新颖的转导增强剂及其用途

新颖的转导增强剂及其用途
1.本发明涉及一种用于转导靶细胞的方法，所述方法包括使所述靶细胞与逆转录病毒载体和能够增强转导效率的化合物或此类化合物的组合接触的步骤，其中所述靶细胞是在使所述靶细胞与所述逆转录病毒载体接触之前和/或期间通过与所述转导增强化合物或转导增强化合物的组合一起预孵育和/或共孵育来预刺激和/或共刺激的。


背景技术：

2.在基因添加基因疗法中，使用病毒来源的载体将cdna形式的校正基因(称为转基因)导入携带导致疾病的遗传功能丧失或功能限制突变的细胞中。这种导入的突变基因的cdna拷贝由缺陷基因的健康(非突变)序列组成。在经处理的细胞中，导入的转基因的活性补偿了缺陷基因的缺失活性。
3.对于起源于造血系统中的疾病(即红血细胞疾病、血小板疾病和免疫系统疾病)的基因疗法，以及对于皮肤疾病，从经基因添加的表皮/角质形成细胞干细胞、逆转录病毒载体产生皮肤移植物是现有最先进技术。这些载体用于治疗造血干细胞(haematopoietic stem cell,hsc)或表皮干细胞(epidermal stem cell,esc)。将逆转录病毒载体稳定地整合到受体hsc或esc基因组中以添加校正cdna(即转基因)的过程被称为转导。在将经处理的hsc静脉内回输到患者体内后，这些hsc移植到骨髓中，其中在hsc增殖和随后分化为不同的血液和免疫系统细胞时，所添加的校正cdna被传递给所有子细胞。对应地，在移植由转基因esc产生的皮肤移植物后，转基因皮肤得以维持。
4.现今，主要使用以水疱性口炎(vesicular stomatitis,vsv-g)包膜假型化的自灭活慢病毒(基于hiv的)载体将基因添加到hsc中(cartier等人(2009)science,pmid:19892975；cavazzana-calvo等人(2010)nature 467:318-22；aiuti等人(2013)science 341:1233151)。
5.基因疗法中的临床成功主要取决于基因添加的效率，即由逆转录病毒载体介导的转基因插入的水平，并且取决于可以施用于患者的经校正细胞的剂量。对于每细胞的基因添加效率取决于转导过程期间所使用的病毒载体相对于靶细胞的过量倍数，称为感染复数(multiplicity of infection,moi)。成功基因添加的结果可以通过确定细胞群中每细胞的整合的载体拷贝的平均数来量化，所述平均数被称为载体拷贝数(vector copy number,vcn)。后者直接取决于逆转录病毒转导过程的品质，即当可以达到最佳逆转录病毒转导条件时，vcn较高。例如，vcn＝0.5表明，平均而言，转导细胞群中的每隔一个细胞获得一个治疗基因拷贝。vcn＝2对应于转导细胞群中每细胞平均2个治疗基因拷贝。
6.逆转录病毒转导过程包括以下一系列事件：使治疗性病毒来源的粒子与细胞培养物中(离体)的细胞接触；使病毒粒子结合至靶细胞的细胞表面；将治疗性逆转录病毒rna导入靶细胞；将逆转录病毒rna逆转录为包含治疗性cdna序列的前病毒双链dna；以及成功整合到靶细胞的基因组中。离体逆转录病毒转导期间的细胞培养条件对于转导效率至关重要。转导期间的最佳细胞培养条件应1)维持细胞特性(例如hsc的干性)，2)保存细胞(例如hsc)在重新输注到患者体内后移植到例如骨髓中的能力，以及3)允许高效转导(即导致高
水平的基因添加)。
7.过去已经提出了不同的方法来增强逆转录病毒转导，聚焦于(1)改善逆转录病毒载体与靶细胞的接触，以及(2)逆转录病毒进入靶细胞。
8.因此，需要用于通过基因疗法载体，特别是编码感兴趣的治疗性转基因的慢病毒载体来提高人类细胞的转导效率的新颖化合物和新颖方法。
9.特别地，需要导致增加的转导效率的化合物或化合物的组合。
10.此外，本领域中需要增加基因疗法载体的转导效率的临床上安全的化合物。
11.本发明提供了此类新颖的化合物和方法。


技术实现要素：

12.本发明的特征在于本文所提供的实施方式和权利要求书。
13.特别地，本发明尤其涉及以下实施方式：
14.1.一种用于转导靶细胞的方法，所述方法包括使所述靶细胞与逆转录病毒载体和能够增强转导效率的化合物或此类化合物的组合接触的步骤，其中所述靶细胞是在使所述靶细胞与所述逆转录病毒载体接触之前和/或期间通过与所述转导增强化合物或转导增强化合物的组合一起预孵育和/或共孵育来预刺激和/或共刺激的。
15.2.根据实施方式1所述的方法，其中所述预孵育时段为0.5小时至10小时，特别地1小时至5小时，特别是2小时。
16.3.根据实施方式1或实施方式2所述的方法，其中所述转导增强化合物选自由以下项组成的组：水飞蓟宾、米哚妥林、两性霉素b、制霉菌素和纳他霉素(natamycin)，或它们的组合。
17.4.根据实施方式1或实施方式2所述的方法，其中所述转导增强化合物选自由以下项组成的组：白藜芦醇、依维莫司和前列腺素e2，或它们的组合。
18.5.根据实施方式3所述的方法，其中所述转导增强化合物的终浓度介于约0.05μm与500μm之间，特别地对于水飞蓟宾、米哚妥林、两性霉素b和纳他霉素来说介于0.1μm与10μm之间，并且对于制霉菌素来说介于50μm与150μm之间。
19.6.根据实施方式1或实施方式2所述的方法，其中所述转导增强化合物是基于泊洛沙姆的聚合物，优选泊洛沙姆synperonic f108，或分子量介于11k da与15kda之间的泊洛沙姆407。
20.7.根据实施方式5所述的方法，其中所述转导增强化合物的终浓度介于约50μg/ml与5,000μg/ml之间。
21.8.根据实施方式1或实施方式2所述的方法，其中所述转导增强化合物是脱氧核糖核苷的混合物，所述脱氧核糖核苷包括2'-脱氧胸苷、2'-脱氧腺苷、2'-脱氧鸟苷和2'-脱氧胞苷。
22.9.根据实施方式8所述的方法，其中每种脱氧核苷的终浓度是介于每种脱氧核苷约0.1mm与10mm之间。
23.10.根据实施方式1或实施方式2所述的方法，其中所述转导增强化合物是选自由以下项组成的组的聚合物：peg-pcl-peg聚合物、peg-plga-peg聚合物和peg-pla-peg聚合物。
24.11.根据实施方式10所述的方法，其中所述转导增强化合物的终浓度介于约20μg/ml与5,000μg/ml之间。
25.12.根据实施方式10或实施方式11所述的方法，其中使用转导增强化合物的组合，所述转导增强化合物包括选自由以下项组成的组的聚合物：peg-pcl-peg聚合物、peg-plga-peg聚合物和peg-pla-peg聚合物和水飞蓟宾，特别是终浓度介于约0.1μm与25μm之间的水飞蓟宾和介于约20μg/ml与5,000μg/ml之间的所述聚合物。
26.13.根据实施方式10或实施方式11所述的方法，其中使用转导增强化合物的组合，所述转导增强化合物包括选自由以下项组成的组的聚合物：peg-pcl-peg聚合物、peg-plga-peg聚合物和peg-pla-peg聚合物和米哚妥林，特别是终浓度介于约0.05μm与20μm之间的米哚妥林和介于约20μg/ml与5000μg/ml之间的所述聚合物。
27.14.根据实施方式10或实施方式11所述的方法，其中使用转导增强化合物的组合，所述转导增强化合物包括选自由以下项组成的组的聚合物：peg-pcl-peg聚合物、peg-plga-peg聚合物和peg-pla-peg聚合物和两性霉素b，特别是终浓度介于约0.1μm与20μm之间的两性霉素b和介于约20μg/ml与5,000μg/ml之间的所述聚合物。
28.15.根据实施方式10或实施方式11所述的方法，其中使用转导增强化合物的组合，所述转导增强化合物包括选自由以下项组成的组的聚合物：peg-pcl-peg聚合物、peg-plga-peg聚合物和peg-pla-peg聚合物和制霉菌素，特别是终浓度介于约5μm与500mm之间的制霉菌素和介于约20μg/ml与5,000μg/ml之间的所述聚合物。
29.16.根据实施方式10或实施方式11所述的方法，其中使用转导增强化合物的组合，所述转导增强化合物包括选自由以下项组成的组的聚合物：peg-pcl-peg聚合物、peg-plga-peg聚合物和peg-pla-peg聚合物和纳他霉素，特别是终浓度介于约0.1μm与20μm之间的纳他霉素和介于约20μg/ml与5,000μg/ml之间的所述聚合物。
30.17.根据实施方式9、实施方式10或实施方式11所述的方法，其中使用转导增强化合物的组合，所述转导增强化合物包括选自由以下项组成的组的聚合物：peg-pcl-peg聚合物、peg-plga-peg聚合物和peg-pla-peg聚合物以及脱氧核糖核苷的混合物，所述脱氧核糖核苷包括2'-脱氧胸苷、2'-脱氧腺苷、2'-脱氧鸟苷和2'-脱氧胞苷，特别是终浓度介于约0.1mm与10mm之间的每种脱氧核糖核苷和介于约20μg/ml与5000μg/ml之间的所述聚合物。
31.18.根据实施方式10至17中任一项所述的方法，其中所述聚合物是官能化聚合物，其中所述聚合物的一个或两个端部共价连接至阳离子基团，所述阳离子基团选自由以下项组成的组：氨基、赖氨酸、精氨酸和组氨酸。
32.19.根据实施方式18所述的方法，其中由赖氨酸、精氨酸和/或组氨酸组成的阳离子基团作为单体或作为聚合物存在。
33.20.根据实施方式1至19中任一项所述的方法，其中所述靶细胞是选自由以下项组成的组的细胞：淋巴细胞、肿瘤细胞、淋巴谱系细胞、神经元细胞、上皮细胞、内皮细胞、原代细胞、t细胞、造血细胞和干细胞。
34.21.根据实施方式20所述的方法，其中所述靶细胞是人类来源的造血细胞。
35.22.根据实施方式20或实施方式21所述的方法，其中所述靶细胞是造血干细胞。
36.23.根据实施方式20或实施方式21所述的方法，其中所述靶细胞是cd34 细胞或富含cd34 细胞的细胞群。
37.24.根据实施方式20所述的方法，其中所述靶细胞是t细胞。
38.25.根据实施方式24所述的方法，其中所述靶细胞是由cd3、cd4和/或cd8的表面呈递限定的t细胞。
39.26.根据实施方式1-7、10-16以及18和19中任一项所述的方法，其中所述靶细胞是单核细胞、巨噬细胞、组织驻留巨噬细胞或小胶质细胞、小胶质样细胞或树突状细胞的富集群体。
40.27.根据实施方式1至26中任一项所述的方法，其中所述逆转录病毒载体是慢病毒载体。
41.28.根据实施方式27所述的方法，其中所述慢病毒载体是自灭活慢病毒载体。
42.29.根据实施方式1至28中任一项所述的方法，其中所述载体包含在mir223启动子控制下的转基因。
43.30.根据实施方式1至29中任一项所述的方法，其中所述载体包含全部或部分编码p47phox、gp91phox、p22phox、p67phox或p40phox蛋白的cdna。
44.31.一种用于转导靶细胞的方法，所述方法包括使所述靶细胞与逆转录病毒载体和能够增强转导效率的化合物或此类化合物的组合接触的步骤，其中所述靶细胞是通过在使所述靶细胞与所述逆转录病毒载体接触之前与所述转导增强化合物或转导增强化合物的组合一起预孵育来预刺激的。
45.32.一种用于转导靶细胞的方法，所述方法包括使靶细胞与逆转录病毒载体和能够增强转导效率的化合物或此类化合物的组合接触的步骤，其中所述靶细胞是通过在使所述靶细胞与所述逆转录病毒载体接触时和期间与所述转导增强化合物或转导增强化合物的组合一起共孵育来共刺激的。
46.33.根据实施方式31和实施方式32所述的用于转导靶细胞的方法，其中所述转导增强化合物选自由以下项组成的组：水飞蓟宾、米哚妥林、两性霉素b、制霉菌素、纳他霉素或它们的组合。
47.34.根据实施方式31或实施方式32所述的用于转导靶细胞的方法，其中所述转导增强化合物选自由以下项组成的组：白藜芦醇、依维莫司和前列腺素e2或它们的组合。
48.35.根据实施方式31或实施方式32所述的用于转导靶细胞的方法，其中所述转导增强化合物是基于泊洛沙姆的聚合物，优选泊洛沙姆synperonic f108，或分子量介于11k da与15kda之间的泊洛沙姆407。
49.36.根据实施方式31或实施方式32所述的用于转导靶细胞的方法，其中所述转导增强化合物是脱氧核糖核苷的混合物，所述脱氧核糖核苷包括2'-脱氧胸苷、2'-脱氧腺苷、2'-脱氧鸟苷和2'-脱氧胞苷。
50.37.根据实施方式31或实施方式32所述的用于转导靶细胞的方法，其中所述转导增强化合物是选自由以下项组成的组的聚合物peg-pcl-peg聚合物、peg-plga-peg聚合物和peg-pla-peg聚合物。
51.38.根据实施方式37所述的方法，其中使用转导增强化合物的组合，所述转导增强化合物包括选自由以下项组成的组的聚合物：peg-pcl-peg聚合物、peg-plga-peg聚合物和peg-pla-peg聚合物；以及
52.(i)水飞蓟宾，特别地终浓度介于约0.1μm与25μm之间；或者
53.(ii)米哚妥林，特别地终浓度介于约0.05μm与20μm之间；或者
54.(iii)两性霉素b，特别地终浓度介于0.1μm与20μm之间；或者者
55.(iv)制霉菌素，特别地终浓度介于约5μm与5mm之间；或者
56.(v)纳他霉素，特别地终浓度介于约0.1μm与20μm之间，或者
57.(vi)脱氧核糖核苷的混合物，所述脱氧核糖核苷包括2'-脱氧胸苷、2'-脱氧腺苷、2'-脱氧鸟苷和2'-脱氧胞苷，特别地每种脱氧核苷的终浓度介于约0.1mm与10mm之间。
58.39.根据实施方式31或实施方式32所述的用于转导靶细胞的方法，其中所述转导增强化合物是依维莫司和两性霉素b的混合物。
59.40.根据实施方式39所述的方法，其中两性霉素b以介于约0.1μm与20μm之间的终浓度存在，并且依维莫司以介于约0.1μm与20μm之间的终浓度存在。
60.41.根据实施方式31所述的方法，其中所述预孵育时段介于0.5小时与10小时之间，特别地介于1小时与5小时之间，特别是2小时。
61.42.根据实施方式32所述的方法，其中所述共孵育时段介于8小时与48小时之间，特别地介于10小时与24小时之间，但特别是12小时。
62.43.一种治疗疾病或疾患的方法，所述方法包括将逆转录病毒治疗载体离体或体内转导到造血干细胞和/或富集的cd34阳性骨髓细胞群中，其中所述转导是用根据实施方式1至41中的任一项所述的方法进行的。
63.除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。虽然与本文所述的那些相似或等同的任何方法和材料均可用于实践或检验本发明，但是本文描述了组合物、方法和材料的优选实施方式。出于本发明的目的，以下术语定义如下。
[0064]“一(a/an)”、和“所述(the)”在本文中用于指代该冠词的语法对象中的一个或多于一个(即，至少一个、或一个或多个)语法对象。
[0065]“或”应被理解为表示替代方案中的一者、两者或它们的任意组合。
[0066]“和/或”应被理解为表示所述替代方案中的一种或两种替代方案。
[0067]
在整个说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括”、“包含”和“含有”将被理解为暗示包含所陈述的步骤或元件或步骤或元件组，但不排除任何其他步骤或元件或步骤或元件组。
[0068]
术语“包括”和“包含”同义地使用。“优选地”是指一系列选项中的一个选项，不排除其他选项。“例如”是指一个示例，不限于所提及的示例。“由
……
组成”是指包括并限于短语“由
……
组成”之后的任何内容。
[0069]
在整个说明书中提及“一个实施方式”、“一实施方式”、“具体实施方式”、“相关实施方式”、“某个实施方式”、“附加实施方式”、“特定实施方式”或“进一步实施方式”或它们的组合意味着结合所述实施方式描述的特定特征、结构或特性被包括在本发明的至少一个实施方式中。因此，贯穿本说明书的各个地方出现的前述短语不一定都指同一实施方式。此外，特定特征、结构或特性可以在一个或多个实施方式中以任何合适的方式组合。还应理解的是，在一个实施方式中对特征的肯定叙述用作排除具体实施方式中的特征的基础。
[0070]
本发明提供了一种用于转导靶细胞的方法，所述方法包括使所述靶细胞与逆转录病毒载体和能够增强转导效率的化合物或此类化合物的组合接触的步骤，其中所述靶细胞
是在使所述靶细胞与所述逆转录病毒载体接触之前和/或期间通过与所述转导增强化合物或转导增强化合物的组合一起预孵育和/或共孵育来预刺激和/或共刺激的。
[0071]
根据本发明的方法可以在体内或离体执行。在某些实施方式中，该方法是离体执行的。
[0072]
即，本发明至少部分地基于以下发现：通过将靶细胞与转导增强化合物或转导增强化合物的混合物一起孵育，可以提高用逆转录病毒载体转导靶细胞的效率。为此，可以用本文所公开的转导增强剂或转导增强剂的组合对靶细胞进行预刺激和/或共刺激。
[0073]
术语“转导增强剂”是指在转导期间存在时与不存在相比导致vcn增加的任何化合物。
[0074]
在某些实施方式中，在转导步骤期间用转导增强剂或转导增强剂的组合对靶细胞进行共刺激。在本发明内，如果靶细胞在转导增强剂或转导增强剂的组合的存在下孵育，与此同时使所述靶细胞与逆转录病毒载体接触，则所述靶细胞被称为用转导增强剂或转导增强剂的组合进行共刺激。
[0075]
优选地，在共刺激步骤期间，使靶细胞、逆转录病毒载体和转导增强剂或转导增强剂的组合在液体培养基中，更优选在液体细胞培养基中在共孵育步骤中接触。
[0076]
靶细胞可以与病毒载体和转导增强剂或转导增强剂的组合一起共孵育达任何时间量。然而，优选的是将靶细胞与病毒载体和转导增强剂或转导增强剂的组合一起共孵育达介于约8小时与约48小时之间，特别地介于约10小时与约24小时之间，但特别是约12小时的时段。
[0077]
优选地，用转导增强剂或转导增强剂的组合对靶细胞进行共刺激导致所述靶细胞对逆转录病毒载体的敏感性增加。
[0078]
在某些实施方式中，可以在转导步骤之前将靶细胞与转导增强剂或转导增强剂的组合一起预孵育。在本发明内，如果在靶细胞与逆转录病毒载体接触之前，将所述靶细胞与转导增强剂或转导增强剂的组合一起孵育，则所述靶细胞被称为用转导增强剂或转导增强剂的组合预刺激。
[0079]
优选地，在预刺激步骤期间，使靶细胞和转导增强剂或转导增强剂的组合在液体培养基中，更优选在液体细胞培养基中在孵育步骤期间接触。
[0080]
可以将靶细胞与转导增强剂或转导增强剂的组合一起预孵育达任何时间量。然而，优选的是将靶细胞与转导增强剂或转导增强剂的组合一起预孵育达介于约0.5小时与约10小时之间，特别是约1小时与约5小时之间，但特别是约2小时的时段。
[0081]
优选地，用转导增强剂或转导增强剂的组合对靶细胞进行预刺激导致在随后的转导步骤中所述靶细胞对逆转录病毒载体的敏感性增加。
[0082]
在某些实施方式中，用转导增强剂或转导增强剂的组合对靶细胞进行预刺激和共刺激。也就是说，靶细胞可以首先与转导增强剂或转导增强剂的组合一起预孵育，随后与逆转录病毒载体和转导增强剂或转导增强剂的组合一起共孵育。
[0083]
必须注意的是，转导增强剂或转导增强剂的组合在预刺激与共刺激步骤之间可能相同或不同。
[0084]
也就是说，在某些实施方式中，可以用相同的转导增强剂或相同的转导增强剂的组合对靶细胞进行预刺激和共刺激。例如，可以首先在包含转导增强剂或转导增强剂的组
合的液体培养基中对靶细胞进行预刺激达限定的时间量。为了开始共刺激步骤，可以将逆转录病毒载体添加到包含靶细胞和转导增强剂或转导增强剂的组合的液体培养基中。或者，可以在限定的时间量后从预刺激培养基中分离出靶细胞，并且可以将所述靶细胞转移到包含相同转导增强剂或相同转导增强剂的组合和任选的逆转录病毒载体的新鲜共刺激培养基中。也就是说，当靶细胞重悬于共孵育培养基中时，所述共孵育培养基可能已经包含逆转录病毒载体，或者可以在靶细胞已经重悬于新鲜共孵育培养基中之后添加逆转录病毒载体。转导增强剂或转导增强剂的组合的浓度和/或比率在预刺激培养基与共刺激培养基之间可以不同或可以相同。
[0085]
在某些实施方式中，靶细胞可以在预刺激步骤中与第一转导增强剂或第一转导增强剂组合接触，然后可以在共刺激步骤中与第二转导增强剂或第二转导增强剂组合接触。为此，优选的是将靶细胞在包含第一转导增强剂或第一转导增强剂组合的培养基中预孵育，然后可以从预刺激培养基中分离出并转移到包含第二转导增强剂或第二转导增强剂组合和任选的逆转录病毒载体的共刺激培养基中。
[0086]
应当理解的是，预刺激步骤之后不一定直接跟着共刺激步骤。也就是说，细胞可以在预刺激步骤与共刺激步骤之间在没有转导增强剂的培养基中孵育。
[0087]
可以如本领域已知的那样确定转导实验的效率。优选地，转导效率可以通过在转导实验后确定单个细胞中的载体拷贝数(vector copy number,vcn)或通过在转导实验后测量细胞群中的平均vcn来测量。“载体拷贝数”或“vcn”是指细胞基因组中载体或其部分的拷贝数。平均vcn可以从细胞群或单个细胞集落中确定。用于确定vcn的例示性方法包括任何形式的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,pcr)，诸如qpcr或数字液滴pcr，以及流式细胞术。例如，vcn可以根据charrier等人，quantification of lentiviral vector copy numbers in individual hematopoietic colony-forming cells shows vector dose-dependent effects on the frequency and level of transduction,gene ther,2011,18(5)，第479-487页所发表的方法或如实施例1或实施例5中所述确定。
[0088]
本文所报道的几种转导增强剂和转导增强剂组合导致转导效率增加。“转导效率增加”是指与不存在转导增强剂相比，在转导增强剂存在下通过基因疗法载体转导细胞群时vcn增加。
[0089]
靶细胞可以是可以用逆转录病毒载体靶向的任何细胞。然而，优选的是所述靶细胞为哺乳动物细胞，特别是人类细胞。
[0090]
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述靶细胞是选自由以下项组成的组的细胞：淋巴细胞、肿瘤细胞、淋巴谱系细胞、神经元细胞、上皮细胞、角质形成细胞、内皮细胞、原代细胞、t细胞、造血细胞和干细胞。
[0091]“靶细胞”可以是本文所公开的细胞类型中的任何细胞类型的单个细胞。然而，应当理解的是，本发明的方法也可以应用于细胞群。也就是说，靶细胞可以是同质细胞群，优选地是本文所公开的细胞类型中的任何一种细胞类型。然而，本发明的方法也可以用异质细胞群，例如已经在富集步骤中获得的细胞群执行。本领域中已知的是，特定细胞类型的富集不会导致所述细胞类型的100％纯培养物。然而，优选的是此类异质细胞群包含至少一种本文所公开的细胞类型。
[0092]
靶细胞可以优选地是哺乳动物细胞，并且更具体地，可以是来自任何胚层，例如来
自内胚层、外胚层或中胚层的细胞。
[0093]
