肝脏和心血管病症的治疗

肝脏和心血管病症的治疗
1.发明背景
2.代谢综合征是五种以下医学状况中的至少三种的聚集：中心性肥胖、高血压、高血糖、高血清甘油三酯和低血清高密度脂蛋白(hdl)。
3.根据美国心脏协会(american heart association)，当一个人具有三个或多个以下测量值时会发生代谢综合征：
[0004]-腹部肥胖(男性腰围大于40英寸，女性腰围大于35英寸)。
[0005]-每分升血液150毫克(mg/dl)或更高的甘油三酯水平。
[0006]-男性低于40mg/dl或女性低于50mg/dl的hdl胆固醇。
[0007]-130毫米汞柱(mm hg)或更高的收缩压(最高值)，或85mm hg或更高的舒张压(最低值)。
[0008]-100mg/dl或更高的空腹血糖。
[0009]
代谢综合征与发生心血管疾病(cvd)、2型糖尿病和/或脂肪肝，例如非酒精性脂肪肝疾病(nafld)的风险相关。
[0010]
nafld通常是指一系列肝脏脂质紊乱，其特征在于在很少饮酒或不饮酒的人中的肝脏脂肪堆积(脂肪变性)。nafld也被定义为范围从肝脏脂肪堆积(单纯性脂肪变性)到非酒精性脂肪性肝炎(nash)的进行性肝疾病。
[0011]
nash是肝脏的进行性疾病，其组织学特征在于肝脏脂质积累、肝细胞损伤和类似于酒精性肝炎的炎症。nash是可能导致晚期纤维化(也称为“nash相关纤维化”)、肝硬化、肝功能衰竭和/或hcc(肝细胞癌)的过程中的关键阶段。大量酒精摄入缺乏的详细病史对于确定这一诊断至关重要。nash是转诊给肝病专家的患者中转氨酶升高的最常见原因之一。nash通常与能量代谢病理学有关，包括肥胖、血脂异常、糖尿病和代谢综合征。
[0012]
nash是代谢综合征的肝脏表达。
[0013]
肝脏胆固醇稳态的广泛失调驱动进行性肝脏炎症和纤维化，并己在nash中得到证实。这种失调发生在多个层面，包括胆汁中的胆固醇无论是作为胆固醇还是胆汁酸排泄减少[13]。
[0014]
因此，认为胆固醇循环水平在代谢综合征中，特别是在该综合征中的血脂异常模式中起重要作用。
[0015]
在人体内循环的胆固醇由血浆脂蛋白携带，所述血浆脂蛋白是在血液中转运脂质的复杂脂质和蛋白质组合物的颗粒。携带胆固醇的两种血浆脂蛋白是低密度脂蛋白(“ldl”)和高密度脂蛋白(“hdl”)。ldl颗粒被认为负责将胆固醇从肝脏(其中胆固醇被合成或从饮食来源获得)输送到体内的肝外组织。另一方面，hdl颗粒被认为负责将胆固醇从肝外组织转运到肝脏，其中胆固醇被分解代谢和消除。从肝外组织到肝脏的这种胆固醇转运被称为“胆固醇逆向转运”。
[0016]
胆固醇逆向转运(“rct”)途径是多步骤过程，其包括：(i)hdl介导的流出，即从多种外周细胞池中初步去除胆固醇；(ii)通过卵磷脂：胆固醇酰基转移酶(“lcat”)的作用使胆固醇酯化，从而防止流出的胆固醇重新进入细胞，(iii)肝细胞的hdl内吞作用和(iv)胆
固醇从hdl直接或转化为胆汁酸后排泄到胆汁中。
[0017]
rct途径由hdl颗粒介导。在[1]中描述了肝脏中hdl内吞作用的途径，其涉及“细胞表面f1fo-atpase”(也称为“ecto f1fo-atpase”)和调节hdl-胆固醇去除的p2y13受体。在[2]中描述了在肝细胞的细胞表面存在的f1-atpase亚基的核苷酸酶活性(以下称“f1-atpase活性”)(以下称“ecto-f1-atpase活性”)，允许atp水解为adp，其进而刺激导致细胞摄取hdl的p2y13受体活性。参考文献[3]和[14]证实了小鼠中p2y13受体和胆固醇逆向转运与动脉粥样化形成的关系。
[0018]
在内皮细胞的细胞表面，f1-atpase活性将细胞外atp水解为adp，其进而刺激p2y1受体活性，导致内皮一氧化氮合酶(enos)产生一氧化氮并促进信号转导存活通路[15][5]。
[0019]
根据上文，f1-atpase激活剂是用于治疗代谢综合征、心血管疾病(cvd)、非酒精性脂肪肝疾病(nafld)或胆汁淤积性肝疾病的有希望的治疗类别。
[0020]
已知载脂蛋白a-i(apoa-i)是f1-atpase激活剂[1]。与细胞表面f1fo-atpase结合的apoa-i会刺激其atpase活性(f1-atpase活性)，其产生细胞外二磷酸腺苷(adp)，这是被称为抑制因子1(if1)的f1-atpase抑制剂阻止的过程[1]。已经显示，apoa-i及其模拟物具有极好的潜力，以在临床上用于治疗代谢综合征，例如心血管疾病(cvd)[4]。然而，即使早已经确定了临床原理证据，apoa-i及其模拟物也从未达到药物状态。
[0021]
因此需要鉴定可用作药物，特别是用于治疗代谢综合征、心血管疾病(cvd)、非酒精性脂肪肝疾病(nafld)或胆汁淤积性肝疾病的新f1-atpase激活剂。
[0022]
发明概述
[0023]
发明人已经惊奇地发现成熟人ifl(seq id no：1)的肽10-40是f1-atpase激活剂，其可用作药物，特别是用于治疗代谢综合征、心血管疾病(cvd)、非酒精性脂肪肝病(nafld)或胆汁淤积性肝疾病。
[0024]
因此，本发明涉及包含与seq id no：1的氨基酸序列(rgagsireaggafgkreqaeeeryfraqsre)具有至少70％序列同一性的肽的肽，其中所述肽是f1-atpase激活剂。
