一种硫酸氨基葡萄糖胶囊中含量的测定方法与流程

1.本发明属于药物分析技术领域，具体而言，本发明涉及一种利用hplc（高效液相色谱法）在线衍生方法测定硫酸氨基葡萄糖胶囊中含量的分析方法。


背景技术：

2.硫酸氨基葡萄糖，为天然的氨基单糖，是人体关节软骨基质中合成蛋白聚糖所必需的重要成分。氨基单糖可刺激软骨细胞产生具有正常多聚体结构的糖蛋白，抑制某些可损害关节软骨的酶（如胶原酶和磷脂酶a2），抑制损伤细胞的超氧化物自由基的产生，防止皮质激素及某些非甾体类抗炎药对软骨细胞的损害，减少损伤细胞的内毒素因子的释放。用于预防和治疗各种类型的骨性关节炎，如膝关节、髋关节、脊柱、肩、手、手腕和踝关节等部位的及全身性的骨性关节炎。通过上述作用，本药可直接抗炎，缓解骨性关节炎的疼痛症状，改善关节功能，并阻止骨性关节炎病程的发展。且不会出现因前列腺素受抑制而引起的不良反应。硫酸氨基葡萄糖胶囊的活性成分硫酸氨基葡萄糖是软骨基质聚多糖链和关节液聚氨基葡萄糖的正常构成成份，可以刺激软骨细胞合成生理性的聚氨基葡萄糖和蛋白聚糖，刺激滑膜细胞合成透明质酸。此外，还可以抑制损伤软骨的酶，如胶原酶和磷脂酶a2的活性。因此硫酸氨基葡萄糖显示出轻度的抗炎作用。但与非甾体抗炎药不同，硫酸氨基葡萄糖不抑制前列腺素的合成。安全性试验显示，硫酸氨基葡萄糖对心血管系统、呼吸系统、中枢神经系统或自主神经系统无作用。毒理学研究表明，硫酸氨基葡萄糖有非常大的剂量安全范围。
3.目前氨基葡萄糖含量的测定方法主要有以下三种：hplc直接进样法、uv衍生法、滴定法。
4.hplc直接进样法收载于usp40盐酸氨基葡萄糖含量项下，采用水作为溶剂，操作简便，但该方法使用氨基柱存在色谱柱不耐用的情况，多批次检测后，色谱柱填料流失严重，性能明显降低，导致峰形异常，无法准确积分。
5.uv衍生法取供试品溶液/对照品溶液5ml 乙酰丙酮溶液2.0ml，摇匀，沸水浴20min，冰水迅速冷却，依次精密加入无水乙醇10ml、对二氨基苯甲醛溶液2.0ml，摇匀，65℃~70℃水浴10min，立即用冷水冷却至室温，530nm测定吸光度。该方法可用于氨基葡萄糖含量测定，但操作繁琐，重复性差。
6.滴定法采用氢氧化钠滴定液进行，该方法可用于盐酸氨基葡萄糖原料含量测定，但硫酸氨基葡萄糖胶囊中其他组分，可能会消耗氢氧化钠滴定液导致氨基葡萄糖测定含量不准确。
7.申请人发现，采用如下色谱条件：采用十八烷基硅烷键合硅胶柱；以醋酸盐缓冲溶液（ph值为4.0~6.5）-乙腈（70：30~85：15）为流动相；柱温20℃~45℃；流速1.2ml/min~1.6ml/min。检测波长为344nm。采用如下hplc在线衍生方法，精密吸取衍生化试剂（取对氨基苯甲醛50mg，加无水甲醇2.5ml使溶解，加入乙酰丙酮50μl和0.2mol/l硼酸盐缓冲液12.5ml，混匀）2μl~10μl，供试品溶液2μl~10μl，混合5~20次，精密吸取0.2mol/l硼酸盐缓冲
液（取硼砂7.63g，加水约80ml，缓慢加热使溶解，室温放置冷却至微温，用10%氢氧化钠溶液迅速调节ph值至9.5，加水稀释至100ml）20μl~80μl，混合5~20次，衍生1~10min后，注入液相色谱仪。该检测方法操作方便，可有效控制产品质量。


技术实现要素：

8.本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提供一种操作简便、快速分析硫酸氨基葡萄糖胶囊中氨基葡萄糖含量的高效液相色谱法。
9.本发明的目的在于提供一种hplc在线衍生法测定硫酸氨基葡萄糖胶囊中氨基葡萄糖含量分析方法，操作简单，精密度高，稳定性好，重现性好。
10.本发明优选十八烷基硅烷基键合胶为固定相的色谱柱。
11.本发明的醋酸盐缓冲液，优选醋酸钠缓冲液。用乙酸调节缓冲液ph值范围为4.0~6.5。
12.本发明的流动相为醋酸盐缓冲液与有机溶剂的等度洗脱，缓冲液所占体积比在70%~85%这一范围值内，对应调节有机溶剂体积比为15%~30%。
13.本发明的检测条件：柱温20℃～45℃；流速为1.2～1.6ml/min，优选为1.5ml/min；检测波长为330nm～344nm，优选为344nm；样品溶液为2μl~10μl 2μl~10μl 20μl~80μl。
14.本发明所述的在线衍生方法，可以依照以下方法实现。
15.（1）0.2mol/l硼酸盐缓冲液：取硼砂7.63g，加水约80ml，缓慢加热使溶解，室温放置冷却至微温，用10%氢氧化钠溶液迅速调节ph值至9.5，加水稀释至100ml。
16.（2）衍生化试剂的制备过程：取对氨基苯甲醛50mg，加无水甲醇2.5ml使溶解，加入乙酰丙酮50μl和0.2mol/l硼酸盐缓冲液12.5ml。混匀，使用前将该溶液在暗处静置30分钟。