术语“内胚层细胞”是指能够分化成内胚层器官，例如肝脏、胰腺、肠道、肺、甲状腺、甲状旁腺或泌尿道的细胞。术语“外胚层细胞”是指能够分化成外胚层器官，例如脑、脊髓、肾上腺髓质、表皮、毛发/指甲/真皮-腺体、感觉器官、外周神经、皮肤或晶状体的细胞。如本文所用，术语“中胚层细胞”是指中胚层来源，并在发育期间产生骨、软骨、肌腱、肌肉、脂肪组织和血管内皮的多能干细胞。
[0094]
在某些实施方式中，靶细胞可以是成纤维细胞。如本文所用，术语“成纤维细胞”是指间充质来源的细胞。成纤维细胞存在于结缔组织中。成纤维细胞合成肌动蛋白-肌球蛋白丝、基质元件(胶原蛋白、网状纤维和弹性纤维)以及糖胺聚糖和糖蛋白，所述物质是作为无定形细胞间物质分泌的。成纤维细胞包括结缔组织干细胞、基质和其他蛋白质合成细胞、收缩细胞和吞噬细胞。活性成纤维细胞的特征在于其丰富的内质网(endoplasmic reticulum,er)、高尔基复合体和核糖体。
[0095]
在某些实施方式中，靶细胞可以是平滑肌细胞或非平滑肌细胞。
[0096]
在某些实施方式中，靶细胞可以是上皮细胞。如本文所用的术语“上皮细胞”是指覆盖器官的自由表面(皮肤、粘液或浆液)或衬于动物体内的管或腔的立方形有核细胞，并且与本领域公认的上皮中上皮细胞的定义一致。上皮细胞层通常起到提供保护性衬里和/或表面的功能，所述保护性衬里和/或表面也可能参与运输过程。
[0097]
在某些实施方式中，靶细胞可以是内皮细胞。如本文所用的术语“内皮细胞”涵盖所有内皮细胞类型，例如形成衬于所有血管并调节血流与周围组织之间的交换的单细胞层的细胞。存在许多内皮细胞类型，并且它们的表型在不同器官之间、同一器官内血管环的不同区段之间以及同一器官和血管类型的相邻内皮细胞之间变化。此类内皮细胞的非限制性示例是：肝窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cell,lsec)；来自例如肺、心脏、肠、皮肤、视网膜的(微)血管内皮细胞；动脉内皮细胞，例如来自肺动脉、主动脉、脐动脉和脐静脉的内皮细胞；来自某些血管床的肝外内皮细胞；血脑屏障ec；骨髓ec；以及高内皮小静脉细胞(high endothelial venule cell,hev)。
[0098]
在某些实施方式中，靶细胞可以是神经元细胞。如本文所用，术语“神经元细胞”或“神经元”表示神经系统细胞，所述神经系统细胞包括中央细胞体或体细胞，以及以下两种类型的延伸或突起：树突，通常大部分神经元信号通过树突传递到细胞体；以及轴突，通常大部分神经元信号通过轴突从细胞体传递到效应细胞，例如靶神经元或肌肉。神经元可以将来自组织和器官的信息传递到中枢神经系统(传入或感觉神经元)，并将信号从中枢神经系统传输到效应细胞(传出或运动神经元)。其他被称为中间神经元的神经元，连接中枢神经系统(大脑和脊柱)内的神经元。根据本发明，可经受离体或体内治疗或方法或离体和体内治疗或方法的组合的神经元类型的某些具体示例包括小脑颗粒神经元、背根神经节神经元和皮层神经元或任何其他细胞类型的中枢或外周神经系统。
[0099]
在某些实施方式中，靶细胞可以是肿瘤细胞。如本文所用的术语“肿瘤细胞”是指赘生性的细胞。肿瘤细胞可以是良性的，即不形成转移瘤且不侵入和破坏邻近正常组织的肿瘤细胞；或恶性的，即侵入周围组织、能够产生转移瘤、在尝试去除后可能复发并且可能导致宿主死亡的肿瘤细胞。优选地，经受本发明的方法的肿瘤细胞可以来源于任何胚层(内胚层、外胚层、中胚层)。特别地，肿瘤细胞可以是上皮细胞、造血细胞、生殖细胞或间充质来
源的肿瘤细胞，例如但不限于来源于皮肤细胞、肺细胞、肠上皮细胞、结肠上皮细胞、睾丸细胞、乳腺细胞、前列腺细胞、脑细胞、骨髓细胞、血液淋巴细胞、卵巢细胞、性腺和性腺外相关细胞或胸腺细胞的肿瘤细胞。
[0100]
在某些实施方式中，靶细胞可以是来自淋巴谱系的细胞或来自骨髓谱系的细胞。来自淋巴谱系的细胞是来源于常见淋巴祖细胞的细胞，例如自然杀伤细胞、t细胞或b细胞。来自骨髓谱系的细胞是来源于共同骨髓祖细胞的细胞，例如巨核细胞、血小板、红细胞、肥大细胞、成髓细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞或巨噬细胞。
[0101]
如本文所用的术语“原代细胞”在本领域已知是指已从组织中分离并已被建立用于体外生长的细胞。对应的细胞已经经历了非常少(如果有的话)的群体倍增，并且因此与连续细胞系相比更能代表它们所来源于的组织的主要功能部件，由此表示对体内状态更具代表性的模型。从各种组织获得样品的方法和建立原代细胞系的方法是本领域中众所周知的(参见例如jones和wise,methods mol biol.1997)。用于在本发明的方法中使用的原代细胞来源于例如骨髓、血液、皮肤、淋巴瘤和上皮肿瘤。
[0102]
在某些实施方式中，靶细胞可以是淋巴细胞。如本文所用的术语“淋巴细胞”具有本领域中的正常含义，并且是指在血液、淋巴和淋巴组织中发现的任何单核、非吞噬性白细胞，即nk细胞、b细胞和t细胞。
[0103]
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述靶细胞是t细胞。如本文所用的术语“t细胞”是指在细胞介导的免疫中起核心作用的一类淋巴细胞。t细胞，也称为t淋巴细胞，可以通过在细胞表面上存在t细胞受体(t cell receptor,tcr)来与其他淋巴细胞(例如b细胞和自然杀伤细胞)区分开来。有几个具有不同功能的t细胞亚群，包括但不限于t辅助细胞、细胞毒性t细胞、记忆t细胞、调节性t细胞和自然杀伤t细胞。在某些实施方式中，靶细胞可以是由cd3、cd4和/或cd8的表面表达定义的t细胞。
[0104]
因此，在某些实施方式中，靶细胞可以是特征在于cd3的表达的t细胞。如本文所用的术语“cd3”是指所有哺乳动物物种，优选人类的分化簇3(cd3)t细胞共受体。在哺乳动物中，cd3包含cd3ζ链、cd3δ链和两条cd3ε链。因此，除了t细胞受体外，本发明的靶细胞还可以是表达t细胞共受体的任何t细胞。
[0105]
在某些实施方式中，靶细胞可以是特征在于cd4的表达的t细胞。如本文所用的术语“cd4”是指分化簇4，一种在t辅助细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞的表面上表达的糖蛋白。cd4是共受体，其与抗原呈递细胞一起协助t细胞受体(tcr)。因此，在某些实施方式中，靶细胞可以是t辅助细胞。
[0106]
在某些实施方式中，靶细胞可以是特征在于cd8的表达的t细胞。如本文所用，术语“cd8”是指分化簇8，一种充当在细胞毒性t细胞(cytotoxic t cell,ctl)中表达的t细胞受体(tcr)的共受体的跨膜糖蛋白。因此，在某些实施方式中，靶细胞可以是细胞毒性t细胞。
[0107]
在某些实施方式中，本发明的方法可用于生产car t、car m或car nk细胞。也就是说，如本文所公开的，t细胞，特别是细胞毒性cd8 t细胞或cd4 t辅助细胞、单核细胞、巨噬细胞或nk细胞可以用本发明的转导增强剂或转导增强剂组合进行预刺激和/或共刺激。在共刺激步骤期间，然后可以使t细胞、单核细胞、巨噬细胞或nk细胞与逆转录病毒载体，特别是慢病毒载体接触，所述逆转录病毒载体包含编码嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,car)的核酸。
[0108]
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述靶细胞是造血细胞，特别是人类来源的造血细胞。如本文所用的术语“造血细胞”是指造血系统的任何类型的细胞，包括但不限于未分化的细胞，例如造血干细胞和祖细胞，以及分化的细胞，例如白细胞(例如粒细胞、单核细胞、nk细胞和淋巴细胞)。
[0109]
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述靶细胞是造血干细胞。术语“造血干细胞”在最广泛的意义上用于指代血细胞所来源于的干细胞，包括多能干细胞、淋巴干细胞和骨髓干细胞。
[0110]
造血干细胞可以发育成血液或组织中存在的任何细胞谱系。如本文所用，该术语指负责在血液中产生细胞团的最早的可再生造血细胞群(例如，cd34-/cd133 、cd34-/ac133-/谱系-、cd34 /ac133 细胞，例如谱系-cd34 cd38-cd90 cd45ra-(majeti r.,park c.y.&weissman i.l.(2007)cell stem cell 1:635-645)、谱系-cd133 cd38-cd33-(等人(2007)exp hemat.35:1408-14))和非常早期的造血祖细胞(hematopoietic progenitor cell,hspc)，所述hspc的分化程度略微更高，但尚未定型并且可以很容易地恢复成为最早的可再生造血细胞群的一部分(例如，cd34 细胞，尤其是cd34 cd38-细胞)。在健康人类中，大多数造血多能干细胞和谱系定型的祖细胞是cd34 。这些细胞中的大多数是cd34 cd38 ，少数细胞(《10％)是cd34 cd38-。cd34 cd38-干细胞级分包括最不成熟的造血细胞，所述细胞能够自我更新和多向分化。与cd34 cd38 细胞级分的细胞相比，这种级分包含更多的长期培养起始细胞(long-term culture initiating cell,ltc-ic)，并且表现出更长的干性维持和延迟的对细胞因子的增殖反应。优选地，某些实施方式适用于富含人cd34 细胞的细胞群。
[0111]
在某些实施方式中，靶细胞是造血祖细胞。术语“造血祖细胞”是指多能造血干细胞的后代，所述后代定型为针对特定的分化系或定型成包含能够自我更新和多向分化的多能造血干细胞的任何细胞群。这些定型祖细胞被不可逆地确定为仅一种或几种血细胞类型(例如红细胞、巨核细胞、单核细胞或粒细胞)的祖先。
[0112]
在某些实施方式中，靶细胞是造血前体细胞。如本文所用的术语“造血前体细胞”包括造血干细胞、造血祖细胞或产生造血谱系(例如，淋巴、骨髓)中的细胞的任何细胞。造血前体细胞的示例是cfu-gemm(集落形成单位-粒细胞-红细胞-巨核细胞-单核细胞)、cfu-gm(集落形成单位-粒细胞-单核细胞)、cfu-e(集落形成单位-红细胞)、bfu-e(爆发集落形成单位-红细胞)、cfu-g(集落形成单位-粒细胞)、cfu-eo(集落形成单位-嗜酸性粒细胞)和cfu-meg(集落形成单位-巨核细胞)。
[0113]
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述靶细胞是cd34 细胞或包含在cd34 富集细胞群中的细胞。如本文所用，术语“cd34”是指存在于人体内某些细胞上的分化簇。其为细胞表面糖蛋白，并且用作细胞-细胞粘附因子。其还可以介导干细胞与骨髓细胞外基质或直接与基质细胞的附着。表达cd34的细胞(cd34 细胞)通常作为造血细胞、间充质干细胞的子集、内皮造血祖细胞、血管内皮细胞，而不是作为淋巴细胞存在于脐带和骨髓中。因此，如本文所用的术语“cd34 细胞”优选地是指来源于人骨髓的“对造血干细胞抗原cd34呈阳性”，即“表达造血干细胞抗原cd34”的造血干细胞和祖细胞。此外，靶细胞可以是包含在cd34 富集细胞群中的任何细胞。技术人员知道富集cd34 细胞的方法。此外，用于富集cd34 细胞群的商业试剂盒是可用的。某些实施方式可应用于富集人
cd34 细胞的细胞群。
[0114]
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述靶细胞是单核细胞、巨噬细胞、组织驻留巨噬细胞、小胶质细胞或树突细胞。
[0115]
也就是说，在某些实施方式中，靶细胞可以是单核细胞或包含在单核细胞富集群体中的细胞。如本文所用，术语“单核细胞”是指在免疫系统中具有以下两种主要功能的一类白细胞：(1)在正常状态下补充常驻巨噬细胞和树突状细胞，以及(2)响应于炎症信号，单核细胞可以迅速(约8-12小时)移动到组织中的感染部位并分化成巨噬细胞和树突状细胞以引发免疫应答。它们中的一半储存在脾脏中。单核细胞通常在染色涂片中通过其大的双叶核来鉴定。除了cd14的表达外，单核细胞还表现出以下表面标志物中的一种或多种表面标志物的表达：125i-wvh-1、63d3、脂肪分化相关蛋白(adipophilin)、cb12、cd11a、cd11b、cd14、cd16、cd54、cd163、胞苷脱氨酶、flt-1等。用于富集单核细胞的方法和商业试剂盒是本领域中已知的。
[0116]
在某些实施方式中，靶细胞可以是巨噬细胞或包含在巨噬细胞富集群体中的细胞。如本文所用的术语“巨噬细胞”是指来源于单核细胞分化的cd14 阳性细胞，其特征在于它们是吞噬细胞，在非特异性防御(先天免疫)中起作用以及帮助启动脊椎动物的特异性防御机制(适应性免疫)。它们的作用是吞噬(吞没然后消化)细胞碎片和无论是静止细胞还是移动细胞的病原体，并刺激淋巴细胞和其他免疫细胞对病原体作出反应。
[0117]
在某些实施方式中，巨噬细胞可以是组织驻留巨噬细胞，例如在例如脑或肾脏中的驻留巨噬细胞。除了cd14的表达外，巨噬细胞还表现出以下表面标志物中的一种或多种表面标志物的表达：cd11b、f4/80(小鼠)/emr1(人)、溶菌酶m、mac-1/mac-3、27e10、羧肽酶m、组织蛋白酶k、cd163、cd86、cd206、cd209、mer和cd68。这些标志物可以通过流式细胞术或免疫组织化学染色来确定。用于富集巨噬细胞的方法和商业试剂盒是本领域中已知的。必须注意的是，某些类型的组织驻留巨噬细胞可能不是来源于单核细胞，而是来自其他细胞类型或组织，例如卵黄囊。然而，此类非单核细胞来源的组织驻留巨噬细胞也可在本发明的方法中使用。
[0118]
在某些实施方式中，靶细胞可以是树突细胞，特别是髓样树突细胞，或包含在富集的树突细胞群体中的细胞，特别是髓样树突细胞。如本文所用，术语“髓样树突细胞”是指来源于单核细胞并且包括但不限于mdc-1和mdc-2的树突细胞群。除了cd14的表达外，髓样树突细胞还表现出以下表面标志物中的一种或多种表面标志物的表达：血栓调节蛋白/cd141/bdca-3、cd1c/bdca-1、神经纤毛蛋白-1/bdca-4、dc-sign/cd209、sirpa/cd172a、adam19、bdca-2、cd1a、cd11c、cd21、cd86、cd208、丛集素、雌激素受体-α。用于富集巨噬细胞的方法和商业试剂盒是本领域中已知的。
[0119]
在某些实施方式中，靶细胞可以是小胶质细胞，或包含在富集的小胶质细胞群中的细胞。如本文所用的术语“小胶质细胞”是指胶质细胞中可以充当吞噬细胞清除cns定位碎片的最小胶质细胞。它们被认为是在脑中发现并且其特征是iba1、cd11b、cd45、cd11c、铁蛋白、cd68、tmem2和/或cd33表达的一种类型的免疫细胞(hopperton等人(2018)mol.psych 23:177-198)。小胶质细胞是其他吞噬细胞(包括巨噬细胞和树突细胞)的近亲。与巨噬细胞一样，小胶质细胞来源于来自骨髓的髓样祖细胞。
[0120]
在某个实施方式中，靶细胞可以是小胶质细胞或小胶质细胞样细胞，或包含在富
集的小胶质细胞样细胞群中的细胞。术语“小胶质细胞样细胞”是指能够跨越血脑屏障的血液来源的单核细胞/巨噬细胞，尤其是如果在白消安或曲奥舒凡调理后注入患者体内时。小胶质细胞样细胞已经被报道为在神经炎症病症期间(mendiola a.s.等人(2020)nat immunol 21:513-524,pmid 32284594)和脑转移进展时(schulz m.等人(2020)iscience 23:101178.doi:10.1016/j.isci.2020.101178.)进入大脑，从而促进与脑组织驻留小胶质细胞的活性相当和/或互补的吞噬作用和先天免疫功能。
[0121]
本领域已知有多种方法来鉴定和/或富集上面列出的细胞类型中的任何细胞类型。例如，基于特定细胞表面标志物或细胞表面标志物组合的表达，可以通过流式细胞术富集特定细胞类型的细胞。此外，特定细胞类型的细胞可以通过本领域中已知的各种显微方法或基于它们的细胞因子分泌谱来鉴定。存在用于鉴定和/或富集特定细胞类型的各种商业试剂盒。
[0122]
本发明的方法可用于提高用逆转录病毒载体对靶细胞的转导。
[0123]
术语“载体”在本文中用于指能够转移或转运另一种核酸分子的核酸分子。对本领域技术人员来说将显而易见的是，术语“病毒载体”广泛用于指核酸分子(例如，转移质粒)，所述核酸分子包括通常促进核酸分子的转移或整合到细胞的基因组中的病毒来源的核酸元件，或者指介导核酸转移的病毒粒子。病毒粒子通常将包括各种病毒组分，并且有时除了核酸外还包括宿主细胞组分。
[0124]
术语病毒载体可以指能够将核酸转移到细胞中的病毒或病毒粒子，或者指被转移的核酸本身。病毒载体和转移质粒含有主要来源于病毒的结构和/或功能遗传元件。术语“逆转录病毒载体”是指以质粒形式使用的病毒载体或质粒，所述病毒载体或质粒用于对细胞进行瞬时细胞转染以进行病毒生产，或在稳定整合入细胞基因组后用于产生稳定的病毒产生细胞，所述细胞含有主要来源于逆转录病毒的结构和功能遗传元件或其部分。
[0125]
如本文所用，术语“逆转录病毒”是指这样的rna病毒，所述rna病毒将其基因组rna逆转录成线性双链dna拷贝并随后将其基因组dna共价整合到宿主基因组中。逆转录病毒是用于基因传递的常用工具(miller,2000,nature.357:455-460)。一旦病毒整合到宿主基因组中，它就被称为“前病毒”。前病毒充当rna聚合酶ii的模板并指导由宿主细胞编码的病毒rna分子的表达。示例性逆转录病毒包括但不限于：莫洛尼鼠白血病病毒(moloney murine leukemia virus,momlv)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(moloney murine sarcoma virus,momsv)、哈维鼠肉瘤病毒(harvey murine sarcoma virus,hamusv)、鼠乳腺肿瘤病毒(murine mammary tumor virus,mumtv)、长臂猿白血病病毒(gibbon ape leukemia virus,galv)、猫白血病病毒(feline leukemia virus,flv)、包括泡沫病毒在内的泡沫病毒属、弗云德鼠白血病病毒(friend murine leukemia virus,fmlv)、鼠干细胞病毒(murine stem cell virus,mscv)和劳斯氏肉瘤病毒(rous sarcoma virus,rsv)、α-逆转录病毒和慢病毒。也就是说，在本发明的方法中使用的逆转录病毒载体可以来源于本文所公开的任何逆转录病毒。此外，术语“逆转录病毒”是指任何假型逆转录病毒粒子，例如包含水疱性口炎病毒糖蛋白(vesicular stomatitis virus glycoprotein,vsv-g)假型逆转录病毒粒子或装饰有合胞素相关蛋白(优选合胞素2蛋白)的包膜(esnault c.等人(2008)pnas 105:17532-17537)以及不含假型病毒糖蛋白的逆转录病毒粒子(k.o.等人(2018)mol ther.26:634-647)。
[0126]
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述逆转录病毒载体是慢病毒载体。
[0127]
术语“慢病毒载体”是指含有主要来源于慢病毒的结构和功能遗传元件或其部分(包括ltr)的逆转录病毒载体或质粒。
[0128]
如本文所用，术语“慢病毒”是指一组(或属)复杂的逆转录病毒。示例性慢病毒包括但不限于：hiv(人类免疫缺陷病毒；包括hiv 1型和hiv 2型)；visna-maedi病毒(visna-maedi virus,vmv)；山羊关节炎脑炎病毒(caprine arthritis-encephalitis virus,caev)；马传染性贫血病毒(equine infectious anemia virus,eiav)；猫免疫缺陷病毒(feline immunodeficiency virus,fiv)；牛免疫缺陷病毒(bovine immune deficiency virus,biv)；和猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus,siv)。
[0129]
术语慢病毒载体还包括杂合载体。术语“杂合体”是指含有逆转录病毒(例如，慢病毒)序列和非慢病毒的病毒序列的载体、ltr(长末端重复序列)或其他核酸。例如，杂合载体可以指包含用于逆转录、复制、整合和/或包装的逆转录病毒(例如慢病毒)序列和甲病毒亚基因组启动子序列、非结构蛋白和/或聚合酶识别位点的载体或转移质粒。杂合载体的另一个示例是假型慢病毒载体，所述假型慢病毒载体包含用于逆转录和整合的慢病毒元件，但是所述慢病毒元件被不同来源的包膜蛋白覆盖，例如被水疱性口炎病毒糖蛋白(vsv-g)或不同的病毒包膜蛋白覆盖。
[0130]
在附加实施方式中，本发明涉及整合缺陷型逆转录病毒载体，所述整合缺陷型逆转录病毒载体包含无活性形式的逆转录病毒整合酶，所述无活性形式的逆转录病毒整合酶用于向细胞提供“模板dna”，通过基因组中的单链断裂(切口)和/或双链断裂的序列特异性插入进行靶向基因组编辑，涵盖侧接有单链断裂(切口)和/或双链断裂位置的序列以及在其之间的所需序列，被称为“模板dna”，其可通过所述整合缺陷型逆转录病毒载体瞬时提供给细胞。
[0131]
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述慢病毒载体是自灭活慢病毒载体。
[0132]“自灭活”(sin)载体是复制缺陷型载体，例如逆转录病毒或慢病毒载体，其中右侧(3')ltr增强子-启动子区，称为u3区，已经被修饰(例如，通过缺失和/或取代)以防止病毒转录超出第一轮病毒复制。因此，载体只能感染并随后整合到宿主基因组中一次，而不能进一步传代。这是因为具有病毒启动子/增强子序列的缺失的右侧(3')ltr u3区域在病毒逆转录期间用作左侧(5')ltr u3区域的模板，并且因此，在没有u3增强子-启动子的情况下，就不能从整合的sin载体制成新的病毒转录物。如果未制成病毒转录物，就不能加工或包装成病毒体，病毒的生命周期也就结束了。因此，sin载体极大地降低了创建不希望的具有复制能力的病毒的风险，因为右侧(3')ltr u3区域已经被修饰以防止病毒转录超过第一轮复制，因此消除了病毒传代的能力。
[0133]
在本发明的另一个和/或替代实施方式中，3'ltr可经修饰，使得u5区域被替换，例如用异源的或合成的poly(a)序列、一个或多个绝缘子元件和/或诱导型启动子替换。应当注意的是，对ltr的修饰，例如对3'ltr、5'ltr，或3'ltr和5'ltr两者的修饰，也被括在本发明中。
[0134]
通过用异源启动子替换5'ltr的u3区域以在病毒粒子生产期间驱动病毒基因组的
的序列。“突变形式”意指含有一个或多个不同于野生型或天然存在的序列的核苷酸的核酸序列，即突变核酸序列含有一个或多个核苷酸取代、缺失和/或插入。在一些情况下，转基因还可以包含编码前导肽或信号序列的序列，使得转基因产物将从细胞中分泌出来。