[0025]
本发明还涉及药物组合物，其包含治疗活性量的根据本发明的肽和药学上可接受的赋形剂(vehicle)或载体。
[0026]
本发明还涉及用作药物的根据本发明的肽或根据本发明的药物组合物，特别是用于治疗代谢综合征、非酒精性脂肪肝疾病(nafld)、心血管疾病(cvd)或胆汁淤积性肝疾病。
[0027]
本发明还涉及编码根据本发明的肽的核苷酸序列、包含根据本发明的核苷酸序列的载体和包含根据本发明的核苷酸序列的细胞。
[0028]
发明详述
[0029]
定义
[0030]
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0031]
冠词“a”、“an”和“the”在本文中用于指代冠词的语法对象中的一个或多于一个(即，至少一个)。
[0032]
本说明书通篇对“一个实施方案”、“实施方案”、“特定实施方案”、“某个实施方案”、“另外的实施方案”、“进一步的实施方案”或其组合的引用意指结合实施方案描述的特
定特点、结构或特征包括在本发明的至少一个实施方案中。
[0033]
术语“肽”是指氨基酸序列，即通过肽键连接的氨基酸链，并且可以包括修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、n-和/或c-末端修饰，以及本领域己知的其他修饰以与没有所述修饰的肽相比，增加肽的稳定性、其体内半衰期和/或其细胞渗透性。所述修饰可以是例如肽与至少一种长效分子的至少一种共价附接，例如在n-或c-末端。
[0034]
如本文所用，术语“氨基酸”意在包括天然和合成氨基酸，以及d和l氨基酸。
[0035]
出于本发明的目的，“同一性”或“同源性”通过在比较窗口中比较两个比对序列来计算。序列的比对使得可以确定比较窗口中两个序列共有的位置(核苷酸或氨基酸)的数量。然后将共有位置的数量除以比较窗口中的位置总数并乘以100以获得同源性百分比。可以手动或通过使用众所周知的计算机程序完成序列同一性百分比的测定。在本发明的特定实施方案中，同一性或同源性对应于1至8个置换，例如1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸残基的置换。优选地，至少一个置换是保守氨基酸置换。“保守氨基酸置换”是指一个氨基酸被具有相似侧链的另一个氨基酸替代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸家族，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
[0036]
术语“长效分子”意指与未附接于所述长效分子的肽相比，可以附接于肽并且增加所述肽的体内半衰期的分子。特别地，与未附接于所述长效分子的所述肽的体内半衰期相比，附接于所述长效分子的肽的体内半衰期高至少2倍，优选高至少5倍，例如高至少10倍，例如高至少20倍。根据本发明，长效分子可以是脂肪酸、白蛋白、聚乙二醇(peg)和/或免疫球蛋白g的fc部分。
[0037]
根据本发明的术语“脂肪酸”是指由烃链和末端羧基组成的羧酸，尤其是在脂肪和油中以酯形式存在的任何那些。根据本发明，脂肪酸提高肽的半衰期。一方面，脂肪酸是棕榈酸。在另一方面，脂肪酸包括但不限于十五烷酸、十七烷酸、硬脂酸、十九烷酸、花生酸、二十一烷酸、二十二烷酸、二十三烷酸、二十四烷酸、二十五烷酸、ω-羧基十五烷酰基(c16-二酸)、ω-羧基十七酰基(c18-二酸)或任何其他饱和脂肪酸。在又一个方面，脂肪酸包括但不限于亚油酸、花生四烯酸、硬脂酸、棕榈油酸、异油酸、二十烯酸、油酸或任何其他不饱和脂肪酸。
[0038]
术语“白蛋白”意指在肝脏中产生并形成所有血浆蛋白的大部分的血浆蛋白，例如人血清白蛋白(hsa，cas号：70024-90-7)。
[0039]
术语“聚乙二醇”或“peg”是指任何水溶性聚(乙二醇)或聚(环氧乙烷)。表述peg将包含结构(ch2ch2o)
n-，其中n是2至约1000的整数。常用的peg是封端的peg，其中peg末端的一端用相对不活跃基团，例如烷氧基封端，而另一端是羟基，其可以被接头部分进一步修饰。常用的封端基团是甲氧基，相应的封端peg通常表示为mpeg。因此，mpeg是ch3o(ch2ch2o)
n-，其中n是2至约1000的整数，其足以为整个peg部分给出指示的平均分子量，例如对于mpeg mw 2,000，n为约44(随着批次的变化而变化的数字)。通常使用peg的概念来代替mpeg。后跟数字(不是下标)的“peg”表示近似分子量等于该数字的peg部分。因此，“peg2000”是具有大约2000分子量的peg部分。
[0040]
术语“免疫球蛋白g的fc部分”是指成对的一组抗体重链结构域，每个结构域具有与ch3融合的ch2，其形成约50kda的结构。
[0041]
术语“药学上可接受的”意指经联邦或州政府的监管机构批准或列于美国或欧洲药典或其他公认的用于动物和人类的药典中。