17.（3）样品配制：称取盐酸氨基葡萄糖对照品约25mg，精密称定，置100ml量瓶中，加水溶解稀释至刻度，摇匀。称取硫酸氨基葡萄糖胶囊内容物适量（相当于硫酸氨基葡萄糖250mg），精密称定，置100ml量瓶中，加水适量振摇30分钟使溶解，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。
18.设置流动相流速为1.2ml/min～1.6ml/min，优选为1.5ml/min；色谱柱温20℃～45℃。检测波长为330nm～344nm，优选为344nm。
19.取（2）的衍生化试剂2μl~10μl，（3）的供试品溶液2μl~10μl，混合5~20次，精密吸取（1）的0.2mol/l硼酸盐缓冲液20μl~80μl，混和5~20次，衍生1~10min后，注入液相色谱仪。优选为：取衍生化试剂5μl，供试品溶液5μl，混合10次，精密吸取0.2mol/l硼酸盐缓冲液40μl，混和10次，衍生1~10min后，注入液相色谱仪。
20.设置衍生时间为1~10min。注入高效液相色谱仪，完成硫酸氨基葡萄糖胶囊中氨基葡萄糖含量的测定。
附图说明
21.图1：按照实施例1条件硫酸氨基葡萄糖胶囊供试品含量的高效液相色谱图。
22.图2：按照实施例2条件硫酸氨基葡萄糖胶囊供试品含量的高效液相色谱图。
23.图3：按照实施例3条件硫酸氨基葡萄糖胶囊供试品含量的高效液相色谱图。
24.图4：按照实施例4条件硫酸氨基葡萄糖胶囊供试品含量的高效液相色谱图。
25.图5：按照实施例5条件硫酸氨基葡萄糖胶囊供试品含量的高效液相色谱图。
26.图6：按照实施例6条件硫酸氨基葡萄糖胶囊供试品含量的高效液相色谱图。
27.图7：按照实施例7条件硫酸氨基葡萄糖胶囊供试品含量的高效液相色谱图。
28.图8：按照实施例8条件硫酸氨基葡萄糖胶囊供试品含量的高效液相色谱图。
29.图9：按照实施例9条件硫酸氨基葡萄糖胶囊供试品含量的高效液相色谱图。
具体实施方式
30.提供以下实施例以进一步举例说明本发明及其实施方式。在实施例中给出的具体详细内容仅是出于举例说明的目的，而不是应将其解释为限制本发明。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
31.实施例1仪器：agilent 1260高效液相色谱仪色谱柱：waters sunfire c18(150
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4.6mm，5μm)流动相：0.1mol/l醋酸钠缓冲液（用乙酸调节ph值至5.0）-乙腈=75-25流速：1.5ml/min检测波长：344nm柱温：30℃进样体积：衍生剂5μl 供试品5μl 硼酸盐缓冲液40μl衍生反应时间：5min稀释剂：水样品配制：称取盐酸氨基葡萄糖对照品约25mg，精密称定，置100ml量瓶中，加水溶解稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。称取硫酸氨基葡萄糖胶囊内容物适量（相当于硫酸氨基葡萄糖250mg），精密称定，置100ml量瓶中，加水适量振摇30分钟使溶解，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，供试品溶液平行配制六份结果统计：平行六份供试品含量依次为99.9%、100.3%、101.1%、101.2%、100.5%、100.1%，含量均值为100.5%，相对标准偏差值为0.5%＜2.0%。
32.结果表明含量方法重复性良好。
33.实施例2仪器：agilent 1260高效液相色谱仪色谱柱：agilent zorbax sb c18 (150
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4.6mm，5μm)流动相：0.1mol/l醋酸钠缓冲液（用乙酸调节ph值至5.0）-乙腈=75-25流速：1.5ml/min检测波长：344nm柱温：30℃进样体积：衍生剂5μl 供试品5μl 硼酸盐缓冲液40μl衍生反应时间：5min
稀释剂：水运行时间：11分钟样品配制：称取盐酸氨基葡萄糖对照品约25mg，精密称定，置100ml量瓶中，加水溶解稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。称取硫酸氨基葡萄糖胶囊内容物适量（相当于硫酸氨基葡萄糖250mg），精密称定，置100ml量瓶中，加水适量振摇30分钟使溶解，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，供试品溶液平行配制2份结果统计：含量均值为100.8%，与实施例1条件下含量均值100.5%绝对差值为0.3%＜2.0%；结果表明色谱柱变更为agilent zorbax sb c18 (150