[0140]
在某些实施方式中，转基因可以是编码由于先天性或获得性遗传缺陷而在靶细胞中不表达或以降低的水平表达的天然存在多肽的核酸。在其他实施方式中，转基因可以编码嵌合抗原受体(car)。当转基因编码car时，优选的是所述靶细胞是t细胞、单核细胞或巨噬细胞或nk细胞。
[0141]
在某些实施方式中，转基因可以可操作地连接至启动子。术语“启动子”是指直接或间接调节与其可操作连接的对应核酸编码序列(例如，转基因)的转录的核酸序列。启动子可以单独起作用以调节转录，或者可以与一种或多种其他调节序列(例如，增强子或沉默子)协同作用。在本技术的上下文中，启动子通常可操作地连接至转基因以调节转基因的转录。
[0142]
如本文所用的术语“可操作地连接”是指各种核酸分子元件相对于彼此的布置，使得所述元件功能性地连接并且能够彼此相互作用。此类元件可包括但不限于启动子、增强子、多聚腺苷酸化序列、一个或多个内含子，和待表达的感兴趣的基因(即，转基因)的编码序列。当正确定向或可操作地连接时，核酸序列元件共同作用以调节彼此的活性，并最终可能影响转基因的表达水平。调节意指增加、降低或维持特定元件的活性水平。每个元件相对于其他元件的位置可以根据每个元件的5'末端和3'末端来表示，并且任何特定元件之间的距离可以通过所述元件之间的中介核苷酸或碱基对的数量来表示。如本领域技术人员所理解的，可操作地连接意味着功能活动，并且不一定与自然位置连接相关。实际上，当在载体中使用时，调节元件通常将位于启动子的立即上游(尽管通常是这种情况，但是绝对不应将其解释为限制或排除载体内的位置)，但体内就不需要是这种情况。
[0143]
包含在本发明的逆转录病毒载体或基因疗法载体中的启动子可以是任何本领域中已知的启动子，优选地是可以在本发明的靶细胞中诱导转基因转录的启动子。启动子可以是天然存在的启动子或合成启动子。启动子可以是普遍存在的启动子，即在广泛的细胞、组织和细胞周期中具有活性的启动子。或者，启动子可以是仅在某些细胞类型或甚至单个细胞类型中有活性或仅在细胞周期的某个阶段有活性的启动子。此外，启动子可以是组成型启动子或用于条件表达的启动子。
[0144]
如本文所用，术语“组成型启动子”是指继续或持续允许可操作连接的序列转录的启动子。组成型启动子可以是允许在多种细胞和组织类型中表达的“普遍存在的启动子”，或允许在有限种类的细胞和组织类型中表达的“组织特异性启动子”。示例性普遍存在的启动子包括但不限于巨细胞病毒(cmv)立即早期启动子、病毒猿猴病毒40(sv40)(例如早期或晚期)、莫洛尼鼠白血病病毒(momlv)ltr启动子、劳斯氏肉瘤病毒(rsv)ltr、单纯疱疹病毒(hsv)胸苷激酶启动子、来自牛痘病毒的h5、p7.5和p11启动子、延伸因子1-α(ef1α)启动子、早期生长反应1(egr1)、铁蛋白h(ferh)、铁蛋白l(ferl)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)、真核翻译起始因子4a1(eif4a1)、热休克70kda蛋白5(hspa5)、热休克蛋白90kdaβ成员1(hsp90b1)、热休克蛋白70kda(hsp70)、β-驱动蛋白(β-kin)、人rosa 26基因座(irions等人，nature biotechnology 25,1477-1482(2007))、泛素蛋白c启动子(ubc)、磷酸甘油酸激酶-1(pgk)启动子、巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(cag)启动子、β-肌动蛋白启动子，以
opinion in biotechnology 3:699-707(1993))、或突变体、衍生物(例如，含有重组蛋白序列或其片段的融合蛋白)、片段及其变体。适用于本发明的特定实施方式的重组酶的说明性示例包括但不限于：cre、int、ihf、xis、flp、fis、hin、gin、φc31、cin、tn3解离酶、tndx、xerc、xerd、tnpx、hjc、gin、spcce1和para。
[0150]
本领域已经描述了各种启动子，并且技术人员能够鉴定特别适合特定应用的启动子。然而，必须注意的是，转基因的选择和启动子的选择都不是本文所要求保护的方法中的限制特征。因此，包含在基因疗法载体或逆转录病毒载体中的感兴趣的核苷酸可以是任何核苷酸，前提条件是核苷酸的大小不超过载体的遗传负荷。
[0151]
本发明的方法可用于提高用逆转录病毒载体转导靶细胞的效率。逆转录病毒载体可以包含任何转基因。
[0152]
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述载体包含全部或部分编码p47phox、gp91phox、p22phox、p67phox或p40phox蛋白的cdna。
[0153]
也就是说，逆转录病毒载体可以包含编码蛋白p47phox、gp91phox、p22phox、p67phox或p40phox中的任何一者的cdna。在其他实施方式中，逆转录病毒载体可以包含编码蛋白p47phox、gp91phox、p22phox、p67phox或p40phox中的任何一者的cdna的片段。cdna片段可以是可变剪接的结果，或者可以借助于基因工程或化学合成产生，或者可以是包含编码蛋白p47phox、gp91phox、p22phox、p67phox或p40phox的cdna的任何融合构建体。该片段可以包含50％、60％、70％、80％、90％或95％的编码蛋白p47phox、gp91phox、p22phox、p67phox或p40phox的cdna。优选地，从cdna片段表达的p47phox、gp91phox、p22phox、p67phox或p40phox的变体具有与相应的全长蛋白质相同的生物学功能。
[0154]
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述载体包含编码嵌合抗原受体(car)的转基因。
[0155]
也就是说，本发明方法中使用的逆转录病毒载体可以包含编码car的核酸。car在本发明方法中不受限制并且可以是任何本领域中已知的car。
[0156]
在本发明的一个实施方式中，感兴趣的转基因，特别是p47phox，处于内部启动子，特别是选自由以下项组成的组的内部启动子的控制下：骨髓特异性mir223启动子、猿猴病毒40(sv40)(例如，早期或晚期)、巨细胞病毒(cmv)(例如，立即早期)、莫洛尼鼠白血病病毒(momlv)、劳斯氏肉瘤病毒(rsv)和单纯疱疹病毒(hsv)胸苷激酶启动子，特别是骨髓特异性mir223启动子。
[0157]
在本发明的一个实施方式中，包含在骨髓特异性启动子，特别是mir223启动子控制下的p47phox转基因的逆转录病毒载体，特别是慢病毒-sin载体，在根据本发明的用于治疗与p47phox缺乏相关联的疾病或疾患，特别是用于治疗p47phox缺乏形式的慢性肉芽肿病的方法中使用。在某些实施方式中，在根据本发明的方法中使用慢病毒载体，所述慢病毒载体编码在mir223启动子控制下的编码gp91phox或p22phox或p67phox或p40phox的cdna。
[0158]
术语“mir223启动子”是指长度为250nt或更大并且与以下序列有大于70％、75％、80％、85％、90％、95％的序列同源性的dna序列：
[0159][0160]
术语“p47phox蛋白”是指这样的任何蛋白，所述蛋白的长度为26个氨基酸或更长，包含与由具有ncbi geneid 653361的人嗜中性粒细胞胞质因子1(ncf-1)基因编码的同种型和/或剪接变体中的任一者具有大于70％、75％、80％、85％、90％、95％的同源性的序列，和/或与以下蛋白序列具有大于70％、75％、80％、85％、90％、95％同源性的任何蛋白序列：
[0161]
[0162][0163]
当用转导增强剂或转导增强剂组合对靶细胞进行预刺激和/或共刺激时，优选的是在液体培养基，优选地液体细胞培养基中在转导增强剂或转导增强剂组合的存在下孵育靶细胞。
[0164]
技术人员知道细胞培养基的选择取决于靶细胞的类型。也就是说，细胞培养基优选为能够维持和/或增殖靶细胞的培养基。适用于维持和/或增殖特定细胞类型的细胞的多种细胞培养基已在本领域中描述并且可商购获得。
[0165]
在某些实施方式中，靶细胞是造血干细胞(hsc)。用于培养hsc的各种培养基是本领域中已知的。在某些实施方式中，可以通过在包括x-vivo 10培养基(lonza)、x-vivo 20培养基(lonza)或besp1366f培养基(改进的不含抗生素(庆大霉素)的x-vivo 20；lonza)在内的液体培养基中孵育hsc，来用转导增强剂或转导增强剂组合对hsc进行预刺激和/或共刺激。
[0166]
在某些实施方式中，可以将靶细胞，特别是hsc，与转导增强剂或转导增强剂组合在细胞培养基，特别是x-vivo 10、x-vivo 20或besp1366f培养基中一起孵育，其中所述细胞培养基包含1％人血清白蛋白、300ng/ml干细胞因子(scf)、200ng/ml或300ng/ml的fms样酪氨酸激酶3(flt-3)配体(flt3-lig)和/或100ng/ml的血小板生成素(tpo)。
[0167]
在某些实施方式中，可以将靶细胞，特别是hsc，与转导增强剂或转导增强剂组合在包含1％人血清白蛋白、300ng/ml的干细胞因子(scf)、300ng/ml的fms样酪氨酸激酶3(flt-3)配体(flt3-lig)和/或100ng/ml的血小板生成素(tpo)的x-vivo 10培养基中一起孵育。
[0168]
在某些实施方式中，可以将靶细胞，特别是hsc，与转导增强剂或转导增强剂组合在包含1％人血清白蛋白、300ng/ml的干细胞因子(scf)、200ng/ml的fms样酪氨酸激酶3(flt-3)配体(flt3-lig)和/或100ng/ml的血小板生成素(tpo)的x-vivo 20培养基中一起孵育。
[0169]
在某些实施方式中，可以将靶细胞，特别是hsc，与转导增强剂或转导增强剂组合在包含1％人血清白蛋白、300ng/ml的干细胞因子(scf)、300ng/ml的fms样酪氨酸激酶3(flt-3)配体(flt3-lig)和/或100ng/ml的血小板生成素(tpo)的besp1366f培养基中一起孵育。
[0170]
靶细胞可以在任何细胞密度或浓度下用转导增强剂或转导增强剂组合进行预刺激和/或共刺激。
[0171]
也就是说，靶细胞，特别是hsc，可以以在约1e3个细胞/cm2至约1e10个细胞/cm2范围内的细胞密度，优选在约1e4个细胞/cm2至约1e8个细胞/cm2范围内的细胞密度，更优选在约1e5个细胞/cm2至约1e7个细胞/cm2范围内的细胞密度，最优选约2e6个细胞/cm2的细胞密度与转导增强剂一起孵育。
[0172]
或者，靶细胞，特别是hsc，可以以在约1e3个细胞/ml至约1e10个细胞/ml范围内的浓度，优选地在约1e4个细胞/ml至约1e8个细胞/ml范围内的浓度，更优选地在约1e5个细胞/ml至约1e7个细胞/ml范围内的浓度，最优选地介于0.1e6个细胞/ml与4e6个细胞/ml之间的浓度与转导增强剂一起孵育。
[0173]
通过基因疗法载体测试了几种新颖的化合物和化合物组合在提高人细胞转导效率方面的潜力。特别关注于化合物与编码感兴趣的转基因(例如但不限于p47phox)的逆转录病毒载体，特别是慢病毒-sin载体的组合。
[0174]
在某些实施方式中，本发明涉及用作转导增强剂的化合物两性霉素b。也就是说，本发明至少部分地基于以下令人惊讶的发现：两性霉素b可以提高用基因疗法载体，特别是逆转录病毒载体转导靶细胞的效率。因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述转导增强剂是两性霉素b。
[0175]
两性霉素b是一种抗真菌药物，其用于治疗严重的真菌感染和利什曼病。其用于治疗的真菌感染包括曲霉菌病、芽生菌病、念珠菌病、球孢子菌病和隐球菌病。它通常通过注射到静脉中来施加。两性霉素b于1955年从多结链霉菌(streptomyces nodosus)中分离出来，并于1958年投入医学使用。它在世界卫生组织的基本药物清单中，是卫生系统所需的最安全和最有效的药物。尚未建议将两性霉素b用作转导增强剂。
[0176]
本发明人已经表明，当以0.5-1μg/ml的浓度与靶细胞接触时，两性霉素b增强靶细胞的转导效率。因此，在某个实施方式中，两性霉素b可用作浓度范围为约0.05μg/ml至约10μg/ml，优选浓度范围为约0.1μg/ml至约5μg/ml，更优选浓度范围为约0.5μg/ml至约2μg/ml，最优选浓度为约0.75μg/ml的转导增强剂。在某些实施方式中，两性霉素b可用作浓度范围为约0.05μm至约500μm，优选地浓度范围为约0.1μm至约10μm，更优选地浓度范围为约0.1μm至约3μm，最优选地浓度为0.811μm的转导增强剂。优选地，两性霉素b在预刺激或共刺激步骤中与造血细胞，更优选地hsc以以上公开的浓度和/或密度中的任一者接触。在某个实施方式中，浓度介于0.5e6个细胞/ml与1e6个细胞/ml之间或浓度为2e6个细胞/cm2细胞培养表面的hsc可以用浓度为0.5μg/ml的两性霉素b预刺激和/或共刺激。在某个实施方式中，浓度介于0.5e6个细胞/ml与1e6个细胞/ml之间或浓度为2e6个细胞/cm2细胞培养表面的hsc可以用浓度为0.75μg/ml的两性霉素b预刺激和/或共刺激。在某个实施方式中，浓度介于0.5e6个细胞/ml与1e6个细胞/ml之间或浓度为2e6个细胞/cm2细胞培养表面的hsc可以用浓度为1μg/ml的两性霉素b预刺激和/或共刺激。
[0177]
在某些实施方式中，本发明涉及用作转导增强剂的化合物水飞蓟宾。也就是说，本发明至少部分地基于以下令人惊讶的发现：水飞蓟宾可以提高用基因疗法载体，特别是逆转录病毒载体转导靶细胞的效率。因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述转导增强剂是水飞蓟宾。
[0178]
水飞蓟宾，也称为水飞蓟素(均来自水飞蓟属，其所提取自的植物的通用名称)，是西利马林(silymarin)的主要活性成分，乳蓟籽的标准化提取物，含有由水飞蓟宾、异水飞
蓟宾(isosilibinin)、水飞蓟丁(silichristin)、水飞蓟宁(silidianin)等组成的黄酮木脂素混合物。水飞蓟宾本身是两种非对映异构体水飞蓟宾a和水飞蓟宾b的大致等摩尔比的混合物。市售水飞蓟宾的化学名称为2,3-二氢-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-2-(羟甲基)-6-(3,5,7-三羟基-4-氧代苯并吡喃-2-基)苯并二噁英(cas号：22888-70-6)。
[0179]
水飞蓟宾据报道抑制乙型肝炎病毒进入hepg2-ntcp-c4细胞(umetsu等人(2018)biochem biophys rep.14:20-25)和丙型肝炎病毒感染原代人肝细胞(liu等人(2017)gut 66:1853-1861)。水飞蓟宾(s0)，水飞蓟(s.marianum l.)的一种主要化合物，据报道抑制mdck细胞的甲型流感病毒(iav)感染(dai等人(2013)antimicrob agents chemother.57:4433-43)。在病毒吸附期间将t细胞暴露于legalon-sil(sil)，一种水飞蓟宾的水溶性衍生物(但不是水飞蓟宾)，据报道阻断hiv感染(mcclure等人(2014)virology 449:96-103)。
[0180]
没有关于水飞蓟宾用作转导增强剂的报道。此外，鉴于上文公开的水飞蓟宾的抗病毒活性，非常令人惊讶的是水飞蓟宾可用于增强用基因疗法载体，特别是逆转录病毒载体对靶细胞的转导。
[0181]
本发明人已经表明，水飞蓟宾在以1μm至5μm的浓度与靶细胞接触时提高了靶细胞的转导效率。因此，在某个实施方式中，水飞蓟宾可以用作浓度范围为约0.05μm至约500μm，优选地浓度范围为约0.05μm至约25μm，更优选地浓度范围为约0.05μm至约10μm，甚至更优选地浓度范围为约1μm至约10μm，最优选地浓度为约3μm的转导增强剂。优选地，水飞蓟宾在预刺激或共刺激步骤中与造血细胞，更优选地hsc以以上公开的浓度和/或密度中的任一者接触。在某个实施方式中，浓度为0.5e6个细胞/ml至1e6个细胞/ml或密度为2e6/cm2的hsc可以用浓度为3μm的水飞蓟宾预刺激和/或共刺激。在某个实施方式中，浓度为0.5e6个细胞/ml至1e6个细胞/ml或密度为2e6/cm2的hsc可以用浓度为5μm的水飞蓟宾预刺激和/或共刺激。
[0182]
在某些实施方式中，本发明涉及用作转导增强剂的化合物米哚妥林。也就是说，本发明至少部分地基于以下令人惊讶的发现：米哚妥林可以提高用基因疗法载体，特别是逆转录病毒载体转导靶细胞的效率。因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述转导增强剂是米哚妥林。
[0183]
蛋白激酶抑制剂米哚妥林，也称为cgp 41251，最初是作为抗癌药物开发的(meyer等人(1989)int j cancer 43:851-6)。该化合物据报道重新激活从hiv-1潜在感染的ach2细胞系以及从原代静息cd4 t细胞进行hiv-1表达(ao等人(2016)virol j 13:177)。尚未测试过该药物提高转导效率的效力。
[0184]
本发明人已经表明，米哚妥林在以100nm至400nm的浓度与靶细胞接触时提高了靶细胞的转导效率。因此，在某个实施方式中，米哚妥林可以用作浓度范围为约50nm至约500,000nm，优选地浓度范围为约50nm至约25,000nm，更优选地浓度范围为约50nm至约10000nm，甚至更优选地浓度范围为约50nm至约5000nm，甚至更优选地浓度范围为约50nm至约1000nm，甚至更优选地浓度范围为约50nm至约500nm，最优选地浓度为约200nm的转导增强剂。优选地，米哚妥林在预刺激或共刺激步骤中与造血细胞，更优选地hsc以以上公开的浓度和/或密度中的任一者接触。在某个实施方式中，浓度为0.5e6个细胞/ml或密度为2e6/cm2的hsc可以用浓度为100nm的米哚妥林预刺激和/或共刺激。在某个实施方式中，浓度为0.5e6个细胞/ml至1e6个细胞/ml或密度为2e6/cm2的hsc可以用浓度为200nm的米哚妥林预
刺激和/或共刺激。在某个实施方式中，浓度为0.5e6个细胞/ml至1e6个细胞/ml或密度为2e6/cm2的hsc可以用浓度为400nm的米哚妥林预刺激和/或共刺激。
[0185]
在某些实施方式中，本发明涉及用作转导增强剂的化合物制霉菌素。也就是说，本发明至少部分地基于以下令人惊讶的发现：制霉菌素可以提高用基因疗法载体，特别是逆转录病毒载体转导靶细胞的效率。因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述转导增强剂是制霉菌素。
[0186]
制霉菌素通常出于其抗霉菌作用而在细胞培养物中使用(fassler等人(2013)plos one 8:e76092)。制霉菌素也是一种胆固醇结合试剂，已知会破坏小窝蛋白介导的内吞作用。过去曾测试过其抑制用野生型慢病毒载体对293t细胞进行转导的能力。没有观察到制霉菌素对载体进入的抑制，证实了野生型慢病毒载体使用网格蛋白介导的内吞作用来进入细胞(lee,dang,joo&wang(2011)virus res.160:340-50)。用制霉菌素处理慢病毒粒子，然后从制霉菌素中重新纯化慢病毒粒子，导致重新纯化的慢病毒粒子的感染性显著降低(guyader等人(2002)j virol.76:10356-64)。迄今为止，从未报道过制霉菌素对逆转录病毒转导的转导增强效应。
[0187]
本发明人已经表明，制霉菌素在以100μm的浓度与靶细胞接触时提高了靶细胞的转导效率。因此，在某个实施方式中，制霉菌素可以用作浓度范围为约10μm至约1000μm，优选地浓度范围为约25μm至约500μm，更优选地浓度范围为约50μm至约约250μm，最优选地浓度为约100μm的转导增强剂。优选地，制霉菌素在预刺激或共刺激步骤中与造血细胞，更优选地hsc以以上公开的浓度和/或密度中的任一者接触。在某个实施方式中，浓度为0.5e6个细胞/ml至1e6个细胞/ml或密度为2e6/cm2的hsc可以用浓度为100μm的制霉菌素预刺激和/或共刺激。
[0188]
在某些实施方式中，本发明涉及用作转导增强剂的化合物纳他霉素。也就是说，本发明至少部分地基于以下令人惊讶的发现：纳他霉素可以提高用基因疗法载体，特别是逆转录病毒载体转导靶细胞的效率。因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述转导增强剂是纳他霉素。
[0189]
纳他霉素是一种在食品行业中用于香肠和奶酪的表面处理的抗真菌剂(juneja,dwivedi&yan(2012)annu rev food sci technol.3:381-403)。其从未在病毒转导的背景下报道过。
[0190]
本发明人已经表明，纳他霉素在以3μm的浓度与靶细胞接触时提高了靶细胞的转导效率。因此，在某个实施方式中，纳他霉素可以用作浓度范围为约0.05μm至约500μm，优选地浓度范围为约0.05μm至约10μm，更优选地浓度范围为约1μm至约5μm，最优选浓度为约3μm的转导增强剂。在某个实施方式中，纳他霉素可以用作浓度范围为约0.1μm至约20μm的转导增强剂。优选地，纳他霉素在预刺激或共刺激步骤中与造血细胞，更优选地hsc以以上公开的浓度和/或密度中的任一者接触。在某个实施方式中，浓度为0.5e6个细胞/ml至1e6个细胞/ml或密度为2e6/cm2的hsc可以用浓度为约3μm的纳他霉素预刺激和/或共刺激。
[0191]
在某些实施方式中，本发明涉及用作转导增强剂的化合物依维莫司。也就是说，本发明至少部分地基于以下令人惊讶的发现：依维莫司可以提高用基因疗法载体，特别是逆转录病毒载体转导靶细胞的效率。因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述转导增强剂是依维莫司。
[0192]
依维莫司是一种用作免疫抑制剂的药物，用于防止器官移植排斥和治疗肾细胞癌和其他肿瘤。还已经对依维莫司和其他mtor抑制剂作为用于多种癌症的靶向疗法进行了很多研究。
[0193]
本发明人已经表明，依维莫司在以1μm的浓度与靶细胞接触时提高了靶细胞的转导效率。因此，在某个实施方式中，依维莫司可用作浓度范围为约0.1μm至约10μm，优选地浓度范围为约0.2μm至约7.5μm，更优选地浓度范围为约0.5μm至约5μm，最优选地浓度为约1μm的转导增强剂。优选地，依维莫司在预刺激或共刺激步骤中与造血细胞，更优选地hsc以以上公开的浓度和/或密度中的任一者接触。在某个实施方式中，浓度为0.5e6个细胞/ml至1e6个细胞/ml或密度为2e6/cm2的hsc可以用浓度为1μm的依维莫司预刺激和/或共刺激。
[0194]
