303分别表示对照区域及实验区域。如图3所示，受试者未使用六君子发酵物的对照区域的皮肤的油脂含量随时间上升；反之，使用六君子发酵物的实验区域的皮肤的油脂含量随时间下降。详细而言，在第2小时，受试者的实验区域的皮肤的油脂含量(直条303)高于对照区域的皮肤的油脂含量(直条301)，但差异不大，所以可能是误差或实验区域的皮肤的油脂含量本来就比较高，但在第6小时，实验区域的皮肤的油脂含量(直条303)低于对照区域的皮肤的
油脂含量(直条301)，显示六君子发酵物具有控油的功效。
[0069]
实施例五、评估六君子发酵物的安全性
[0070]
利用密封式贴片试验(closed patch test)评估六君子发酵物的安全性。上述受试者是随机选择的18岁至60岁的人(共30人)。首先，利用无刺激性的胶带于每位受试者的背部固定2个斑试器达24小时，使斑试器的鳍状室(fin-chamber) 中的滤纸片贴附于受试者的背部皮肤上，期间不移除斑试器，也避免斑试器碰水，并以滤纸片含有0.20ml至0.25ml的六君子发酵物为实验组，以滤纸片含有0.20ml至0.25ml的蒸馏水为控制组。24小时后，取下斑试器，并分别于30分钟、24小时及48小时后观察斑试器下的皮肤(以下称为受试区域)及受试区域周围的皮肤是否出现红斑、浸润、水肿、丘疹及/或疱疹等症状。
[0071]
将结果记录于表2中，其中图号
“‑”
表示皮肤为阴性，
“±”
表示皮肤出现可疑反应(亦称为轻微红斑：具有轻微的红斑)，“ ”表示皮肤出现弱阳性反应(亦称为红斑反应：红斑、浸润、水肿及/或丘疹)，“ ”表示皮肤出现强阳性反应 (亦称为疱疹反应：红斑、浸润、水肿、丘疹、疱疹，且疱疹反应超出受试区域以外的皮肤)，“ ”表示皮肤出现极强阳性反应(亦称为融合性疱疹反应：明显红斑、严重浸润、水肿、融合性丘疹，且融合性疱疹反应超出受试区域以外的皮肤)。
[0072]
表2
[0073][0074]
如表2所示，在30分钟、24小时或48小时后，受试者(n＝30)在受试区域及其周围的皮肤皆无红斑、浸润、水肿、丘疹、疱疹及融合性疱疹等反应，表示六君子发酵物具有安全性。
[0075]
综言之，由上述数个实施例证实，本发明以六君子发酵物做为有效成分，经试验证实兼具抗氧化、保湿及控油的功效，且具安全性，可应用于中草药化妆品组成物。
[0076]
需补充的是，本发明虽以特定的菌株、特定的材料、特定的比例、特定的工艺、特定的分析方法或特定仪器做为例示，说明本发明的六君子发酵物具有抗氧化、保湿及控油的功效，惟本领域技术人员，本发明并不限于此，在不脱离本发明的精神和范围内，本发明的六君子发酵物亦可使用其他的菌株、其他的材料、其他的比例、其他的工艺、其他分析方法或其他仪器进行。
[0077]
由上述实施例可知，本发明的六君子发酵物的制造方法，其优点在于利用酵母菌对包含六君子的干粉与水的悬浮液进行发酵步骤，其中六君子是由人参、白术、茯苓、甘草、陈皮及生姜所组成，且六君子发酵物兼具抗氧化、保湿及控油的功效，因此可应用于分别或同时具有抗氧化、保湿及控油功效的中草药化妆品组成物。
[0078]
虽然本发明已以数个实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的权利要求书所界定者为准。
[0079]
【符号说明】
[0080]
201,203:折线
[0081]
301,303:直条
[0082]
【生物材料寄存】
[0083]
酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)c-lye-6是于2021年03月16日寄存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)(地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编号：100101)，且寄存编号为cgmcc no.22020。