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4.6mm，5μm)含量方法耐用性良好。
34.实施例3仪器：agilent 1260高效液相色谱仪色谱柱：waters sunfire c18(150
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4.6mm，5μm)流动相：0.1mol/l醋酸钠缓冲液（用乙酸调节ph值至4.0）-乙腈=75-25流速：1.5ml/min检测波长：344nm柱温：30℃进样体积：衍生剂5μl 供试品5μl 硼酸盐缓冲液40μl衍生反应时间：5min稀释剂：水运行时间：11分钟样品配制：称取盐酸氨基葡萄糖对照品约25mg，精密称定，置100ml量瓶中，加水溶解稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。称取硫酸氨基葡萄糖胶囊内容物适量（相当于硫酸氨基葡萄糖250mg），精密称定，置100ml量瓶中，加水适量振摇30分钟使溶解，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，供试品溶液平行配制2份结果统计：含量均值为100.0%，与实施例1条件下含量均值100.5%绝对差值为0.5%＜2.0%；结果表明流动相醋酸钠缓冲液ph调整为4.0含量方法耐用性良好。
35.实施例4仪器：agilent 1260高效液相色谱仪色谱柱：waters sunfire c18(150
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4.6mm，5μm)流动相：0.1mol/l醋酸钠缓冲液（用乙酸调节ph值至6.5）-乙腈=75-25流速：1.5ml/min检测波长：344nm柱温：30℃进样体积：衍生剂5μl 供试品5μl 硼酸盐缓冲液40μl衍生反应时间：5min稀释剂：水运行时间：11分钟
样品配制：称取盐酸氨基葡萄糖对照品约25mg，精密称定，置100ml量瓶中，加水溶解稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。称取硫酸氨基葡萄糖胶囊内容物适量（相当于硫酸氨基葡萄糖250mg），精密称定，置100ml量瓶中，加水适量振摇30分钟使溶解，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，供试品溶液平行配制2份；结果统计：含量均值为99.8%，与实施例1条件下含量均值100.5%绝对差值为0.7%＜2.0%；结果表明流动相醋酸钠缓冲液ph调整为6.5含量方法耐用性良好。
36.实施例5仪器：agilent 1260高效液相色谱仪色谱柱：waters sunfire c18(150
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4.6mm，5μm)流动相：0.1mol/l醋酸钠缓冲液（用乙酸调节ph值至5.0）-乙腈=70-30流速：1.5ml/min检测波长：344nm柱温：30℃进样体积：衍生剂5μl 供试品5μl 硼酸盐缓冲液40μl衍生反应时间：5min稀释剂：水运行时间：11分钟样品配制：称取盐酸氨基葡萄糖对照品约25mg，精密称定，置100ml量瓶中，加水溶解稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。称取硫酸氨基葡萄糖胶囊内容物适量（相当于硫酸氨基葡萄糖250mg），精密称定，置100ml量瓶中，加水适量振摇30分钟使溶解，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，供试品溶液平行配制2份结果统计：含量均值为100.7%，与实施例1条件下含量均值100.5%绝对差值为0.2%＜2.0%；结果表明流动相醋酸钠缓冲液-乙腈比例调整为70-30含量方法耐用性良好。
37.实施例6仪器：agilent 1260高效液相色谱仪色谱柱：waters sunfire c18(150
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4.6mm，5μm)流动相：0.1mol/l醋酸钠缓冲液（用乙酸调节ph值至5.0）-乙腈=85-15流速：1.5ml/min检测波长：344nm柱温：30℃进样体积：衍生剂5μl 供试品5μl 硼酸盐缓冲液40μl衍生反应时间：5min稀释剂：水运行时间：11分钟样品配制：称取盐酸氨基葡萄糖对照品约25mg，精密称定，置100ml量瓶中，加水溶
解稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。称取硫酸氨基葡萄糖胶囊内容物适量（相当于硫酸氨基葡萄糖250mg），精密称定，置100ml量瓶中，加水适量振摇30分钟使溶解，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，供试品溶液平行配制2份结果统计：含量均值为100.2%，与实施例1条件下含量均值100.5%绝对差值为0.3%＜2.0%；结果表明流动相醋酸钠缓冲液-乙腈比例调整为85-15含量方法耐用性良好。
38.实施例7仪器：agilent 1260高效液相色谱仪色谱柱： waters sunfire c18(150
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4.6mm，5μm)流动相：0.1mol/l醋酸钠缓冲液（用乙酸调节ph值至5.0）-乙腈=75-25流速：1.2ml/min检测波长：344nm柱温：30℃进样体积：衍生剂5μl 供试品5μl 硼酸盐缓冲液40μl衍生反应时间：5min稀释剂：水运行时间：11分钟样品配制：称取盐酸氨基葡萄糖对照品约25mg，精密称定，置100ml量瓶中，加水溶解稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。称取硫酸氨基葡萄糖胶囊内容物适量（相当于硫酸氨基葡萄糖250mg），精密称定，置100ml量瓶中，加水适量振摇30分钟使溶解，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，供试品溶液平行配制2份结果统计：含量均值为101.4%，与实施例1条件下含量均值100.5%绝对差值为0.9%＜2.0%；结果表明流速变更为1.2ml/min含量方法耐用性良好，但运行时间需延长。
39.实施例8仪器：agilent 1260高效液相色谱仪色谱柱： waters sunfire c18(150
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4.6mm，5μm)流动相：0.1mol/l醋酸钠缓冲液（用乙酸调节ph值至5.0）-乙腈=75-25流速：1.6ml/min检测波长：344nm柱温：30℃进样体积：衍生剂5μl 供试品5μl 硼酸盐缓冲液40μl衍生反应时间：5min稀释剂：水运行时间：11分钟样品配制：称取盐酸氨基葡萄糖对照品约25mg，精密称定，置100ml量瓶中，加水溶解稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。称取硫酸氨基葡萄糖胶囊内容物适量（相当于硫酸
氨基葡萄糖250mg），精密称定，置100ml量瓶中，加水适量振摇30分钟使溶解，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，供试品溶液平行配制2份结果统计：含量均值为98.7%，与实施例1条件下含量均值100.5%，绝对差为1.7%＜2.0%。
[0040] 实施例9仪器：agilent 1260高效液相色谱仪色谱柱： waters sunfire c18(150
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4.6mm，5μm)流动相：0.1mol/l醋酸钠缓冲液（用乙酸调节ph值至5.0）-乙腈=75-25流速：1.5ml/min检测波长：344nm柱温：20℃进样体积：衍生剂5μl 供试品5μl 硼酸盐缓冲液40μl衍生反应时间：5min稀释剂：水运行时间：11分钟样品配制：称取盐酸氨基葡萄糖对照品约25mg，精密称定，置100ml量瓶中，加水溶解稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。称取硫酸氨基葡萄糖胶囊内容物适量（相当于硫酸氨基葡萄糖250mg），精密称定，置100ml量瓶中，加水适量振摇30分钟使溶解，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，供试品溶液平行配制2份结果统计：含量均值为101.1%，与实施例1条件下含量均值100.5%绝对差值为0.6%＜2.0%；结果表明柱温变更为20℃含量方法耐用性良好，但运行时间需延长。