在某些实施方式中，本发明涉及用作转导增强剂的化合物脱氧核糖核苷。也就是说，本发明至少部分地基于以下令人惊讶的发现：脱氧核糖核苷可以提高用基因疗法载体，特别是逆转录病毒载体转导靶细胞的效率。因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述转导增强剂是脱氧核糖核苷。
[0195]
术语“脱氧核糖核苷”包括以下物质的任何组合物：2'-脱氧胸苷，即具有同义词胸腺嘧啶脱氧核苷、1-(2-脱氧-β-d-呋喃核糖基)-5-甲基尿嘧啶、1-(2-脱氧-β-d-呋喃核糖基)胸腺嘧啶、dt)的cas号为50-89-5的化学结构；和2
′‑
脱氧腺苷，即具有同义词9-(2-脱氧-β-d-呋喃核糖基)腺嘌呤、腺嘌呤脱氧核苷)的cas号为958-09-8的化学结构；和2
′‑
脱氧鸟苷，即具有同义词9-(2-脱氧-β-d-呋喃核糖基)鸟嘌呤、鸟嘌呤-2
′‑
脱氧核苷)的cas号为312693-72-4的化学结构；以及2
′‑
脱氧胞苷(即具有同义词胞嘧啶脱氧核苷)的cas号为951-77-9的化学结构。各种脱氧核糖核苷可以以相同浓度或不同浓度存在。在一个优选的实施方式中，上面列出的所有四种脱氧核糖核苷都以等摩尔量存在。脱氧核糖核苷尚未被建议作为造血干细胞的转导增强剂。
[0196]
发明人已经表明，当以0.3-2.5mm的终浓度与靶细胞接触时，脱氧核糖核苷具有提高作为靶细胞的造血干细胞的转导效率的能力。因此，在某个实施方式中，脱氧核糖核苷可用作浓度范围为约0.1mm至约10mm，优选地浓度范围为约0.25mm至约7.5mm，更优选地浓度范围为约0.5mm至约5mm，最优选地浓度为约2.5mm的转导增强剂。优选地，脱氧核糖核苷在预刺激或共刺激步骤中与造血细胞，更优选地hsc以以上公开的浓度和/或密度中的任一者接触。在某个实施方式中，浓度为0.5e6个细胞/ml至1e6个细胞/ml或密度为2e6/cm2的hsc可以用浓度为0.3mm的脱氧核糖核苷预刺激和/或共刺激。
[0197]
在某些实施方式中，本发明涉及bab型三嵌段共聚物作为转导增强剂的用途。也就是说，本发明至少部分地基于以下令人惊讶的发现：bab型三嵌段共聚物可以提高用基因疗法载体，特别是逆转录病毒载体转导靶细胞的效率。因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述转导增强剂是bab型三嵌段共聚物。
[0198]
术语“bab型三嵌段共聚物”是指由三个嵌段的线性布置组成的任何聚合物，其中每个嵌段由重复元素的聚合形式组成，其中中心的疏水性聚合嵌段“a”在两侧上侧接有被称为“b”的在两侧的亲水性聚合物单元。在此被称为“bab型三嵌段共聚物”的聚合物是通过将两个“ba”二嵌段共聚物通过接头共价连接而合成的，其中所述接头被称为“l”，其中“l”优选但不限于六亚甲基二异氰酸酯(hmdi)。在“bab型三嵌段共聚物”中，外围嵌段“b”可以优选但不排他地由具有式-(ch2-ch2-o)x-的乙二醇的聚合物形成，并且“a”嵌段可以包含
ch2-o)n-(co-cch3-o)m-l-(o-cch3-co)m-(o-ch2-ch2)n-o-ch3(其中在hmdi接头的情况下l＝co-nh-ch2-(ch2)4-ch2-nh-co，并且n、m是聚合物内的单体的数量)概括。
[0204]
在本文中被称为“peg-pla-peg”聚合物的聚合物中，在hmdi接头的情况下，“l”优选地但不排他地包含-co-nh-ch2-(ch2)4-ch2-nh-co-或由-co-nh-ch2-(ch2)4-ch2-nh-co-组成。本文中被称为“peg-pla-peg”聚合物的聚合物的分子量可介于10,000道尔顿与16,000道尔顿之间，优选地约10,000道尔顿、约11,000道尔顿、约12,000道尔顿、约13,000道尔顿、约14,000道尔顿、约15,000道尔顿或约16,000道尔顿。“b”嵌段可由聚合物组成，所述聚合物优选地但不排他地由乙二醇的聚合物形成。聚合物的peg部分可对聚合物的总分子量贡献大于50％且低于95％。也就是说，聚合物“peg-pla-peg”的总分子量的约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％可归因于peg聚合物。在某些实施方式中，peg-pla-peg可以指聚(乙二醇)/聚(丙交酯)/聚(乙二醇)(peg-pla-peg)，其具有在两个末端处的5kda聚(乙二醇)嵌段和中央的4.2kda聚(丙交酯)嵌段，被称为peg5k-b-pla4.2k-b-peg5k。
[0205]
本发明人已经表明，peg-pla-peg在以10μg/ml的浓度与靶细胞接触时提高了靶细胞的转导效率。因此，在某个实施方式中，peg-pla-peg可用作浓度范围为约0.1μg/ml至约5000μg/ml，优选地浓度范围为约1μg/ml至约2500μg/ml，更优选地浓度范围为约5μg/ml至约1000μg/ml，最优选地浓度为约50μg/ml的转导增强剂。在某些实施方式中，peg-pla-peg可用作浓度范围为约1μg/ml至约100μg/ml，优选地浓度范围为约5μg/ml至约50μg/ml的转导增强剂。优选地，peg-pla-peg在预刺激或共刺激步骤中与造血细胞，更优选地hsc以以上公开的浓度和/或密度中的任一者接触。在某个实施方式中，浓度为0.5e6个细胞/ml至1e6个细胞/ml或密度为2e6/cm2的hsc可以用浓度为50μg/ml的peg-pla-peg预刺激和/或共刺激。
[0206]
术语“peg-pcl-peg”聚合物是指bab型三嵌段共聚物，其中“b”嵌段由式为-(ch2-ch2-o)n的乙二醇的聚合物形成，并且“a”嵌段包含ε-己内酯的聚合形式或由ε-己内酯的聚合形式组成。所得聚合物可称为“甲氧基聚(乙二醇)-聚(ε-己内酯)-甲氧基聚(乙二醇)(peg-pcl-peg)”并且可以由式ch3-o-(ch2-ch2-o)n-(co-ch2-ch2-ch2-ch2-ch2-o)m-l-(o-cch3-co)m-(o-ch2-ch2)n-o-ch3(其中在hmdi接头的情况下l＝co-nh-ch2-(ch2)4-ch2-nh-co，并且n、m是聚合物内的单体的数量)概括。
[0207]
在本文中被称为“peg-pcl-peg”聚合物的聚合物中，在hmdi接头的情况下，“l”可以优选地但不排他地包含l＝co-nh-ch2-(ch2)4-ch2-nh-co或由l＝co-nh-ch2-(ch2)4-ch2-nh-co组成。本文中被称为“peg-pcl-peg”聚合物的聚合物的分子量可介于10,000道尔顿与16,000道尔顿之间，优选地约10,000道尔顿、约11,000道尔顿、约12,000道尔顿、约13,000道尔顿、约14,000道尔顿、约15,000道尔顿或约16,000道尔顿。“b”嵌段可由聚合物组成，所述聚合物优选地但不排他地由乙二醇的聚合物形成。聚合物的peg部分可对聚合物的总分子量贡献大于50％且低于95％。也就是说，聚合物“peg-pcl-peg”的总分子量的约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％可归因于peg聚合物。在某些实施方式中，peg-pcl-peg可以指聚(乙二醇)-聚(ε-己内酯)-聚(乙二醇)(peg-pcl-peg)，其具有在两个末端处的5kda聚(乙二醇)嵌段和中央的4.2kda聚(ε-己内酯)嵌段，被称为peg5k-b-pcl4.2k-b-peg5k。在某些实施方式中，peg-pcl-peg可以指聚
(乙二醇)-聚(ε-己内酯)-聚(乙二醇)(peg-pcl-peg)，其具有在两个末端处的5.3kda聚(乙二醇)嵌段和中央的2.4kda聚(ε-己内酯)嵌段，被称为nh2-peg5.3k-b-pcl2.4k-b-peg5.3k-nh2。
[0208]
本发明人已经表明，peg-pcl-peg在以10μg/ml的浓度与靶细胞接触时提高了靶细胞的转导效率。因此，在某个实施方式中，peg-pcl-peg可用作浓度范围为约0.1μg/ml至约5000μg/ml，优选地浓度范围为约1μg/ml至约2500μg/ml，更优选地浓度范围为约5μg/ml至约1000μg/ml，最优选地浓度为约10μg/ml的转导增强剂。在某些实施方式中，peg-pcl-peg可用作浓度范围为约1μg/ml至约100μg/ml，优选地浓度范围为约5μg/ml至约50μg/ml的转导增强剂。优选地，peg-pcl-peg在预刺激或共刺激步骤中与造血细胞，更优选地hsc以以上公开的浓度和/或密度中的任一者接触。在某个实施方式中，浓度为0.5e6个细胞/ml至1e6个细胞/ml或密度为2e6/cm2的hsc可以用浓度为10μg/ml的peg-pcl-peg预刺激和/或共刺激。
[0209]
本发明还涵盖官能化的bab型三嵌段聚合物作为转导增强剂的用途。术语“官能化的”聚合物是指“bab型三嵌段共聚物”，包括“peg-plga-peg”聚合物、“peg-pla-peg”聚合物和“peg-pcl-peg”聚合物，它们通过阳离子基团与聚合物的一个和/或两个末端的共价键而“官能化”。在这些官能化的“bab型三嵌段共聚物”中，阳离子基团可以包含包含氨基的分子或由包含氨基的分子组成，所述包含氨基的分子为例如但不限于赖氨酸、精氨酸和/或组氨酸的单体和/或聚合形式。
[0210]
在某些实施方式中，本发明涉及用作转导增强剂的化合物白藜芦醇。也就是说，本发明至少部分地基于以下令人惊讶的发现：白藜芦醇可以提高用基因疗法载体，特别是逆转录病毒载体转导靶细胞的效率。因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述转导增强剂是白藜芦醇。
[0211]
白藜芦醇(3,5,4'-三羟基-反式二苯乙烯)是芪类化合物，一种类型的天然苯酚，并且是由几种植物响应于损伤或在受到病原体(例如细菌或真菌)攻击时产生的植物抗毒素。已经研究了白藜芦醇的潜在治疗用途，但几乎没有证据表明其在人类中有抗疾病效应或健康益处。
[0212]
本发明人已经表明，白藜芦醇在以5μm的浓度与靶细胞接触时提高了靶细胞的转导效率。因此，在某个实施方式中，白藜芦醇可用作浓度范围为约0.1μm至约10μm，优选地浓度范围为约1μm至约7.5μm，更优选地浓度范围为约2.5μm至约7.5μm，最优选地浓度为约5μm的转导增强剂。优选地，白藜芦醇在预刺激或共刺激步骤中与造血细胞，更优选地hsc以以上公开的浓度和/或密度中的任一者接触。在某个实施方式中，浓度为0.5e6个细胞/ml至1e6个细胞/ml或密度为2e6/cm2的hsc可以用浓度为5μm的白藜芦醇预刺激和/或共刺激。
[0213]
在某些实施方式中，本发明涉及用作转导增强剂的化合物前列腺素e2。也就是说，本发明至少部分地基于以下令人惊讶的发现：前列腺素e2可以提高用基因疗法载体，特别是逆转录病毒载体转导靶细胞的效率。因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述转导增强剂是前列腺素e2。
[0214]
前列腺素e2(pge2)，也称为地诺前列酮，是一种天然存在的前列腺素，其具有催产特性，被用作药物。地诺前列酮用于引产、产后出血、终止妊娠，以及在新生儿中用于保持动脉导管畅通。在婴儿中，其用于具有先天性心脏缺陷的婴儿，直到可以进行手术。它还用于
管理妊娠滋养细胞疾病。
[0215]
本发明人已经表明，前列腺素e2在以10μm的浓度与靶细胞接触时提高了靶细胞的转导效率。因此，在某个实施方式中，前列腺素e2可用作浓度范围为约1μm至约100μm，优选地浓度范围为约2μm至约50μm，更优选地浓度范围为约5μm至约25μm，最优选地浓度为约10μm的转导增强剂。优选地，前列腺素e2在预刺激或共刺激步骤中与造血细胞，更优选地hsc以以上公开的浓度和/或密度中的任一者接触。在某个实施方式中，浓度为0.5e6个细胞/ml至1e6个细胞/ml或密度为2e6/cm2的hsc可以用浓度为10μm的前列腺素e2预刺激和/或共刺激。
[0216]
在某些实施方式中，本发明涉及用作转导增强剂的化合物泊洛沙姆synperonic f108。也就是说，本发明至少部分地基于以下令人惊讶的发现：泊洛沙姆synperonic f108可以提高用基因疗法载体，特别是逆转录病毒载体转导靶细胞的效率。因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述转导增强剂是泊洛沙姆synperonic f108。
[0217]
泊洛沙姆synperonic f108是一种非离子聚合物表面活性剂。
[0218]
本发明人已经表明，当以0.5-2mg/ml的浓度与靶细胞接触时，泊洛沙姆synperonic f108增强靶细胞的转导效率。因此，在某个实施方式中，泊洛沙姆synperonic f108可用作浓度范围为约0.1mg/ml至约10mg/ml，优选地浓度范围为约0.25mg/ml至约5mg/ml，更优选地浓度范围为约0.5mg/ml至约2mg/ml，最优选地浓度为约1mg/ml的转导增强剂。优选地，泊洛沙姆synperonic f108在预刺激或共刺激步骤中与造血细胞，更优选地hsc以以上公开的浓度和/或密度中的任一者接触。在某个实施方式中，浓度为0.5e6个细胞/ml的hsc可以用浓度为0.5mg/ml的泊洛沙姆synperonic f108预刺激和/或共刺激。在某个实施方式中，浓度为0.5e6个细胞/ml至1e6个细胞/ml或密度为2e6/cm2的hsc可以用浓度为1mg/ml的泊洛沙姆synperonic f108预刺激和/或共刺激。在某个实施方式中，浓度为0.5e6个细胞/ml至1e6个细胞/ml或密度为2e6/cm2的hsc可以用浓度为2mg/ml的泊洛沙姆synperonic f108预刺激和/或共刺激。
[0219]
在某些实施方式中，本发明涉及用作转导增强剂的化合物二甲基亚砜(dmso)。也就是说，本发明至少部分地基于以下令人惊讶的发现：dmso可以提高用基因疗法载体，特别是逆转录病毒载体转导靶细胞的效率。因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述转导增强剂是dmso。
[0220]
二甲基亚砜(dmso)是一种具有式(ch3)2so的有机硫化合物。这种无色液体是一种重要的极性非质子溶剂，其溶解极性和非极性化合物两者并且可与多种有机溶剂和水混溶。
[0221]
本发明人已经表明，dmso在以1％(v/v)的浓度与靶细胞接触时提高了靶细胞的转导效率。因此，在某个实施方式中，dmso可用作浓度范围为约0.1％(v/v)至约10％(v/v)，优选地浓度范围为约0.25％(v/v)至约5％(v/v)，更优选地浓度范围为约0.5％(v/v)至约2％(v/v)，最优选浓度为约1％(v/v)的转导增强剂。优选地，dmso在预刺激或共刺激步骤中与造血细胞，更优选地hsc以以上公开的浓度和/或密度中的任一者接触。在某个实施方式中，浓度为0.5e6个细胞/ml的hsc可以用浓度为0.5％(v/v)的dmso预刺激和/或共刺激。在某个实施方式中，浓度为0.5e6个细胞/ml至1e6个细胞/ml或密度为2e6/cm2的hsc可以用浓度为
1％(v/v)的dmso预刺激和/或共刺激。在某个实施方式中，浓度为0.5e6个细胞/ml至1e6个细胞/ml或密度为2e6/cm2的hsc可以用浓度为2％(v/v)的dmso预刺激和/或共刺激。
[0222]
本发明人已经惊奇地表明，本文所公开的化合物的某些组合可能导致增强的转导效率，并且必须被认为与多种转导增强剂在所有这些工序中的未来应用相关。
[0223]
此外，市售的化合物已被描述为增强用慢病毒载体对各种人类靶细胞的转导。本发明人已经惊奇地表明，通过将与附加的转导增强剂组合，可以进一步提高的转导效率。lentiboost由泊洛沙姆f108和聚凝胺的组合组成，然而，这两种化合物的确切比率尚未在本领域中公开。这两种化合物的例示性混合物在实施例2中公开。
[0224]
也就是说，在某些实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中转导增强剂是和两性霉素b的组合。
[0225]
被建议以1mg/ml的浓度使用。在1mg/ml的存在下用慢病毒载体以moi为10转导hsc，导致载体拷贝数(vcn)为约5。本发明人已经表明，1mg/ml的与0.5μg/ml至1μg/ml的两性霉素b的组合导致在可比条件下vcn在8至10范围内。有趣的是，简单地将的浓度增加到2mg/ml只会导致vcn为约6。因此，本发明人已经惊奇地表明，和两性霉素b的组合导致转导效率增加。
[0226]
可以以任何合适的浓度与两性霉素b组合使用作为转导增强剂。在某些实施方式中，和两性霉素b的组合可包含浓度范围为约0.1mg/ml至约10mg/ml的以及浓度范围为约0.1μg/ml至约10μg/ml的两性霉素b。在某些实施方式中，和两性霉素b的组合可包含浓度范围为约0.1mg/ml至约10mg/ml的以及浓度范围为约0.1μg/ml至约10μg/ml的两性霉素b。在某些实施方式中，可以以在约0.1mg/ml至约10mg/ml范围内的终浓度与终浓度在约0.1μg/ml至约10μg/ml范围内的两性霉素b组合添加到靶细胞中。优选地，可以以在约0.1mg/ml至约3mg/ml范围内的终浓度与终浓度在约0.1μg/ml至约3μg/ml范围内的两性霉素b组合添加到靶细胞中。更优选地，可以以在约0.5mg/ml至约2mg/ml范围内的终浓度与终浓度在约0.5μg/ml至约2μg/ml范围内的两性霉素b组合添加到靶细胞中。最优选地，可以以约1mg/ml的终浓度与终浓度为约0.75μg/ml的两性霉素b组合添加到靶细胞中。优选地，和两性霉素b的组合在预刺激或共刺激步骤中与造血细胞，更优选地hsc以以上公开的浓度和/或密度中的任一者接触。在某个实施方式中，浓度为0.5e6个细胞/ml至1e6个细胞/ml或密度为2e6/cm2的hsc可以用1mg/ml的和0.5μg/ml的两性霉素b的组合预刺激和/或共刺激。在某个实施方式中，浓度为0.5e6个细胞/ml至1e6个细胞/ml或密度为2e6/cm2的hsc可以用1mg/ml的和0.75μg/ml的两性霉素b的组合预刺激和/或共刺激。在某个实施方式中，浓度为0.5e6个细胞/ml至1e6个细胞/ml或密度为2e6/cm2的hsc可以用1mg/ml的和1μg/ml的两性霉素b的组合预刺激和/或共刺激。
[0227]
在某些实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述转导增强剂是
和水飞蓟宾的组合。
[0228]
发明人已经表明，与单独的相比，当与水飞蓟宾组合使用时，会导致更高的转导效率。可以以任何合适的浓度与水飞蓟宾组合使用作为转导增强剂。在某些实施方式中，与水飞蓟宾的组合可以包含浓度范围为约0.1mg/ml至约10mg/ml的和浓度范围为约0.1μm至约25μm的水飞蓟宾。在某些实施方式中，可以以在约0.1μg/ml至约10mg/ml范围内的终浓度与终浓度在约0.1μm至约25μm范围内的水飞蓟宾组合添加到靶细胞中。优选地，可以以在约0.1mg/ml至约3mg/ml范围内的终浓度与终浓度在约0.1μm至约10μm范围内的水飞蓟宾组合添加到靶细胞中。更优选地，可以以在约0.5mg/ml至约2mg/ml范围内的终浓度与终浓度在约1μm至约10μm范围内的水飞蓟宾组合添加到靶细胞中。最优选地，可以以约1mg/ml的终浓度与终浓度为约5μm的水飞蓟宾组合添加到靶细胞中。优选地，和水飞蓟宾的组合在预刺激或共刺激步骤中与造血细胞，更优选地hsc以以上公开的浓度和/或密度中的任一者接触。在某个实施方式中，浓度为0.5e6个细胞/ml至1e6个细胞/ml或密度为2e6/cm2的hsc可以用1mg/ml的lentiboost和1μm的水飞蓟宾的组合预刺激和/或共刺激。在某个实施方式中，浓度为0.5e6个细胞/ml至1e6个细胞/ml或密度为2e6/cm2的hsc可以用1mg/ml的lentiboost和5μm的水飞蓟宾的组合预刺激和/或共刺激。
[0229]
在某些实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述转导增强剂是和米哚妥林的组合。
[0230]
发明人已经表明，与单独的相比，当与米哚妥林组合使用时，会导致更高的转导效率。可以以任何合适的浓度与米哚妥林组合使用作为转导增强剂。在某些实施方式中，和米哚妥林的组合可包含浓度范围为约0.1mg/ml至约10mg/ml的以及浓度范围为约50nm至约20,000nm的米哚妥林。在某些实施方式中，可以以在约0.1μg/ml至约10mg/ml范围内的终浓度与终浓度在约50nm至约20,000nm范围内的米哚妥林组合添加到靶细胞中。优选地，可以以在约0.1mg/ml至约3mg/ml范围内的终浓度与终浓度在约50nm至约5,000nm范围内的米哚妥林组合添加到靶细胞中。更优选地，可以以在约0.5mg/ml至约2mg/ml范围内的终浓度与终浓度在约50nm至约500nm范围内的米哚妥林组合添加到靶细胞中。最优选地，可以以约1mg/ml的终浓度与终浓度为约400nm的米哚妥林组合添加到靶细胞中。优选地，和米哚妥林的组合在预刺激或共刺激步骤中与造血细胞，更优选地hsc以以上公开的浓度和/或密度中的任一者接触。在某个实施方式中，浓度为0.5e6个细胞/ml至1e6个细胞/ml或密度为2e6/cm2的hsc可以用1mg/ml的和100nm的米哚妥林的组合预刺激和/或共刺激。在某个实施方式中，浓度为0.5e6个细胞/ml至1e6个细胞/ml或密度为2e6/cm2的hsc可以用1mg/ml的和200nm的米哚妥林的组合预刺激和/或共刺激。在某个实施方式中，浓度为0.5e6个细胞/ml至1e6个细胞/ml或密度为2e6/cm2的hsc可以用1mg/ml的和400nm的米哚妥林
的组合预刺激和/或共刺激。
[0231]
在某些实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中转导增强剂是泊洛沙姆f108和两性霉素b的组合。
[0232]
本发明人已经表明，泊洛沙姆f108当与两性霉素b组合使用时，与这两种化合物中的单独任何一者相比，导致更高的转导效率。泊洛沙姆f108可以以任何合适的浓度与两性霉素b组合使用作为转导增强剂。在某些实施方式中，泊洛沙姆f108和两性霉素b的组合可包含浓度范围为约0.1mg/ml至约10mg/ml的泊洛沙姆f108，以及浓度范围为约0.1μg/ml至约10μg/ml的两性霉素b。在某些实施方式中，泊洛沙姆f108可以以在约0.1mg/ml至约10mg/ml范围内的终浓度与终浓度在约0.1μg/ml至约10μg/ml范围内的两性霉素b组合添加到靶细胞中。优选地，泊洛沙姆f108可以以在约0.1mg/ml至约3mg/ml范围内的终浓度与终浓度在约0.1μg/ml至约3μg/ml范围内的两性霉素b组合添加到靶细胞中。更优选地，泊洛沙姆f108可以以在约0.5mg/ml至约2mg/ml范围内的终浓度与终浓度在约0.5μg/ml至约2μg/ml范围内的两性霉素b组合添加到靶细胞中。最优选地，泊洛沙姆f108可以以约1mg/ml的终浓度与终浓度为约0.75μg/ml的两性霉素b组合添加到靶细胞中。优选地，泊洛沙姆f108和两性霉素b的组合在预刺激或共刺激步骤中与造血细胞，更优选地hsc以以上公开的浓度和/或密度中的任一者接触。在某个实施方式中，浓度为0.5e6个细胞/ml至1e6个细胞/ml或密度为2e6/cm2的hsc可以用1mg/ml的泊洛沙姆f108和0.5μg/ml的两性霉素b的组合预刺激和/或共刺激。在某个实施方式中，浓度为0.5e6个细胞/ml至1e6个细胞/ml或密度为2e6/cm2的hsc可以用1mg/ml的泊洛沙姆f108和0.75μg/ml的两性霉素b的组合预刺激和/或共刺激。在某个实施方式中，浓度为0.5e6个细胞/ml至1e6个细胞/ml或密度为2e6/cm2的hsc可以用1mg/ml的泊洛沙姆f108和1μg/ml的两性霉素b的组合预刺激和/或共刺激。
[0233]
在某些实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中转导增强剂是泊洛沙姆f108和水飞蓟宾的组合。
[0234]
本发明人已经表明，泊洛沙姆f108当与水飞蓟宾组合使用时，与这两种化合物中的单独任何一者相比，导致更高的转导效率。泊洛沙姆f108可以以任何合适的浓度与水飞蓟宾组合使用作为转导增强剂。在某些实施方式中，泊洛沙姆f108和水飞蓟宾的组合可包含浓度范围为约0.1mg/ml至约10mg/ml的泊洛沙姆f108和浓度范围为约0.1μm至约25μm的水飞蓟宾。在某些实施方式中，泊洛沙姆f108可以以在约0.1μg/ml至约10mg/ml范围内的终浓度与终浓度在约0.1μm至约25μm范围内的水飞蓟宾组合添加到靶细胞中。优选地，泊洛沙姆f108可以以在约0.1mg/ml至约3mg/ml范围内的终浓度与终浓度在约0.1μm至约10μm范围内的水飞蓟宾组合添加到靶细胞中。更优选地，泊洛沙姆f108可以以在约0.5mg/ml至约2mg/ml范围内的终浓度与终浓度在约1μm至约10μm范围内的水飞蓟宾组合添加到靶细胞中。最优选地，泊洛沙姆f108可以以约1mg/ml的终浓度与终浓度为约5μm的水飞蓟宾组合添加到靶细胞中。优选地，泊洛沙姆f108和两性霉素b的组合在预刺激或共刺激步骤中与造血细胞，更优选地hsc以以上公开的浓度和/或密度中的任一者接触。在某个实施方式中，浓度为0.5e6个细胞/ml至1e6个细胞/ml或密度为2e6/cm2的hsc可以用1mg/ml的泊洛沙姆f108和5μm的水飞蓟宾的组合预刺激和/或共刺激。
[0235]
在某些实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中转导增强剂是泊洛沙姆f108和米哚妥林的组合。
[0236]
本发明人已经表明，泊洛沙姆f108当与米哚妥林组合使用时，与这两种化合物中的单独任何一者相比，导致更高的转导效率。泊洛沙姆f108可以以任何合适的浓度与米哚妥林组合使用作为转导增强剂。在某些实施方式中，泊洛沙姆f108和米哚妥林的组合可包含浓度范围为约0.1mg/ml至约10mg/ml的泊洛沙姆f108，以及浓度范围为约50nm至约20,000nm的米哚妥林。在某些实施方式中，泊洛沙姆f108可以以在约0.1μg/ml至约10mg/ml范围内的终浓度与终浓度在约50nm至约20,000nm范围内的米哚妥林组合添加到靶细胞中。优选地，泊洛沙姆f108可以以在约0.1mg/ml至约3mg/ml范围内的终浓度与终浓度在约50nm至约5,000nm范围内的米哚妥林组合添加到靶细胞中。更优选地，泊洛沙姆f108可以以在约0.5mg/ml至约2mg/ml范围内的终浓度与终浓度在约50nm至约500nm范围内的米哚妥林组合添加到靶细胞中。最优选地，泊洛沙姆f108可以以约1mg/ml的终浓度与终浓度为约400nm的米哚妥林组合添加到靶细胞中。优选地，泊洛沙姆f108和米哚妥林的组合在预刺激或共刺激步骤中与造血细胞，更优选地hsc以以上公开的浓度和/或密度中的任一者接触。在某个实施方式中，浓度为0.5e6个细胞/ml至1e6个细胞/ml或密度为2e6/cm2的hsc可以用1mg/ml的泊洛沙姆f108和100μm的米哚妥林的组合预刺激和/或共刺激。在某个实施方式中，浓度为0.5e6个细胞/ml至1e6个细胞/ml或密度为2e6/cm2的hsc可以用1mg/ml的泊洛沙姆f108和200μm的米哚妥林的组合预刺激和/或共刺激。在某个实施方式中，浓度为0.5e6个细胞/ml至1e6个细胞/ml或密度为2e6/cm2的hsc可以用1mg/ml的泊洛沙姆f108和400μm的米哚妥林的组合预刺激和/或共刺激。
[0237]
在某些实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述转导增强剂是水飞蓟宾和peg-pcl-peg的组合。
[0238]
本发明人已经表明，水飞蓟宾当与peg-pcl-peg组合使用时，与这两种化合物中的单独任何一者相比，导致更高的转导效率。水飞蓟宾可以以任何合适的浓度与peg-pcl-peg组合使用作为转导增强剂。在某些实施方式中，水飞蓟宾和peg-pcl-peg的组合可包含浓度范围为约0.1μm至约25μm的水飞蓟宾和浓度范围为约0.1μg/ml至约5,000μg/ml的peg-pcl-peg。在某些实施方式中，水飞蓟宾可以以在约0.1μm至约25μm范围内的终浓度与终浓度在约0.1μg/ml至约5,000μg/ml范围内的peg-pcl-peg组合添加到靶细胞中。优选地，水飞蓟宾可以以在约0.1μm至约10μm范围内的终浓度与终浓度在约0.1μg/ml至约5,000μg/ml范围内的peg-pcl-peg组合添加到靶细胞中。更优选地，水飞蓟宾可以以在约1μm至约10μm范围内的终浓度与终浓度在约5μg/ml至约1,000μg/ml范围内的peg-pcl-peg组合添加到靶细胞中。最优选地，水飞蓟宾可以以约5μm的终浓度与终浓度为约10μg/ml的peg-pcl-peg组合添加到靶细胞中。优选地，水飞蓟宾和peg-pcl-peg的组合在预刺激或共刺激步骤中与造血细胞，更优选地hsc以以上公开的浓度和/或密度中的任一者接触。在某个实施方式中，浓度为0.5e6个细胞/ml至1e6个细胞/ml或密度为2e6/cm2的hsc可以用5μm的水飞蓟宾和10μg/ml的peg-pcl-peg的组合预刺激和/或共刺激。
[0239]
在某些实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中转导增强剂是两性霉素b和依维莫司的组合。
[0240]
本发明人已经表明，两性霉素b当与依维莫司组合使用时，与这两种化合物中的单独任何一者相比，导致更高的转导效率。两性霉素b可以以任何合适的浓度与依维莫司组合使用作为转导增强剂。在某些实施方式中，两性霉素b和依维莫司的组合可包含浓度范围为
约0.1μg/ml至约10μg/ml的两性霉素b，以及浓度范围为约0.1μm至约10μm的依维莫司。在某些实施方式中，两性霉素b可以以在约0.1μg/ml至约10μg/ml范围内的终浓度与终浓度在约0.1μm至约10μm范围内的依维莫司组合添加到靶细胞中。优选地，两性霉素b可以以在约0.1μg/ml至约3μg/ml范围内的终浓度与终浓度在约0.2μm至约7.5μm范围内的依维莫司组合添加到靶细胞中。更优选地，两性霉素b可以以在约0.5μg/ml至约2μg/ml范围内的终浓度与终浓度在约0.5μm至约5μm范围内的依维莫司组合添加到靶细胞中。最优选地，两性霉素b可以以约1μg/ml的终浓度与终浓度为约1μm的依维莫司组合添加到靶细胞中。优选地，两性霉素b和依维莫司的组合在预刺激或共刺激步骤中与造血细胞，更优选地hsc以以上公开的浓度和/或密度中的任一者接触。在某个实施方式中，浓度为0.5e6个细胞/ml至1e6个细胞/ml或密度为2e6/cm2的hsc可以用0.5μg/ml的两性霉素b和1μm的依维莫司的组合预刺激和/或共刺激。在某个实施方式中，浓度为0.5e6个细胞/ml至1e6个细胞/ml或密度为2e6/cm2的hsc可以用0.75μg/ml的两性霉素b和1μm的依维莫司的组合预刺激和/或共刺激。在某个实施方式中，浓度为0.5e6个细胞/ml至1e6个细胞/ml或密度为2e6/cm2的hsc可以用1μg/ml的两性霉素b和1μm的依维莫司的组合预刺激和/或共刺激。
[0241]
在某些实施方式中，本发明涉及鱼精蛋白盐与本文所公开的转导增强剂中的一种或多种转导增强剂的组合，所述组合用于用作转导增强剂。
[0242]
如本文所用的“鱼精蛋白”是指与核酸呈盐状组合存在于精细胞中的一组强碱性蛋白质的总称。鱼精蛋白可以从例如鲑鱼(鲑精蛋白)、虹鳟鱼(虹鳟精蛋白(iridine))、鲱鱼(鲱精蛋白)、鲟鱼(鲟精蛋白)或西班牙鲭鱼或金枪鱼(thynnine)获得，并且多种鱼精蛋白盐是可商购获得的。应当理解的是，特定鱼精蛋白的肽组合物可以根据其获自的鱼为哪个科、属或种而变化。鱼精蛋白通常含有四种主要组分，即含有约30个至32个残基的单链肽，所述残基中的约21个至22个残基是精氨酸残基。对于四种主要组分中的每一种主要组分，n末端都是脯氨酸，并且由于序列中不存在其他氨基，因此在这种情况下，特定盐对鱼精蛋白的化学改性预计是同质的。
[0243]
在本发明中，用于本发明的方法的鱼精蛋白盐可包括但不限于鱼精蛋白的氯盐、硫酸盐、乙酸盐、溴盐、己酸盐、三氟乙酸盐、hco3、丙酸盐、乳酸盐、甲酸盐、硝酸盐、柠檬酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、酒石酸盐或高氯酸盐，或任何两种鱼精蛋白盐的混合物。
[0244]
在本发明的方法中使用的鱼精蛋白盐来自鲑鱼。在另一个实施方式中，在本发明的方法中使用的鱼精蛋白盐来自鲱鱼。在另一个实施方式中，在本发明的方法中使用的鱼精蛋白盐来自虹鳟鱼。在另一个实施方式中，在本发明的方法中使用的鱼精蛋白盐来自金枪鱼。
[0245]
鱼精蛋白可以任何盐形式添加到预孵育和/或共孵育培养基中，前提条件是盐的阴离子组分当在溶液中时不抑制靶细胞的转导效率。可在本发明的方法中使用的优选鱼精蛋白盐是氯化鱼精蛋白和硫酸鱼精蛋白。在某个实施方式中，将鱼精蛋白作为gmp级氯化鱼精蛋白添加到预孵育和/或共孵育培养基中。
[0246]
本发明人已经表明，鱼精蛋白盐在以4μg/ml的浓度与靶细胞接触时提高了靶细胞的转导效率。因此，在某个实施方式中，鱼精蛋白盐可以用作浓度范围为约0.05μg/ml至约25μg/ml，优选地浓度范围为约0.1μg/ml至约10μg/ml，更优选地浓度范围为约1μg/ml至约10μg/ml，最优选地浓度为约4μg/ml的转导增强剂。优选地，鱼精蛋白盐在预刺激和/或共刺
激步骤中与造血细胞，更优选地hsc以以上公开的浓度和/或密度中的任一者接触。在某个实施方式中，浓度为0.5e6个细胞/ml至1e6个细胞/ml或密度为2e6/cm2的hsc可以用浓度为4μg/ml的鱼精蛋白盐预刺激和/或共刺激。
[0247]
在某些实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中转导增强剂是鱼精蛋白盐和两性霉素b的组合。
[0248]
本发明人已经表明，鱼精蛋白盐当与两性霉素b组合使用时，与这两种化合物中的单独任何一者相比，导致更高的转导效率。鱼精蛋白盐可以以任何合适的浓度与两性霉素b组合使用作为转导增强剂。在某些实施方式中，鱼精蛋白盐和两性霉素b的组合可包含浓度范围为约0.05μg/ml至约25μg/ml的鱼精蛋白盐，以及浓度范围为约0.1μg/ml至约10μg/ml的两性霉素b。在某些实施方式中，鱼精蛋白盐可以以在约0.05μg/ml至约25μg/ml范围内的终浓度与终浓度在约0.1μg/ml至约10μg/ml范围内的两性霉素b组合添加到靶细胞中。优选地，鱼精蛋白盐可以以在约0.1μg/ml至约10μg/ml范围内的终浓度与终浓度在约0.1μg/ml至约3μg/ml范围内的两性霉素b组合添加到靶细胞中。更优选地，鱼精蛋白盐可以以在约1μg/ml至约10μg/ml范围内的终浓度与终浓度在约0.5μg/ml至约2μg/ml范围内的两性霉素b组合添加到靶细胞中。最优选地，鱼精蛋白盐可以以约4μg/ml的终浓度与终浓度为约1μg/ml的两性霉素b组合添加到靶细胞中。优选地，鱼精蛋白盐和两性霉素b的组合在预刺激和/或共刺激步骤中与造血细胞，更优选地hsc以以上公开的浓度和/或密度中的任一者接触。在某个实施方式中，浓度为0.5e6个细胞/ml至1e6个细胞/ml或密度为2e6/cm2的hsc可以用4μg/ml的鱼精蛋白盐和0.5μg/ml的两性霉素b的组合预刺激和/或共刺激。在某个实施方式中，浓度为0.5e6个细胞/ml至1e6个细胞/ml或密度为2e6/cm2的hsc可以用4μg/ml的鱼精蛋白盐和0.75μg/ml的两性霉素b的组合预刺激和/或共刺激。在某个实施方式中，浓度为0.5e6个细胞/ml至1e6个细胞/ml或密度为2e6/cm2的hsc可以用4μg/ml的鱼精蛋白盐和1μg/ml的两性霉素b的组合预刺激和/或共刺激。
[0249]
在某些实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中转导增强剂是鱼精蛋白盐和peg-pcl-peg的组合。
[0250]
本发明人已经表明，鱼精蛋白盐当与peg-pcl-peg组合使用时，与这两种化合物中的单独任何一者相比，导致更高的转导效率。鱼精蛋白盐可以以任何合适的浓度与peg-pcl-peg组合使用作为转导增强剂。在某些实施方式中，鱼精蛋白盐和peg-pcl-peg的组合可包含浓度范围为约0.05μg/ml至约25μg/ml的鱼精蛋白盐，以及浓度范围为约0.1μg/ml至约5,000μg/ml的peg-pcl-peg。在某些实施方式中，鱼精蛋白盐可以以在约0.05μg/ml至约25μg/ml范围内的终浓度与终浓度在约0.1μg/ml至约5,000μg/ml范围内的peg-pcl-peg组合添加到靶细胞中。优选地，鱼精蛋白盐可以以在约0.1μg/ml至约10μg/ml范围内的终浓度与终浓度在约1μg/ml至约2,500μg/ml范围内的peg-pcl-peg组合添加到靶细胞中。更优选地，鱼精蛋白盐可以以在约1μg/ml至约10μg/ml范围内的终浓度与终浓度在约5μg/ml至约1,000μg/ml范围内的peg-pcl-peg组合添加到靶细胞中。最优选地，鱼精蛋白盐可以以约4μg/ml的终浓度与终浓度为约10μg/ml的peg-pcl-peg组合添加到靶细胞中。优选地，鱼精蛋白盐和peg-pcl-peg的组合在预刺激和/或共刺激步骤中与造血细胞，更优选地hsc以以上公开的浓度和/或密度中的任一者接触。在某个实施方式中，浓度为0.5e6个细胞/ml至1e6个细胞/ml或密度为2e6/cm2的hsc可以用4μg/ml的鱼精蛋白盐和10μg/ml的peg-pcl-peg的
组合预刺激和/或共刺激。
[0251]
也就是说，在某些实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中转导增强剂是鱼精蛋白盐和水飞蓟宾的组合。
[0252]
本发明人已经表明，鱼精蛋白盐当与水飞蓟宾组合使用时，与这两种化合物中的单独任何一者相比，导致更高的转导效率。鱼精蛋白盐可以以任何合适的浓度与水飞蓟宾组合使用作为转导增强剂。在某些实施方式中，鱼精蛋白盐和水飞蓟宾的组合可包含浓度范围为约0.05μg/ml至约25μg/ml的鱼精蛋白盐，以及浓度范围为约0.1μm至约25μm的水飞蓟宾。在某些实施方式中，鱼精蛋白盐可以以在约0.05μg/ml至约25μg/ml范围内的终浓度与终浓度在约0.1μm至约25μm范围内的水飞蓟宾组合添加到靶细胞中。优选地，鱼精蛋白盐可以以在约0.1μg/ml至约10μg/ml范围内的终浓度与终浓度在约0.1μm至约10μm范围内的水飞蓟宾组合添加到靶细胞中。更优选地，鱼精蛋白盐可以以在约1μg/ml至约10μg/ml范围内的终浓度与终浓度在约1μm至约10μm范围内的水飞蓟宾组合添加到靶细胞中。最优选地，鱼精蛋白盐可以以约4μg/ml的终浓度与终浓度为约5μm的水飞蓟宾组合添加到靶细胞中。优选地，鱼精蛋白盐和水飞蓟宾的组合在预刺激和/或共刺激步骤中与造血细胞，更优选地hsc以以上公开的浓度和/或密度中的任一者接触。在某个实施方式中，浓度为0.5e6个细胞/ml至1e6个细胞/ml或密度为2e6/cm2的hsc可以用4μg/ml的鱼精蛋白盐和5μm的水飞蓟宾的组合预刺激和/或共刺激。
[0253]
在某些实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中转导增强剂是鱼精蛋白盐和白藜芦醇的组合。
[0254]
本发明人已经表明，鱼精蛋白盐当与白藜芦醇组合使用时，与这两种化合物中的单独任何一者相比，导致更高的转导效率。鱼精蛋白盐可以以任何合适的浓度与白藜芦醇组合使用作为转导增强剂。在某些实施方式中，鱼精蛋白盐和白藜芦醇的组合可包含浓度范围为约0.05μg/ml至约25μg/ml的鱼精蛋白盐，以及浓度范围为约0.1μm至约10μm的白藜芦醇。在某些实施方式中，鱼精蛋白盐可以以在约0.05μg/ml至约25μg/ml范围内的终浓度与终浓度在约0.1μm至约25μm范围内的白藜芦醇组合添加到靶细胞中。优选地，鱼精蛋白盐可以以在约0.1μg/ml至约10μg/ml范围内的终浓度与终浓度在约1μm至约7.5μm范围内的白藜芦醇组合添加到靶细胞中。更优选地，鱼精蛋白盐可以以在约1μg/ml至约10μg/ml范围内的终浓度与终浓度在约2.5μm至约7.5μm范围内的白藜芦醇组合添加到靶细胞中。最优选地，鱼精蛋白盐可以以约4μg/ml的终浓度与终浓度为约5μm的白藜芦醇组合添加到靶细胞中。优选地，鱼精蛋白盐和白藜芦醇的组合在预刺激和/或共刺激步骤中与造血细胞，更优选地hsc以以上公开的浓度和/或密度中的任一者接触。在某个实施方式中，浓度为0.5e6个细胞/ml至1e6个细胞/ml或密度为2e6/cm2的hsc可以用4μg/ml的鱼精蛋白盐和5μm的白藜芦醇的组合预刺激和/或共刺激。
[0255]
在某些实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中转导增强剂是鱼精蛋白盐和米哚妥林的组合。
[0256]
本发明人已经表明，鱼精蛋白盐当与米哚妥林组合使用时，与这两种化合物中的单独任何一者相比，导致更高的转导效率。鱼精蛋白盐可以以任何合适的浓度与米哚妥林组合使用作为转导增强剂。在某些实施方式中，鱼精蛋白盐和米哚妥林的组合可包含浓度范围为约0.05μg/ml至约25μg/ml的鱼精蛋白盐，以及浓度范围为约50nm至约20,000nm的米
哚妥林。在某些实施方式中，鱼精蛋白盐可以以在约0.05μg/ml至约25μg/ml范围内的终浓度与终浓度在约50nm至约20,000nm范围内的米哚妥林组合添加到靶细胞中。优选地，鱼精蛋白盐可以以在约0.1μg/ml至约10μg/ml范围内的终浓度与终浓度在约50nm至约5,000nm范围内的米哚妥林组合添加到靶细胞中。更优选地，鱼精蛋白盐可以以在约1μg/ml至约10μg/ml范围内的终浓度与终浓度在约50nm至约500nm范围内的米哚妥林组合添加到靶细胞中。最优选地，鱼精蛋白盐可以以约4μg/ml的终浓度与终浓度为约400nm的米哚妥林组合添加到靶细胞中。优选地，鱼精蛋白盐和米哚妥林的组合在预刺激和/或共刺激步骤中与造血细胞，更优选地hsc以以上公开的浓度和/或密度中的任一者接触。在某个实施方式中，浓度为0.5e6个细胞/ml至1e6个细胞/ml或密度为2e6/cm2的hsc可以用4μg/ml的鱼精蛋白盐和100nm的米哚妥林的组合预刺激和/或共刺激。在某个实施方式中，浓度为0.5e6个细胞/ml至1e6个细胞/ml或密度为2e6/cm2的hsc可以用4μg/ml的鱼精蛋白盐和200nm的米哚妥林的组合预刺激和/或共刺激。在某个实施方式中，浓度为0.5e6个细胞/ml至1e6个细胞/ml或密度为2e6/cm2的hsc可以用4μg/ml的鱼精蛋白盐和400nm的米哚妥林的组合预刺激和/或共刺激。
[0257]
在某些实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中转导增强剂是鱼精蛋白盐和制霉菌素的组合。
[0258]
本发明人已经表明，鱼精蛋白盐当与制霉菌素组合使用时，与这两种化合物中的单独任何一者相比，导致更高的转导效率。鱼精蛋白盐可以以任何合适的浓度与制霉菌素组合使用作为转导增强剂。在某些实施方式中，鱼精蛋白盐和制霉菌素的组合可包含浓度范围为约0.05μg/ml至约25μg/ml的鱼精蛋白盐，以及浓度范围为约1μm至约1,000μm的制霉菌素。在某些实施方式中，鱼精蛋白盐可以以在约0.05μg/ml至约25μg/ml范围内的终浓度与终浓度在约1μm至约1,000μm范围内的制霉菌素组合添加到靶细胞中。优选地，鱼精蛋白盐可以以在约0.1μg/ml至约10μg/ml范围内的终浓度与终浓度在约5μm至约500μm范围内的制霉菌素组合添加到靶细胞中。更优选地，鱼精蛋白盐可以以在约1μg/ml至约10μg/ml范围内的终浓度与终浓度在约50μm至约150μm范围内的制霉菌素组合添加到靶细胞中。最优选地，鱼精蛋白盐可以以约4μg/ml的终浓度与终浓度为约100μm的制霉菌素组合添加到靶细胞中。优选地，鱼精蛋白盐和制霉菌素的组合在预刺激和/或共刺激步骤中与造血细胞，更优选地hsc以以上公开的浓度和/或密度中的任一者接触。在某个实施方式中，浓度为0.5e6个细胞/ml至1e6个细胞/ml或密度为2e6/cm2的hsc可以用4μg/ml的鱼精蛋白盐和100μm的制霉菌素的组合预刺激和/或共刺激。
[0259]
在某些实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中转导增强剂是鱼精蛋白盐和纳他霉素的组合。
[0260]
本发明人已经表明，鱼精蛋白盐当与纳他霉素组合使用时，与这两种化合物中的单独任何一者相比，导致更高的转导效率。鱼精蛋白盐可以以任何合适的浓度与纳他霉素组合使用作为转导增强剂。在某些实施方式中，鱼精蛋白盐和纳他霉素的组合可包含浓度范围为约0.05μg/ml至约25μg/ml的鱼精蛋白盐，以及浓度范围为约0.05μm至约500μm的纳他霉素。在某些实施方式中，鱼精蛋白盐可以以在约0.05μg/ml至约25μg/ml范围内的终浓度与终浓度在约0.05μm至约500μm范围内的纳他霉素组合添加到靶细胞中。优选地，鱼精蛋白盐可以以在约0.1μg/ml至约10μg/ml范围内的终浓度与终浓度在约0.05μm至约10μm范围
内的纳他霉素组合添加到靶细胞中。更优选地，鱼精蛋白盐可以以在约1μg/ml至约10μg/ml范围内的终浓度与终浓度在约1μm至约5μm范围内的纳他霉素组合添加到靶细胞中。最优选地，鱼精蛋白盐可以以约4μg/ml的终浓度与终浓度为约3μm的纳他霉素组合添加到靶细胞中。优选地，鱼精蛋白盐和纳他霉素的组合在预刺激和/或共刺激步骤中与造血细胞，更优选地hsc以以上公开的浓度和/或密度中的任一者接触。在某个实施方式中，浓度为0.5e6个细胞/ml至1e6个细胞/ml或密度为2e6/cm2的hsc可以用4μg/ml的鱼精蛋白盐和3μm的纳他霉素的组合预刺激和/或共刺激。
[0261]
在某些实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中转导增强剂是鱼精蛋白盐、两性霉素b和依维莫司的组合。
[0262]
本发明人已经表明，鱼精蛋白盐当与两性霉素b和依维莫司组合使用时，与这两种化合物中的单独任何一者相比，导致更高的转导效率。鱼精蛋白盐可以以任何合适的浓度与两性霉素b和依维莫司组合使用作为转导增强剂。在某些实施方式中，鱼精蛋白盐、两性霉素b和依维莫司的组合可包含浓度范围为约0.05μg/ml至约25μg/ml的鱼精蛋白、浓度范围为约0.1μg/ml至约10μg/ml的两性霉素b和浓度范围为约0.1μm至约10μm的依维莫司。在某些实施方式中，鱼精蛋白盐可以以在约0.05μg/ml至约25μg/ml范围内的终浓度与终浓度在约0.1μg/ml至约10μg/ml范围内的两性霉素b和终浓度在约0.1μm至约10μm范围内的依维莫司组合添加到靶细胞中。优选地，鱼精蛋白盐可以以在约0.1μg/ml至约10μg/ml范围内的终浓度与终浓度在约0.1μg/ml至约3μg/ml范围内的两性霉素b和终浓度在约0.2μm至约7.5μm范围内的依维莫司组合添加到靶细胞中。更优选地，鱼精蛋白盐可以以在约1μg/ml至约10μg/ml范围内的终浓度与终浓度在约0.5μg/ml至约2μg/ml范围内的两性霉素b和终浓度在约0.5μm至约5μm范围内的依维莫司组合添加到靶细胞中。最优选地，鱼精蛋白盐可以以约4μg/ml的终浓度与终浓度为约1μg/ml的两性霉素b和终浓度为约1μm的依维莫司组合添加到靶细胞中。优选地，鱼精蛋白盐、两性霉素b和依维莫司的组合在预刺激和/或共刺激步骤中与造血细胞，更优选地hsc以以上公开的浓度中的任一者接触。在某个实施方式中，浓度为0.5e6个细胞/ml至1e6个细胞/ml或密度为2e6/cm2的hsc可以用4μg/ml的鱼精蛋白盐、0.5μg/ml的两性霉素b和1μm的依维莫司的组合预刺激和/或共刺激。在某个实施方式中，浓度为0.5e6个细胞/ml至1e6个细胞/ml或密度为2e6/cm2的hsc可以用4μg/ml的鱼精蛋白盐、0.75μg/ml的两性霉素b和1μm的依维莫司的组合预刺激和/或共刺激。在某个实施方式中，浓度为0.5e6个细胞/ml至1e6个细胞/ml或密度为2e6/cm2的hsc可以用4μg/ml的鱼精蛋白盐、1μg/ml的两性霉素b和1μm的依维莫司的组合预刺激和/或共刺激。
[0263]
可以鉴定出通过基因疗法载体增强人类细胞的转导的几种化合物和化合物组合。特别地，可以鉴定新颖的化合物，所述新颖的化合物显示为当与包含处于内部启动子控制下的感兴趣的转基因，特别是编码p47phox的cdna的逆转录病毒载体，特别是慢病毒自灭活(sin)载体接触时，介导靶细胞，特别是人cd34阳性hsc的逆转录病毒转导效率的增加，所述内部启动子为例如骨髓特异性mir223启动子、猿猴病毒40(sv40)(例如，早期或晚期)、巨细胞病毒(cmv)(例如，立即早期)、莫洛尼鼠白血病病毒(momlv)、劳斯氏肉瘤病毒(rsv)和单纯疱疹病毒(hsv)胸苷激酶启动子，特别是骨髓特异性mir223启动子。
[0264]
在本发明的一个特定实施方式中，在本发明的方法内可以使用慢病毒自灭活(sin)载体，其中在质粒水平上，病毒启动子/增强子在3'长末端重复序列(ltr)内被缺失。
感兴趣的转基因的表达可以由内部启动子驱动，所述内部启动子为例如猿猴病毒40(sv40)(例如，早期或晚期)、巨细胞病毒(cmv)(例如，立即早期)、莫洛尼鼠白血病病毒(momlv)、劳斯氏肉瘤病毒(rsv)和单纯疱疹病毒(hsv)(胸苷激酶)启动子或骨髓特异性mir223启动子，但是特别是骨髓特异性mir223启动子。
[0265]
在本发明的一个特定实施方式中，通过慢病毒自灭活基因疗法载体转导人cd34阳性hsc，所述慢病毒自灭活基因疗法载体包含处于编码p47phox的mir223启动子控制下的cdna。
[0266]
在本发明的一个特定实施方式中，预孵育培养基可以进一步补充有硫酸鱼精蛋白或氯化鱼精蛋白，优选地本文所示浓度的硫酸鱼精蛋白或氯化鱼精蛋白。在本发明的一个特定实施方式中，共孵育培养基可以进一步补充有硫酸鱼精蛋白或氯化鱼精蛋白，优选地本文所示浓度的硫酸鱼精蛋白或氯化鱼精蛋白。在本发明的一个特定实施方式中，预孵育和/或共孵育培养基可以补充有4μg/ml的硫酸鱼精蛋白或氯化鱼精蛋白。
[0267]
在另一个特定实施方式中，预孵育或共孵育培养基可进一步补充有聚凝胺，优选地浓度范围为约0.1μg/ml至约20μg/ml的聚凝胺；和/或聚l-赖氨酸，优选地浓度范围为约0.1μg/ml至约20μg/ml的聚l-赖氨酸。
[0268]
在本发明的各个实施方式中，转导增强化合物是选自由以下项组成的组的转导增强化合物：水飞蓟宾，特别是浓度为5μm的水飞蓟宾；白藜芦醇，特别是浓度为5μm的白藜芦醇；依维莫司，特别是浓度为1μm的依维莫司；米哚妥林，特别是浓度为0.4μm的米哚妥林；两性霉素b，特别是浓度为1μm的两性霉素b；制霉菌素，特别是浓度为100μm的制霉菌素；纳他霉素，特别是浓度为3μm的纳他霉素；前列腺素e2，特别是浓度为10μm的前列腺素e2；泊洛沙姆symperonic特别是浓度为1,000μg/ml的泊洛沙姆symperonic
[0269]
聚(乙二醇)-b-聚(d,l-乳酸-共聚-乙醇酸)-b-聚(乙二醇)(peg-plga-peg)，其具有在两个末端处的5kda的聚(乙二醇)嵌段，和中央4.2kda的聚(d,l-乳酸-共聚-乙醇酸)嵌段，被称为peg5k-b-plga4.2k-b-peg5k，特别地浓度为1,000μg/ml，
[0270]
甲氧基聚(乙二醇)-聚(ε-己内酯)-甲氧基聚(乙二醇)(peg-pcl-peg)，其具有在两个末端处的5kda的聚(乙二醇)嵌段和中央的4.2kda的聚(ε-己内酯)嵌段，被称为peg5k-b-pcl4.2k-b-peg5k，特别地浓度为10μg/ml，
[0271]
甲氧基聚(乙二醇)-聚(ε-己内酯)-甲氧基聚(乙二醇)(peg-pcl-peg)，其具有中央的2.4kda的聚(ε-己内酯)嵌段和都共价连接至氨基的在两个末端处的5.3kda的聚(乙二醇)嵌段，被称为nh2-peg5.3k-b-pcl2.4k-b-peg5.3k-nh2，特别地浓度为10μg/ml，
[0272]
聚(乙二醇)/聚(丙交酯)/聚(乙二醇)(peg-pla-peg)，其具有在两个末端处的5kda的聚(乙二醇)嵌段和中央的4.2kda的聚(丙交酯)嵌段，被称为peg5k-b-pla4.2k-b-peg5k，特别地浓度为50μg/ml；以及脱氧核糖核苷，特别地每种脱氧核糖核苷的终浓度为300μm，或它们的组合。
[0273]
被广泛认为是当用逆转录病毒载体，特别是慢病毒载体转导人细胞时的首选化合物。然而，尽管是或已经是各种临床试验的对象，但迄今为止，其尚未获得监管部门的治疗用途批准。此外，包含合成聚合物，并且因此具有不可降解化合物在已经用处理过的细胞中积聚的风险以及对人类的迄今为
止无法预料的后果。因此，本领域中需要更安全的转导增强剂。
[0274]
本发明人已经惊奇地表明，已被批准用于人类治疗用途的几种化合物非常适合作为转导增强剂，并且因此对于在治疗应用中使用可能优于
[0275]
例如，本发明人已经表明，所批准的治疗化合物水飞蓟宾(legalon)、米哚妥林(rydapt)、两性霉素b(ambisome)、制霉菌素(mycostatin)、纳他霉素(natacyn)、鲁索替尼(jakavi)、氟达拉滨(fludara)是有效的转导增强剂。因此，在一个具体的实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述转导增强剂是水飞蓟宾、米哚妥林、两性霉素b、制霉菌素、纳他霉素、鲁索替尼、氟达拉滨或它们的任何组合。在一个优选的实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述转导增强剂是水飞蓟宾、米哚妥林、两性霉素b、制霉菌素、纳他霉素、鲁索替尼、氟达拉滨或它们的任何组合，特别地其中所述组合是依维莫司与两性霉素b的组合。在某些实施方式中，水飞蓟宾、米哚妥林、两性霉素b、制霉菌素、纳他霉素、鲁索替尼、氟达拉滨或它们的任何组合可与本文所公开的浓度中的任何浓度的鱼精蛋白盐，特别是硫酸鱼精蛋白或氯化鱼精蛋白组合。
[0276]
在一个具体的实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述转导增强剂是水飞蓟宾、米哚妥林、两性霉素b、制霉菌素、纳他霉素或它们的任何组合。在另一个实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述转导增强剂是水飞蓟宾、依维莫司、米哚妥林、两性霉素b、制霉菌素、纳他霉素或它们的任何组合，特别地其中所述组合是依维莫司与两性霉素b的组合。在某些实施方式中，水飞蓟宾、米哚妥林、两性霉素b、制霉菌素、纳他霉素或它们的任何组合可与本文所公开的浓度中的任何浓度的鱼精蛋白盐，特别是硫酸鱼精蛋白或氯化鱼精蛋白组合。
[0277]
此外，本发明人已经鉴定出某些化合物可以提高的转导效率。特别地，本发明人已经惊奇地发现，与单独的相比，与两性霉素b、水飞蓟宾和/或米哚妥林的组合导致增加的转导效率。因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述转导增强剂是与两性霉素b、水飞蓟宾和/或米哚妥林的组合。在另一个实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述转导增强剂是与两性霉素b和/或米哚妥林的组合。在另一个实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述转导增强剂是与两性霉素b的组合或与米哚妥林的组合或与水飞蓟宾的组合。可以以本文所公开的浓度中的任何浓度与两性霉素b、水飞蓟宾和/或米哚妥林组合。
[0278]
此外，本发明人已发现，当与以其推荐浓度1mg/ml使用的相比时，所述转导增强剂的特定组合导致了增加的转导效率。
[0279]
本发明人已发现，当与1mg/ml的一起预孵育和共孵育时，用moi为10的慢病毒载体转导hsc导致vcn在x-vivo10培养基中为3.5并且在besp1366f培养基中为5(参见图2和图3)。
[0280]
令本发明人惊讶的是，鱼精蛋白盐和两性霉素b的组合导致当处于与相同的条件下时，besp1366f培养基中的vcn为5.4(参见图4)。因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中转导增强剂是鱼精蛋白盐与两性霉素b的组合。
[0281]
进一步，本发明人发现，当在与相同的条件下进行处理时，鱼精蛋白盐与peg-pcl-peg的组合导致x-vivo 10培养基中的vcn为4(参见图6)。因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中转导增强剂是鱼精蛋白盐与peg-pcl-peg的组合。
[0282]
进一步，本发明人发现，当在与相同的条件下进行处理时，两性霉素b与泊洛沙姆f108的组合导致x-vivo 10培养基中的vcn为6.8(参见图8)。因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述转导增强剂是两性霉素b与泊洛沙姆f108的组合。
[0283]
此外，发明人发现当在与相同的条件下进行处理时，水飞蓟宾与peg-pcl-peg的组合导致在x-vivo 10培养基中的vcn为5(参见图9)。因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中转导增强剂是水飞蓟宾与peg-pcl-peg的组合。
[0284]
进一步，本发明人发现，当在与相同的条件下进行处理时，水飞蓟宾与泊洛沙姆f108的组合导致x-vivo 10培养基中的vcn为7.2(参见图9)。因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中转导增强剂是水飞蓟宾与泊洛沙姆f108的组合。
[0285]
进一步，本发明人发现，当在与相同的条件下进行处理时，米哚妥林与泊洛沙姆f108的组合导致x-vivo 10培养基中的vcn为9.7(参见图10)。因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中转导增强剂是米哚妥林与泊洛沙姆f108的组合。
[0286]
因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述转导增强剂是鱼精蛋白盐与两性霉素b的组合、鱼精蛋白盐与peg-pcl-peg的组合、两性霉素b与泊洛沙姆f108的组合、水飞蓟宾与peg-pcl-peg的组合、水飞蓟宾与泊洛沙姆f108的组合或米哚妥林与泊洛沙姆f108的组合，优选地所述转导增强剂为本文所公开的浓度中的任何浓度。
[0287]
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述转导增强剂是鱼精蛋白盐与两性霉素b的组合、鱼精蛋白盐与peg-pcl-peg的组合、两性霉素b与泊洛沙姆f108的组合、水飞蓟宾与peg-pcl-peg的组合、水飞蓟宾与泊洛沙姆f108的组合、米哚妥林与泊洛沙姆f108的组合、与两性霉素b的组合、与水飞蓟宾的组合或与米哚妥林的组合，优选地所述所述转导增强剂为本文所公开的浓度中的任何浓度。
[0288]
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述转导增强化合物选自由以下项组成的组：
[0289]
·
水飞蓟宾，特别地浓度在0.05μm与500μm之间；
[0290]
·
米哚妥林，特别地浓度在2nm与500,000nm之间；
[0291]
·
制霉菌素，特别地浓度在0.1μm与1000μm之间；
[0292]
·
纳他霉素，特别地浓度在0.05μm与500μm之间；
[0293]
·
peg-pcl-peg聚合物，特别地浓度在1μg/ml与5,000μg/ml之间；
[0294]
·
peg-plga-peg聚合物，特别地浓度在1μg/ml与5,000μg/ml之间；
[0295]
·
peg-pla-peg聚合物，特别地浓度在1μg/ml与5,000μg/ml之间；和/或
[0296]
·
它们的任何组合。
[0297]
此外，本发明人已经惊奇地发现两性霉素b可以用作转导增强剂，这在以前没有被建议过。因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述转导增强化合物是两性霉素b。
[0298]
两性霉素b可以在预孵育和/或共孵育步骤期间以本文所公开的浓度中的任何浓度与靶细胞接触，以诱导用逆转录病毒载体进行转导的效率。因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述靶细胞在预孵育和/或共孵育步骤期间与约0.05μm至约500μm的浓度，特别地约0.1μm至约10μm的浓度，或本文所公开的浓度中的任何浓度的两性霉素b接触。
[0299]
此外，两性霉素b可与本领域中已知的任何转导增强化合物或本文所述的转导增强化合物中的任何转导增强化合物组合，优选地以本文所公开的浓度中的任何浓度进行组合。因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中两性霉素b与一种或多种附加的转导增强化合物组合使用。
[0300]
在某些实施方式中，两性霉素b可以与鱼精蛋白盐组合使用以提高用逆转录病毒载体转导靶细胞的效率。因此，在某些实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述附加转导增强化合物是鱼精蛋白盐。
[0301]
鱼精蛋白盐可以是本领域中已知的任何鱼精蛋白盐，前提条件是盐的阴离子组分当在溶液中时不干扰靶细胞的转导效率。因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中鱼精蛋白盐是氯化鱼精蛋白或硫酸鱼精蛋白。
[0302]
所述鱼精蛋白盐可以以本文所公开的任何浓度与靶细胞接触。也就是说，在某个实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述靶细胞在预孵育和/或共孵育步骤期间与约0.05μg/ml至约25μg/ml的浓度，特别地约0.1μg/ml至约10μg/ml的浓度的鱼精蛋白盐接触。
[0303]
也就是说，在一个优选实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中靶细胞在预孵育和/或共孵育步骤期间与两性霉素b和鱼精蛋白盐的组合接触，其中两性霉素以约0.05μm至约500μm的浓度，特别地以约0.1μm至约10μm的浓度与靶细胞接触，并且其中鱼精蛋白盐以约0.05μg/ml至约25μg/ml的浓度，特别地以约0.1μg/ml至约10μg/ml的浓度与靶细胞接触。
[0304]
当将两种或更多种转导增强化合物组合添加到靶细胞中时，优选的是所有化合物同时存在于预孵育和/或共孵育培养基中。然而，必须注意的是，两种或更多种转导增强化合物可以顺序地添加到预孵育和/或共孵育培养基中，只要组合使用的化合物在预孵育和/或共孵育步骤期间的至少一个时间点同时存在于预孵育和/或共孵育步骤中即可。
[0305]
已经进一步显示，当与一种或多种附加转导增强化合物组合使用时，两性霉素b的转导效率可进一步提高。因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述一种或多种附加转导增强化合物选自由以下项组成的组：
[0306]
·
特别地浓度在0.1mg/ml与5,000mg/ml之间；
[0307]
·
泊洛沙姆f108，特别地浓度在0.1mg/ml与5,000mg/ml之间；
[0308]
·
水飞蓟宾，特别地浓度在0.05μm与500μm之间；
[0309]
·
米哚妥林，特别地浓度在2nm与500,000nm之间；
[0310]
·
peg-pla-peg，特别地浓度在1μg/ml与5,000μg/ml之间；
[0311]
·
peg-pgla-peg，特别地浓度在1μg/ml与5,000μg/ml之间；
[0312]
·
peg-pcl-peg，特别地浓度在1μg/ml与5,000μg/ml之间；
[0313]
·
制霉菌素，特别地浓度在0.1μm与1000μm之间；
[0314]
·
纳他霉素，特别地浓度在0.05μm与500μm之间；
[0315]
·
鲁索替尼，特别地浓度在0.01μm与10,000μm之间；
[0316]
·
氟达拉滨，特别地浓度在0.01μm与10,000μm之间；
[0317]
·
依维莫司，特别地浓度在0.1μm与10μm之间；
[0318]
·
白藜芦醇，特别地浓度在0.1μm与25μm之间；
[0319]
·
前列腺素e，特别地浓度在1μm与100μm之间；
[0320]
·
脱氧核糖核苷，特别地每种核苷的浓度在0.1mm与10mm之间；和/或
[0321]
·
它们的任何组合。
[0322]
此外，必须注意两性霉素b和上面列出的化合物都可以以本文所公开的浓度中的任何浓度组合。
[0323]
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中两性霉素b与转导增强剂dmso组合，特别是以介于0.1％(v/v)与10％(v/v)之间的浓度组合；并且任选地与以上所列浓度中的任何浓度的以上所列化合物中的一种或多种化合物组合。
[0324]
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中至少一种附加转导增强化合物选自由以下项组成的组：泊洛沙姆f108和/或peg-pcl-peg聚合物。
[0325]
此外，本发明人已经惊奇地发现水飞蓟宾可以用作转导增强剂，这在以前没有被建议过。因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述转导增强化合物是水飞蓟宾。
[0326]
水飞蓟宾可以在预孵育和/或共孵育步骤期间以本文所公开的浓度中的任何浓度与靶细胞接触，以诱导用逆转录病毒载体进行转导的效率。因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述靶细胞在预孵育和/或共孵育步骤期间与约0.05μm至约500μm的浓度，或本文所公开的浓度中的任何浓度的水飞蓟宾接触。此外，水飞蓟宾可与本领域中已知的任何转导增强化合物或本文所述的转导增强化合物中的任何转导增强化合物组合，优选地以本文所公开的浓度中的任何浓度进行组合。因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中水飞蓟宾与一种或多种附加的转导增强化合物组合使用。
[0327]
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中与水飞蓟宾组合使用的一种或多种附加转导增强化合物选自由以下项组成的组：
[0328]
·
特别地浓度在0.1mg/ml与5,000mg/ml之间；
[0329]
·
泊洛沙姆f108，特别地浓度在0.1mg/ml与5,000mg/ml之间；
[0330]
·
鱼精蛋白盐，特别地浓度在0.05μg/ml与25μg/ml之间；
[0331]
·
两性霉素b，特别地浓度在0.05μm与500μm之间；
[0332]
·
米哚妥林，特别地浓度在2nm与500,000nm之间；
[0333]
·
peg-pla-peg聚合物，特别地浓度在1μg/ml与5,000μg/ml之间；
[0334]
·
peg-pgla-peg聚合物，特别地浓度在1μg/ml与5,000μg/ml之间；
[0335]
·
peg-pcl-peg聚合物，特别地浓度在1μg/ml与5,000μg/ml之间；
[0336]
·
制霉菌素，特别地浓度在0.1μm与1000μm之间；
[0337]
·
纳他霉素，特别地浓度在0.05μm与500μm之间；
[0338]
·
鲁索替尼，特别地浓度在0.01μm与10,000μm之间；
[0339]
·
氟达拉滨，特别地浓度在0.01μm与10,000μm之间；
[0340]
·
依维莫司，特别地浓度在0.1μm与10μm之间；
[0341]
·
白藜芦醇，特别地浓度在0.1μm与25μm之间；
[0342]
·
前列腺素e，特别地浓度在1μm与100μm之间；
[0343]
·
脱氧核糖核苷，特别地每种核苷的浓度在0.1mm与10mm之间；和/或
[0344]
·
它们的任何组合。
[0345]
必须注意水飞蓟宾和上面列出的化合物都可以以本文所公开的浓度中的任何浓度组合。
[0346]
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中水飞蓟宾与转导增强剂dmso组合，特别是以介于0.1％(v/v)与10％(v/v)之间的浓度组合；并且任选地与以上所列浓度中的任何浓度的以上所列化合物中的一种或多种化合物组合。
[0347]
优选地，水飞蓟宾可以以本文所公开的浓度中的任何浓度与泊洛沙姆f108或peg-pcl-peg聚合物组合。
[0348]
此外，本发明人已经惊奇地发现米哚妥林可以用作转导增强剂，这在以前没有被建议过。因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述转导增强化合物是米哚妥林。
[0349]
米哚妥林可以在预孵育和/或共孵育步骤期间以本文所公开的浓度中的任何浓度与靶细胞接触，以诱导用逆转录病毒载体进行转导的效率。因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述靶细胞在预孵育和/或共孵育步骤期间与介于2nm与500,000nm之间的浓度，或本文所公开的浓度中的任何浓度的米哚妥林接触。此外，米哚妥林可与本领域中已知的任何转导增强化合物或本文所述的转导增强化合物中的任何转导增强化合物组合，优选地以本文所公开的浓度中的任何浓度进行组合。因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中米哚妥林与一种或多种附加的转导增强化合物组合使用。
[0350]
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中与米哚妥林组合使用的一种或多种附加转导增强化合物选自由以下项组成的组：
[0351]
·
特别地浓度在0.1mg/ml与5,000mg/ml之间；
[0352]
·
泊洛沙姆f108，特别地浓度在0.1mg/ml与5,000mg/ml之间；
[0353]
·
鱼精蛋白盐，特别地浓度在0.05μg/ml与25μg/ml之间；
[0354]
·
两性霉素b，特别地浓度在0.05μm与500μm之间；
[0355]
·
水飞蓟宾，特别地浓度在0.05μm与500μm之间；
[0356]
·
peg-pla-peg聚合物，特别地浓度在1μg/ml与5,000μg/ml之间；
[0357]
·
peg-pgla-peg聚合物，特别地浓度在1μg/ml与5,000μg/ml之间；
[0358]
·
peg-pcl-peg聚合物，特别地浓度在1μg/ml与5,000μg/ml之间；
[0359]
·
制霉菌素，特别地浓度在0.1μm与1000μm之间；
[0360]
·
纳他霉素，特别地浓度在0.05μm与500μm之间；
[0361]
·
鲁索替尼，特别地浓度在0.01μm与10,000μm之间；
[0362]
·
氟达拉滨，特别地浓度在0.01μm与10,000μm之间；
[0363]
·
依维莫司，特别地浓度在0.1μm与10μm之间；
[0364]
·
白藜芦醇，特别地浓度在0.1μm与25μm之间；
[0365]
·
前列腺素e，特别地浓度在1μm与100μm之间；
[0366]
·
脱氧核糖核苷，特别地每种核苷的浓度在0.1mm与10mm之间；和/或
[0367]
·
它们的任何组合。
[0368]
必须注意米哚妥林和上面列出的化合物都可以以本文所公开的浓度中的任何浓度组合。
[0369]
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中米哚妥林与转导增强剂dmso组合，特别是以介于0.1％(v/v)与10％(v/v)之间的浓度组合；并且任选地与以上所列浓度中的任何浓度的以上所列化合物中的一种或多种化合物组合。
[0370]
优选地，米哚妥林可以以本文所公开的浓度中的任何浓度与或泊洛沙姆f108组合。
[0371]
此外，本发明人已经惊奇地发现制霉菌素可以用作转导增强剂，这在以前没有被建议过。因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述转导增强化合物是制霉菌素。
[0372]
制霉菌素可以在预孵育和/或共孵育步骤期间以本文所公开的浓度中的任何浓度与靶细胞接触，以诱导用逆转录病毒载体进行转导的效率。因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述靶细胞在预孵育和/或共孵育步骤期间与介于0.1μm与1000μm之间的浓度，或本文所公开的浓度中的任何浓度的制霉菌素接触。此外，制霉菌素可与本领域中已知的任何转导增强化合物或本文所述的转导增强化合物中的任何转导增强化合物组合，优选地以本文所公开的浓度中的任何浓度进行组合。因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中制霉菌素与一种或多种附加的转导增强化合物组合使用。
[0373]
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中与制霉菌素组合使用的一种或多种附加转导增强化合物选自由以下项组成的组：
[0374]
·
特别地浓度在0.1mg/ml与5,000mg/ml之间；
[0375]
·
泊洛沙姆f108，特别地浓度在0.1mg/ml与5,000mg/ml之间；
[0376]
·
鱼精蛋白盐，特别地浓度在0.05μg/ml与25μg/ml之间；
[0377]
·
两性霉素b，特别地浓度在0.05μm与500μm之间；
[0378]
·
水飞蓟宾，特别地浓度在0.05μm与500μm之间；
[0379]
·
peg-pla-peg聚合物，特别地浓度在1μg/ml与5,000μg/ml之间；
[0380]
·
peg-pgla-peg聚合物，特别地浓度在1μg/ml与5,000μg/ml之间；
[0381]
·
peg-pcl-peg聚合物，特别地浓度在1μg/ml与5,000μg/ml之间；
[0382]
·
米哚妥林，特别地浓度在2nm与500,000nm之间；
[0383]
·
纳他霉素，特别地浓度在0.05μm与500μm之间；
[0384]
·
鲁索替尼，特别地浓度在0.01μm与10,000μm之间；
[0385]
·
氟达拉滨，特别地浓度在0.01μm与10,000μm之间；
[0386]
·
依维莫司，特别地浓度在0.1μm与10μm之间；
[0387]
·
白藜芦醇，特别地浓度在0.1μm与25μm之间；
[0388]
·
前列腺素e，特别地浓度在1μm与100μm之间；
[0389]
·
脱氧核糖核苷，特别地每种核苷的浓度在0.1mm与10mm之间；和/或
[0390]
·
它们的任何组合。
[0391]
必须注意制霉菌素和上面列出的化合物都可以以本文所公开的浓度中的任何浓度组合。
[0392]
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中制霉菌素与转导增强剂dmso组合，特别是以介于0.1％(v/v)与10％(v/v)之间的浓度组合；并且任选地与以上所列浓度中的任何浓度的以上所列化合物中的一种或多种化合物组合。
[0393]
此外，本发明人已经惊奇地发现纳他霉素可以用作转导增强剂，这在以前没有被建议过。因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述转导增强化合物是纳他霉素。
[0394]
纳他霉素可以在预孵育和/或共孵育步骤期间以本文所公开的浓度中的任何浓度与靶细胞接触，以诱导用逆转录病毒载体进行转导的效率。因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述靶细胞在预孵育和/或共孵育步骤期间与介于0.05μm与500μm之间的浓度，或本文所公开的浓度中的任何浓度的纳他霉素接触。此外，纳他霉素可与本领域中已知的任何转导增强化合物或本文所述的转导增强化合物中的任何转导增强化合物组合，优选地以本文所公开的浓度中的任何浓度进行组合。因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中纳他霉素与一种或多种附加的转导增强化合物组合使用。
[0395]
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中与纳他霉素组合使用的一种或多种附加转导增强化合物选自由以下项组成的组：
[0396]
·
特别地浓度在0.1mg/ml与5,000mg/ml之间；
[0397]
·
泊洛沙姆f108，特别地浓度在0.1mg/ml与5,000mg/ml之间；
[0398]
·
鱼精蛋白盐，特别地浓度在0.05μg/ml与25μg/ml之间；
[0399]
·
两性霉素b，特别地浓度在0.05μm与500μm之间；
[0400]
·
水飞蓟宾，特别地浓度在0.05μm与500μm之间；
[0401]
·
peg-pla-peg聚合物，特别地浓度在1μg/ml与5,000μg/ml之间；
[0402]
·
peg-pgla-peg聚合物，特别地浓度在1μg/ml与5,000μg/ml之间；
[0403]
·
peg-pcl-peg聚合物，特别地浓度在1μg/ml与5,000μg/ml之间；
[0404]
·
米哚妥林，特别地浓度在2nm与500,000nm之间；
[0405]
·
制霉菌素，特别地浓度在0.1μm与1000μm之间；
[0406]
·
鲁索替尼，特别地浓度在0.01μm与10,000μm之间；
[0407]
·
氟达拉滨，特别地浓度在0.01μm与10,000μm之间；
[0408]
·
依维莫司，特别地浓度在0.1μm与10μm之间；
[0409]
·
白藜芦醇，特别地浓度在0.1μm与25μm之间；
[0410]
·
前列腺素e，特别地浓度在1μm与100μm之间；
[0411]
·
脱氧核糖核苷，特别地每种核苷的浓度在0.1mm与10mm之间；和/或
[0412]
·
它们的任何组合。
[0413]
必须注意纳他霉素和上面列出的化合物都可以以本文所公开的浓度中的任何浓度组合。
[0414]
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中纳他霉素与转导增强剂dmso组合，特别是以介于0.1％(v/v)与10％(v/v)之间的浓度组合；并且任选地与以上所列浓度中的任何浓度的以上所列化合物中的一种或多种化合物组合。
[0415]
此外，本发明人已经惊奇地发现氟达拉滨可以用作转导增强剂，这在以前没有被建议过。因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述转导增强化合物是氟达拉滨。
[0416]
氟达拉滨可以在预孵育和/或共孵育步骤期间以本文所公开的浓度中的任何浓度与靶细胞接触，以诱导用逆转录病毒载体进行转导的效率。因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述靶细胞在预孵育和/或共孵育步骤期间与介于0.01μm与10,000μm之间的浓度，或本文所公开的浓度中的任何浓度的氟达拉滨接触。此外，氟达拉滨可与本领域中已知的任何转导增强化合物或本文所述的转导增强化合物中的任何转导增强化合物组合，优选地以本文所公开的浓度中的任何浓度进行组合。因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中氟达拉滨与一种或多种附加的转导增强化合物组合使用。
[0417]
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中与氟达拉滨组合使用的一种或多种附加转导增强化合物选自由以下项组成的组：
[0418]
·
特别地浓度在0.1mg/ml与5,000mg/ml之间；
[0419]
·
泊洛沙姆f108，特别地浓度在0.1mg/ml与5,000mg/ml之间；
[0420]
·
鱼精蛋白盐，特别地浓度在0.05μg/ml与25μg/ml之间；
[0421]
·
两性霉素b，特别地浓度在0.05μm与500μm之间；
[0422]
·
水飞蓟宾，特别地浓度在0.05μm与500μm之间；
[0423]
·
peg-pla-peg聚合物，特别地浓度在1μg/ml与5,000μg/ml之间；
[0424]
·
peg-pgla-peg聚合物，特别地浓度在1μg/ml与5,000μg/ml之间；
[0425]
·
peg-pcl-peg聚合物，特别地浓度在1μg/ml与5,000μg/ml之间；
[0426]
·
制霉菌素，特别地浓度在0.1μm与1000μm之间；
[0427]
·
纳他霉素，特别地浓度在0.05μm与500μm之间；
[0428]
·
鲁索替尼，特别地浓度在0.01μm与10,000μm之间；
[0429]
·
米哚妥林，特别地浓度在2nm与500,000nm之间；
[0430]
·
依维莫司，特别地浓度在0.1μm与10μm之间；
[0431]
·
白藜芦醇，特别地浓度在0.1μm与25μm之间；
[0432]
·
前列腺素e，特别地浓度在1μm与100μm之间；
[0433]
·
脱氧核糖核苷，特别地每种核苷的浓度在0.1mm与10mm之间；和/或
[0434]
·
它们的任何组合。
[0435]
必须注意氟达拉滨和上面列出的化合物都可以以本文所公开的浓度中的任何浓
度组合。
[0436]
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中氟达拉滨与转导增强剂dmso组合，特别是以介于0.1％(v/v)与10％(v/v)之间的浓度组合；并且任选地与以上所列浓度中的任何浓度的以上所列化合物中的一种或多种化合物组合。
[0437]
此外，本发明人已经惊奇地发现鲁索替尼可以用作转导增强剂，这在以前没有被建议过。因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述转导增强化合物是鲁索替尼。
[0438]
鲁索替尼可以在预孵育和/或共孵育步骤期间以本文所公开的浓度中的任何浓度与靶细胞接触，以诱导用逆转录病毒载体进行转导的效率。因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述靶细胞在预孵育和/或共孵育步骤期间与介于0.01μm与10,000μm之间的浓度，或本文所公开的浓度中的任何浓度的鲁索替尼接触。此外，鲁索替尼可与本领域中已知的任何转导增强化合物或本文所述的转导增强化合物中的任何转导增强化合物组合，优选地以本文所公开的浓度中的任何浓度进行组合。因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中鲁索替尼与一种或多种附加的转导增强化合物组合使用。
[0439]
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中与鲁索替尼组合使用的一种或多种附加转导增强化合物选自由以下项组成的组：
[0440]
·
特别地浓度在0.1mg/ml与5,000mg/ml之间；
[0441]
·
泊洛沙姆f108，特别地浓度在0.1mg/ml与5,000mg/ml之间；
[0442]
·
鱼精蛋白盐，特别地浓度在0.05μg/ml与25μg/ml之间；
[0443]
·
两性霉素b，特别地浓度在0.05μm与500μm之间；
[0444]
·
水飞蓟宾，特别地浓度在0.05μm与500μm之间；
[0445]
·
peg-pla-peg聚合物，特别地浓度在1μg/ml与5,000μg/ml之间；
[0446]
·
peg-pgla-peg聚合物，特别地浓度在1μg/ml与5,000μg/ml之间；
[0447]
·
peg-pcl-peg聚合物，特别地浓度在1μg/ml与5,000μg/ml之间；
[0448]
·
米哚妥林，特别地浓度在2nm与500,000nm之间；
[0449]
·
纳他霉素，特别地浓度在0.05μm与500μm之间；
[0450]
·
制霉菌素，特别地浓度在0.1μm与1000μm之间；
[0451]
·
氟达拉滨，特别地浓度在0.01μm与10,000μm之间；
[0452]
·
依维莫司，特别地浓度在0.1μm与10μm之间；
[0453]
·
白藜芦醇，特别地浓度在0.1μm与25μm之间；
[0454]
·
前列腺素e，特别地浓度在1μm与100μm之间；
[0455]
·
脱氧核糖核苷，特别地每种核苷的浓度在0.1mm与10mm之间；和/或
[0456]
·
它们的任何组合。
[0457]
必须注意鲁索替尼和上面列出的化合物都可以以本文所公开的浓度中的任何浓度组合。
[0458]
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中鲁索替尼与转导增强剂dmso组合，特别是以介于0.1％(v/v)与10％(v/v)之间的浓度组合；并且任选地与以上所列浓度中的任何浓度的以上所列化合物中的一种或多种化合物组合。
[0459]
此外，本发明人已经惊奇地发现peg-pcl-peg聚合物可以用作转导增强剂，这在以前没有被建议过。因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述转导增强化合物是如本文所公开的peg-pcl-peg聚合物。
[0460]
peg-pcl-peg聚合物可以在预孵育和/或共孵育步骤期间以本文所公开的浓度中的任何浓度与靶细胞接触，以诱导用逆转录病毒载体进行转导的效率。因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述靶细胞在预孵育和/或共孵育步骤期间与介于1μg/ml与5,000μg/ml之间的浓度，或本文所公开的浓度中的任何浓度的peg-pcl-peg聚合物接触。此外，peg-pcl-peg聚合物可与本领域中已知的任何转导增强化合物或本文所述的转导增强化合物中的任何转导增强化合物组合，优选地以本文所公开的浓度中的任何浓度进行组合。因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中peg-pcl-peg聚合物与一种或多种附加的转导增强化合物组合使用。
[0461]
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中与peg-pcl-peg聚合物组合使用的一种或多种附加转导增强化合物选自由以下项组成的组：
[0462]
·
特别地浓度在0.1mg/ml与5,000mg/ml之间；
[0463]
·
泊洛沙姆f108，特别地浓度在0.1mg/ml与5,000mg/ml之间；
[0464]
·
鱼精蛋白盐，特别地浓度在0.05μg/ml与25μg/ml之间；
[0465]
·
两性霉素b，特别地浓度在0.05μm与500μm之间；
[0466]
·
水飞蓟宾，特别地浓度在0.05μm与500μm之间；
[0467]
·
peg-pla-peg聚合物，特别地浓度在1μg/ml与5,000μg/ml之间；
[0468]
·
peg-plga-peg聚合物，特别地浓度在1μg/ml与5,000μg/ml之间；
[0469]
·
纳他霉素，特别地浓度在0.05μm与500μm之间；
[0470]
·
米哚妥林，特别地浓度在2nm与500,000nm之间；
[0471]
·
制霉菌素，特别地浓度在0.1μm与1000μm之间；
[0472]
·
鲁索替尼，特别地浓度在0.01μm与10,000μm之间；
[0473]
·
氟达拉滨，特别地浓度在0.01μm与10,000μm之间；
[0474]
·
依维莫司，特别地浓度在0.1μm与10μm之间；
[0475]
·
白藜芦醇，特别地浓度在0.1μm与25μm之间；
[0476]
·
前列腺素e，特别地浓度在1μm与100μm之间；
[0477]
·
脱氧核糖核苷，特别地每种核苷的浓度在0.1mm与10mm之间；和/或
[0478]
·
它们的任何组合。
[0479]
必须注意peg-pcl-peg聚合物和上面列出的化合物都可以以本文所公开的浓度中的任何浓度组合。
[0480]
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中peg-pcl-peg与转导增强剂dmso组合，特别是以介于0.1％(v/v)与10％(v/v)之间的浓度组合；并且任选地与以上所列浓度中的任何浓度的以上所列化合物中的一种或多种化合物组合。
[0481]
优选地，peg-pcl-peg聚合物可以以本文所公开的浓度中的任何浓度与鱼精蛋白盐或水飞蓟宾组合。
[0482]
此外，本发明人已经惊奇地发现peg-plga-peg聚合物可以用作转导增强剂，这在以前没有被建议过。因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所
述转导增强化合物是如本文所公开的peg-plga-peg聚合物。
[0483]
peg-plga-peg聚合物可以在预孵育和/或共孵育步骤期间以本文所公开的浓度中的任何浓度与靶细胞接触，以诱导用逆转录病毒载体进行转导的效率。因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述靶细胞在预孵育和/或共孵育步骤期间与介于1μg/ml与5,000μg/ml之间的浓度，或本文所公开的浓度中的任何浓度的peg-plga-peg聚合物接触。此外，peg-plga-peg聚合物可与本领域中已知的任何转导增强化合物或本文所述的转导增强化合物中的任何转导增强化合物组合，优选地以本文所公开的浓度中的任何浓度进行组合。因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中peg-plga-peg聚合物与一种或多种附加的转导增强化合物组合使用。
[0484]
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中与peg-plga-peg聚合物组合使用的一种或多种附加转导增强化合物选自由以下项组成的组：
[0485]
·
特别地浓度在0.1mg/ml与5,000mg/ml之间；
[0486]
·
泊洛沙姆f108，特别地浓度在0.1mg/ml与5,000mg/ml之间；
[0487]
·
鱼精蛋白盐，特别地浓度在0.05μg/ml与25μg/ml之间；
[0488]
·
两性霉素b，特别地浓度在0.05μm与500μm之间；
[0489]
·
水飞蓟宾，特别地浓度在0.05μm与500μm之间；
[0490]
·
peg-pla-peg聚合物，特别地浓度在1μg/ml与5,000μg/ml之间；
[0491]
·
peg-pcl-peg聚合物，特别地浓度在1μg/ml与5,000μg/ml之间；
[0492]
·
纳他霉素，特别地浓度在0.05μm与500μm之间；
[0493]
·
米哚妥林，特别地浓度在2nm与500,000nm之间；
[0494]
·
制霉菌素，特别地浓度在0.1μm与1000μm之间；
[0495]
·
鲁索替尼，特别地浓度在0.01μm与10,000μm之间；
[0496]
·
氟达拉滨，特别地浓度在0.01μm与10,000μm之间；
[0497]
·
依维莫司，特别地浓度在0.1μm与10μm之间；
[0498]
·
白藜芦醇，特别地浓度在0.1μm与25μm之间；
[0499]
·
前列腺素e，特别地浓度在1μm与100μm之间；
[0500]
·
脱氧核糖核苷，特别地每种核苷的浓度在0.1mm与10mm之间；和/或
[0501]
·
它们的任何组合。
[0502]
必须注意peg-plga-peg聚合物和上面列出的化合物都可以以本文所公开的浓度中的任何浓度组合。
[0503]
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中peg-plga-peg与转导增强剂dmso组合，特别是以介于0.1％(v/v)与10％(v/v)之间的浓度组合；并且任选地与以上所列浓度中的任何浓度的以上所列化合物中的一种或多种化合物组合。
[0504]
此外，本发明人已经惊奇地发现peg-pla-peg聚合物可以用作转导增强剂，这在以前没有被建议过。因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述转导增强化合物是如本文所公开的peg-pla-peg聚合物。
[0505]
peg-pla-peg聚合物可以在预孵育和/或共孵育步骤期间以本文所公开的浓度中的任何浓度与靶细胞接触，以诱导用逆转录病毒载体进行转导的效率。因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述靶细胞在预孵育和/或共孵育步骤期间
与介于1μg/ml与5,000μg/ml之间的浓度，或本文所公开的浓度中的任何浓度的peg-pla-peg聚合物接触。此外，peg-pla-peg聚合物可与本领域中已知的任何转导增强化合物或本文所述的转导增强化合物中的任何转导增强化合物组合，优选地以本文所公开的浓度中的任何浓度进行组合。因此，在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中peg-pla-peg聚合物与一种或多种附加的转导增强化合物组合使用。
[0506]
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中与peg-pla-peg聚合物组合使用的一种或多种附加转导增强化合物选自由以下项组成的组：
[0507]
·
特别地浓度在0.1mg/ml与5,000mg/ml之间；
[0508]
·
泊洛沙姆f108，特别地浓度在0.1mg/ml与5,000mg/ml之间；
[0509]
·
鱼精蛋白盐，特别地浓度在0.05μg/ml与25μg/ml之间；
[0510]
·
两性霉素b，特别地浓度在0.05μm与500μm之间；
[0511]
·
水飞蓟宾，特别地浓度在0.05μm与500μm之间；
[0512]
·
peg-plga-peg聚合物，特别地浓度在1μg/ml与5,000μg/ml之间；
[0513]
·
peg-pcl-peg聚合物，特别地浓度在1μg/ml与5,000μg/ml之间；
[0514]
·
纳他霉素，特别地浓度在0.05μm与500μm之间；
[0515]
·
米哚妥林，特别地浓度在2nm与500,000nm之间；
[0516]
·
制霉菌素，特别地浓度在0.1μm与1000μm之间；
[0517]
·
鲁索替尼，特别地浓度在0.01μm与10,000μm之间；
[0518]
·
氟达拉滨，特别地浓度在0.01μm与10,000μm之间；
[0519]
·
依维莫司，特别地浓度在0.1μm与10μm之间；
[0520]
·
白藜芦醇，特别地浓度在0.1μm与25μm之间；
[0521]
·
前列腺素e，特别地浓度在1μm与100μm之间；
[0522]
·
脱氧核糖核苷，特别地每种核苷的浓度在0.1mm与10mm之间；和/或
[0523]
·
它们的任何组合。
[0524]
必须注意peg-pla-peg聚合物和上面列出的化合物都可以以本文所公开的浓度中的任何浓度组合。
[0525]
在一个具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中peg-pla-peg与转导增强剂dmso组合，特别是以介于0.1％(v/v)与10％(v/v)之间的浓度组合；并且任选地与以上所列浓度中的任何浓度的以上所列化合物中的一种或多种化合物组合。
[0526]
应当理解的是，以上实施方式中所列出的所有化合物和化合物组合均以本文别处所公开的浓度或浓度范围中的任一者在本文中公开。
附图说明
[0527]
图1总结了三个独立实验的结果，其中用慢病毒自灭活基因疗法载体转导人cd34阳性hsc。这种载体编码处于mir223内部启动子控制下的人p47phox cdna。将细胞在仅存在硫酸鱼精蛋白的情况下(导致vcn被设置为100％)或在存在硫酸鱼精蛋白(ps)加一种或多种测试转导增强剂活性的化合物的情况下进行转导。在转导后10天至12天后，从转导细胞中分离出dna，并通过qpcr对vcn进行定量。相对于在仅硫酸鱼精蛋白存在下转导后实现的vcn的vcn增加被表示为“相对于ps的诱导倍数”。左小图：moi为1的转导。右小图：moi为3的
转导。pge2：前列腺素e2；amphob：两性霉素b。
[0528]
图2总结了三个独立实验的结果，其中用慢病毒自灭活基因疗法载体转导人cd34阳性hsc。将细胞在x-vivo 10培养基中在不存在转导增强剂的情况下或在存在测试转导增强剂活性的化合物的情况下进行转导。在转导后10天至12天后，从转导细胞中分离出dna，并通过qpcr对vcn进行定量。实线代表使用1mg/ml推荐浓度的lentiboost获得的平均vcn。pcl：peg-pcl-peg(14.2kda)；pla：peg-pla-peg(14.2kda)。
[0529]
图3总结了三个独立实验的结果，其中用慢病毒自灭活基因疗法载体转导人cd34阳性hsc。将细胞在besp1366f培养基中在不存在转导增强剂的情况下或在存在测试转导增强剂活性的化合物的情况下进行转导。在转导后10天至12天后，从转导细胞中分离出dna，并通过qpcr对vcn进行定量。实线代表使用1mg/ml推荐浓度的获得的平均vcn。
[0530]
图4总结了三个独立实验的结果，其中用慢病毒自灭活基因疗法载体转导人cd34阳性hsc。将细胞在besp1366f培养基中在存在鱼精蛋白、两性霉素b或它们的组合的情况下进行转导。在转导后10天至12天后，从转导细胞中分离出dna，并通过qpcr对vcn进行定量。实线代表在可比条件下使用1mg/ml推荐浓度的获得的平均vcn(参见图3中的实线)。虚线代表使用仅鱼精蛋白获得的平均vcn。
[0531]
图5总结了三个独立实验的结果，其中用慢病毒自灭活基因疗法载体转导人cd34阳性hsc。将细胞在besp1366f培养基中在存在两性霉素b、水飞蓟宾、米哚妥林或它们的组合的情况下进行转导，所述组合包含1mg/ml浓度的在转导后10天至12天后，从转导细胞中分离出dna，并通过qpcr对vcn进行定量。实线代表使用1mg/ml推荐浓度的获得的平均vcn。
[0532]
图6总结了三个独立实验的结果，其中用慢病毒自灭活基因疗法载体转导人cd34阳性hsc。将细胞在x-vivo 10培养基中在存在鱼精蛋白、peg-pcl-peg(14.2kda)、泊洛沙姆f108或它们的包含鱼精蛋白的组合的情况下进行转导。在转导后10天至12天后，从转导细胞中分离出dna，并通过qpcr对vcn进行定量。实线代表在可比条件下使用1mg/ml推荐浓度的获得的平均vcn(参见图2)。虚线代表使用仅鱼精蛋白获得的平均vcn。
[0533]
图7总结了三个独立实验的结果，其中用慢病毒自灭活基因疗法载体转导人cd34阳性hsc。将细胞在x-vivo 10培养基中在存在两性霉素b、鱼精蛋白、水飞蓟宾、米哚妥林或它们的包含的组合的情况下进行转导。在转导后10天至12天后，从转导细胞中分离出dna，并通过qpcr对vcn进行定量。实线代表使用1mg/ml推荐浓度的获得的平均vcn(参见图2)。
[0534]
图8总结了三个独立实验的结果，其中用慢病毒自灭活基因疗法载体转导人cd34阳性hsc。将细胞在x-vivo 10培养基中在存在两性霉素b、泊洛沙姆f108、peg-pcl-peg(14.2kda)或它们的包含两性霉素b的组合的情况下进行转导。在转导后10天至12天后，从转导细胞中分离出dna，并通过qpcr对vcn进行定量。实线代表在可比条件下使用1mg/ml推荐浓度的获得的平均vcn。虚线代表使用仅两性霉素b获得的平均vcn。
[0535]
图9总结了三个独立实验的结果，其中用慢病毒自灭活基因疗法载体转导人cd34阳性hsc。将细胞在x-vivo 10培养基中在存在水飞蓟宾、peg-pcl-peg(14.2kda)、泊洛沙姆f108或它们的包含水飞蓟宾的组合的情况下进行转导。在转导后10天至12天后，从转导细胞中分离出dna，并通过qpcr对vcn进行定量。实线代表在可比条件下使用1mg/ml推荐浓度的获得的平均vcn。虚线代表使用仅水飞蓟宾获得的平均vcn。
[0536]
图10总结了三个独立实验的结果，其中用慢病毒自灭活基因疗法载体转导人cd34阳性hsc。将细胞在x-vivo 10培养基中在存在米哚妥林、泊洛沙姆f108、peg-pcl-peg(14.2kda)或它们的包含米哚妥林的组合的情况下进行转导。在转导后10天至12天后，从转导细胞中分离出dna，并通过qpcr对vcn进行定量。实线代表在可比条件下使用1mg/ml推荐浓度的获得的平均vcn。虚线代表使用仅米哚妥林获得的平均vcn。
[0537]
图11总结了三个独立实验的结果，其中用慢病毒自灭活基因疗法载体转导人cd34阳性hsc。将细胞在x-vivo 10培养基中在存在peg-pcl-peg(14.2kda)、鱼精蛋白、两性霉素b、水飞蓟宾、米哚妥林或它们的包含peg-pcl-peg的组合的情况下进行转导。在转导后10天至12天后，从转导细胞中分离出dna，并通过qpcr对vcn进行定量。实线代表在可比条件下使用1mg/ml推荐浓度的获得的平均vcn(参见图2)。虚线代表使用仅peg-pcl-peg获得的平均vcn。
[0538]
图12总结了三个独立实验的结果，其中用慢病毒自灭活基因疗法载体转导人cd34阳性hsc。将细胞在x-vivo 10培养基中在存在泊洛沙姆f108、水飞蓟宾、米哚妥林、两性霉素b、鱼精蛋白或它们的包含泊洛沙姆f108的组合的情况下进行转导。在转导后10天至12天后，从转导细胞中分离出dna，并通过qpcr对vcn进行定量。实线代表在可比条件下使用1mg/ml推荐浓度的获得的平均vcn(参见图2)。虚线代表使用仅泊洛沙姆f108获得的平均vcn。
[0539]
图13总结了三个独立实验的结果，其中以moi 20用慢病毒自灭活基因疗法载体转导人cd34阳性hsc。将细胞在不存在和存在1％dmso的情况下进行转导。
实施例
[0540]
实施例1：以moi 1、moi 3或moi 5进行的转导
[0541]
将来自健康供体的解冻细胞以0.5e6个细胞/cm2的密度和1e6个细胞/ml的浓度在容纳有补充有1％人血清白蛋白、300ng/ml干细胞因子(scf)、300ng/ml的fms样酪氨酸激酶3(flt-3)配体(flt3-lig)和100ng/ml的血小板生成素(tpo)的x-vivo 20培养基的96孔板中培养达22h，任选地之后用下述化合物预刺激2h。此后，将细胞在下述化合物和硫酸鱼精蛋白的存在下孵育12小时以供用慢病毒sin基因疗法载体进行转导。在12h的转导时段后，用上述培养基更换培养基，并将细胞转移到12孔板中，在所述12孔板中取决于细胞密度将所述细胞在1ml的体积中培养5天至7天。此后，用新鲜培养基更换培养基，并将细胞在2ml中再培养6天。在转导后第12天，分离出dna，并通过qpcr定量载体拷贝数(vcn)。所有实验均一式三份地进行。对于阴性对照，如所述培养一式三份的未转导细胞。为了确定在仅硫酸鱼精蛋白存在下转导效力的基线，将细胞在4μg/ml硫酸鱼精蛋白存在下与moi 1、moi 3或moi 5
的慢病毒sin载体一起孵育。为了在潜在转导增强剂存在下进行转导，将细胞与moi 1、moi 3或moi 5的慢病毒sin载体一起在以下物质存在下进行孵育：
[0542]
i)5μm的水飞蓟宾、4μg/ml的硫酸鱼精蛋白；
[0543]
ii)5μm的白藜芦醇、4μg/ml的硫酸鱼精蛋白；
[0544]
iii)1μm的依维莫司、4μg/ml的硫酸鱼精蛋白；
[0545]
iv)0.4μm的米哚妥林、4μg/ml的硫酸鱼精蛋白；
[0546]
v)1μg/ml的两性霉素b、4μg/ml的硫酸鱼精蛋白；
[0547]
vi)100μm的制霉菌素、4μg/ml的硫酸鱼精蛋白；
[0548]
vii)3μm的纳他霉素、4μg/ml的硫酸鱼精蛋白；
[0549]
viii)10μm的前列腺素e2、4μg/ml的硫酸鱼精蛋白；
[0550]
ix)1mg/ml的4μg/ml的硫酸鱼精蛋白；
[0551]
x)1,000μg/ml的泊洛沙姆symperonic4μg/ml的硫酸鱼精蛋白；
[0552]
xi)1,000μg/ml的聚(乙二醇)-b-聚(d,l-乳酸-共聚-乙醇酸)-b-聚(乙二醇)(peg-plga-peg)，其具有在两个末端处的5kda的聚(乙二醇)嵌段，和中央4.2kda的聚(d,l-乳酸-共聚-乙醇酸)嵌段，被称为peg5k-b-pla4.2k-b-peg5k；
[0553]
xii)10μg/ml的甲氧基聚(乙二醇)-聚(ε-己内酯)-甲氧基聚(乙二醇)(peg-pcl-peg)，其具有在两个末端处的5kda的聚(乙二醇)嵌段和中央的4.2kda的聚(ε-己内酯)嵌段，被称为peg5k-b-pcl4.2k-b-peg5k；
[0554]
xiii)50μg/ml的聚(乙二醇)/聚(丙交酯)/聚(乙二醇)(peg-pla-peg)，其具有在两个末端处的5kda聚(乙二醇)嵌段和中央的4.2kda聚(丙交酯)嵌段，被称为peg5k-b-pla4.2k-b-peg5k
[0555]
xiv)50μg/ml的甲氧基聚(乙二醇)-聚(ε-己内酯)-甲氧基聚(乙二醇)(peg-pcl-peg)，其具有中央的2.4kda的聚(ε-己内酯)嵌段和都共价连接至氨基的在两个末端处的5.3kda的聚(乙二醇)嵌段，被称为nh2-peg5.3k-b-pcl2.4k-b-peg5.3k-nh2；
[0556]
xv)脱氧核糖核苷，其中每种脱氧核糖核苷的终浓度为300μm，
[0557]
或它们的组合。
[0558]
在10天至12天后，由于平板中细胞的增殖，未整合的前病毒dna被稀释，然后通过qpcr对vcn进行定量。每种条件都一式三份地测试，并且计算了每种单独条件的一式三份重复的vcn的平均值。为了评估所测试的化合物的转导增强活性，将在硫酸鱼精蛋白存在下转导的细胞的平均vcn设置为1，并将转导增强表示为相对于在仅硫酸鱼精蛋白存在下的转导增加x倍。
[0559]
本发明人已经惊奇地观察到慢病毒转导效率的以下增加(参见图1)：
[0560]
moi为1：
[0561][0562]
moi为3：
[0563][0564]
相对于没有使用转导增强剂的转导，用300μm的每种脱氧核糖核苷或用10μg/ml的bab型三嵌段聚合物pcl补充cd34阳性细胞使vcn分别增加了1.89倍或1.81倍。
[0565]
实施例2：在泊洛沙姆f108和聚凝胺存在下的转导(moi 5)
[0566]
将人cd34 hsc以1e6个细胞/ml的密度在补充有1％人血清白蛋白、300ng/ml的scf、300ng/ml的flt3-lig.和100ng/ml的tpo的x-vivo 20培养基中通过慢病毒自灭活基因疗法载体进行转导，所述慢病毒自灭活基因疗法载体包含在编码人p47phox的mir223启动子控制下的cdna。转导过程包括在泊洛沙姆f108(1,000μg/ml)和聚凝胺(8μg/ml)存在下的2h预刺激时段，之后是在泊洛沙姆f108(1,000μg/ml)和聚凝胺(8μg/ml)存在下经预刺激的细胞与基因疗法载体一起以moi 5进行的12h孵育。
[0567]
实施例3：在peg-pcl-peg聚合物和米哚妥林存在下的转导(moi 5)
[0568]
将人cd34 hsc以1e6个细胞/ml的密度在补充有1％人血清白蛋白、300ng/ml的scf、300ng/ml的flt3-lig和100ng/ml的tpo的x-vivo 20培养基中通过慢病毒自灭活基因疗法载体进行转导。转导过程包括在硫酸鱼精蛋白(4μg/ml)加peg-pcl-peg聚合物(4μg/ml)和米哚妥林(0.4μm)存在下的2h预刺激时段，之后是在硫酸鱼精蛋白(4μg/ml)加peg-pcl-peg聚合物(4μg/ml)和米哚妥林(0.4μm)存在下经预刺激的细胞与基因疗法载体一起以moi 5进行的12h孵育。
[0569]
实施例4：在两性霉素b存在下的转导(moi 5)
[0570]
将人cd34 hsc以1e6个细胞/ml的密度在补充有1％人血清白蛋白、300ng/ml的scf、200ng/ml的flt3-lig.和100ng/ml的tpo的x-vivo 20培养基中通过慢病毒自灭活基因疗法载体进行转导，所述慢病毒自灭活基因疗法载体包含在编码p47phox的mir223启动子控制下的cdna。转导过程包括在1μg/ml的两性霉素b和4μg/ml的硫酸鱼精蛋白存在下的2h预刺激时段，之后是在1μg/ml的两性霉素b和4μg/ml的硫酸鱼精蛋白存在下经预刺激的细胞与基因疗法载体一起以moi 5进行的12h孵育。
[0571]
实施例5：以moi 10进行的转导
[0572]
使用市售的匿名人cd34 造血干细胞(hsc)来测试转导增强剂或转导增强剂组合对逆转录病毒转导效率的增强。所有实验条件都一式三份地测试，并且最终结果表示为每个一式三份重复的单独结果的平均值。
[0573]
对于转导，使用慢病毒自灭活(sin)载体，所述载体包含作为内部启动子的mir223启动子和作为转基因的编码p47phox的cdna。以moi 10独立进行了三次测试，其中将hsc以0.5e6个细胞/cm2的密度和1e6个细胞/ml的浓度在x-vivo 10培养基存在下或在besp1366f培养基存在下进行逆转录病毒转导，所述培养基补充有1％人血清白蛋白、300ng/ml的干细胞因子(scf)、300ng/ml的fms样酪氨酸激酶3(flt-3)配体(flt3-lig)和100ng/ml的血小板生成素(tpo)。
[0574]
在转导之前，将hsc用上述培养基和细胞因子在96孔板中培养22h，任选地之后在上述没有基因疗法载体的培养基中用下述化合物预刺激2h，在此之后在不改变培养基(不含化合物)的情况下将细胞与慢病毒sin基因疗法载体以moi 10一起孵育12h以进行转导。在12h的转导时段后，用上述培养基(包含补充剂)更换培养基，并将细胞转移到12孔板中，在所述12孔板中根据细胞密度将所述细胞在1ml体积的上述培养基(包含补充剂)中培养5天至7天。此后，用具有上述组成的新鲜培养基(包含补充剂)更换培养基，并将细胞在2ml培养基中再培养6天。
[0575]
在转导后第12天，确定细胞数量，分离出dna，并通过qpcr定量vcn。将在12天内从经转导的cd34 hsc产生的细胞数与从未转导的hsc产生的细胞数进行比较。经转导的细胞数未达到未转导的细胞的细胞数的65％被视为使用用于转导增强的化合物的工序的毒性的指示。这些样品被排除在分析之外。
[0576]
为了在潜在转导增强剂的存在下进行转导，将细胞在以下物质存在下孵育：
[0577]
i)4μg/ml、6μg/ml或8μg/ml的鱼精蛋白；
[0578]
ii)0.5mg/ml、0.75mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml或2.5mg/ml的
[0579]
iii)0.5μg/ml、0.75μg/ml或1μg/ml的两性霉素b；
[0580]
iv)1μm或5μm的水飞蓟宾；
[0581]
v)100nm、200nm或400nm的米哚妥林；
[0582]
vi)4μg/ml或10μg/ml的pcl；
[0583]
vii)0.5mg/ml、1mg/ml或2mg/ml的泊洛沙姆f108；或者
[0584]
viii)10μg/ml的pla。
[0585]
结果总结在图2和图3中。
[0586]
此外，测试了转导增强剂组合。为了在潜在转导增强剂的存在下进行转导，将细胞在以下物质存在下孵育：
[0587]
i)4μg/ml的鱼精蛋白和0.75μg/ml的两性霉素b；或者
[0588]
ii)4μg/ml的鱼精蛋白和10μg/ml的pcl；或者
[0589]
iii)4μg/ml的鱼精蛋白和1mg/ml的泊洛沙姆f108；或者
[0590]
iv)1mg/ml的和1μg/ml的两性霉素b；或者
[0591]
v)1mg/ml的和0.75μg/ml的两性霉素b；或者
[0592]
vi)1mg/ml的和0.5μg/ml的两性霉素b；或者
[0593]
vii)1mg/ml的和1μm的水飞蓟宾；或者
[0594]
viii)1mg/ml的和100nm的米哚妥林；或者
[0595]
ix)1mg/ml的和200nm的米哚妥林；或者
[0596]
x)1mg/ml的和400nm的米哚妥林；或者
[0597]
xi)1mg/ml的和4μg/ml的鱼精蛋白；或者
[0598]
xii)1mg/ml的和5μm的水飞蓟宾；或者
[0599]
xiii)1μg/ml的两性霉素b和1mg/ml的泊洛沙姆f108；或者
[0600]
xiv)1μg/ml的两性霉素b和10μg/ml的pcl；或者
[0601]
xv)5μm的水飞蓟宾和10μg/ml的pcl；或者
[0602]
xvi)5μm的水飞蓟宾和1mg/ml的泊洛沙姆f108；或者
[0603]
xvii)400nm的米哚妥林和1mg/ml的泊洛沙姆f108；或者
[0604]
xviii)400nm的米哚妥林和10μg/ml的pcl。
[0605]
转导增强剂组合的结果总结在图4至图12中。
[0606]
实施例5：以moi 20进行的转导
[0607]
将人cd34 hsc以1e6个细胞/ml的密度在补充有1％人血清白蛋白、300ng/ml的scf、300ng/ml的flt3-lig和100ng/ml的tpo的x-vivo 20培养基中通过慢病毒自灭活基因疗法载体进行转导。转导过程包括在1％dmso存在下的2h预刺激时段，之后是在1％dmso存在下经预刺激的细胞与基因疗法载体一起以moi 20进行的16h孵育。
[0608]
在不存在dmso的情况下的载体拷贝数(vcn)为0.915，并且在dmso存在下的vcn为1.16。因此dmso显示为具有转导增强效应。结果汇总在图13中。