[0042]“药物组合物”意指包含药学上可接受的载体的组合物。例如，载体可以是利用其施用治疗剂的稀释剂、佐剂、辅药(excipient)或赋形剂(vehicle)。这样的药物载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当通过静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。盐水溶液和右旋糖和甘油水溶液也可以用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的药物载体包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。当药物组合物适合口服施用时，可以通过常规方法，利用药学上可接受的载体，例如粘合剂(例如预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石粉或二氧化硅)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或羟基乙酸淀粉钠)；或润湿剂(例如十二烷基硫酸钠)来制备片剂或胶囊剂。片剂可以通过本领域熟知的方法进行包衣。用于口服施用的液体制剂可以采取例如溶液、糖浆或混悬液的形式，或者它们可以呈现为干燥产品，用于在使用前用水或其他合适的赋形剂(vehicle)配制。这种液体制剂可以通过常规方法，利用药学上可接受的添加剂，例如悬浮剂(例如山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯胶)；非水赋形剂(vehicle)(例如杏仁油、油性酯、乙醇或分馏植物油)；和防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)来制备。制剂适当时还可以含有缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。
[0043]
术语“载体”在本文中用于指物质组合物，其包含分离的核酸并且可用于将分离的核酸递送至细胞内部。许多载体是本领域已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还应解释为包括促进核酸转移或递送至细胞的非质粒和非病毒化合物，例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、重组病毒载体等。非病毒载体的实例包括但不限于脂质体、dna的聚胺衍生物等。根据本发明，载体可以是表达载体。
[0044]
术语“表达载体”是指包含多核苷酸的载体，所述多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列有效连接的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其他元件可由宿主细胞或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域己知的所有载体，例如粘粒、质粒(例如裸露的或包含在脂质体中的)和掺入多核苷酸的病毒。
[0045]
化合物的“有效量”或“治疗有效量”是足以为向其施用化合物的受试者提供有益效果的化合物的量。
[0046]
术语“施用”包括通过任何数量的途径和手段施用本发明的肽或组合物，所述途径和手段包括但不限于局部、口服、口腔、静脉内、肌肉内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、透皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下、阴道、眼、肺或直肠方式，优选静脉内。
[0047]
如本文所用，术语“受试者”、“患者”或“个体”是指人类或非人类哺乳动物(例如啮
齿动物(小鼠、大鼠)、猫科动物、犬科动物或灵长类动物)受到或可能受到代谢综合征、非酒精性脂肪肝疾病(nafld)、心血管疾病(cvd)或胆汁淤积性肝疾病的影响。优选地，受试者是人，男人或女人。
[0048]
术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”意指逆转、减轻、抑制该术语所适用的病症或状况或该病症或状况的一种或多种症状的进展或预防该术语所适用的病症或状况或该病症或状况的一种或多种症状。
[0049]
肽和组合物
[0050]
本发明涉及肽，其包含与seq d no：1的氨基酸序列具有至少70％，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、例如至少80％、如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、例如至少90％、如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的肽。因此，本发明涉及这样的肽，其包含与seq id no：1的氨基酸序列相比，具有1至8个置换，例如1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸残基置换的肽。
[0051]
本发明的肽是f1-atpase激活剂。可以如实施例中详述测量f1-atpase的激活。f1-atpase可以是人f1-atpase或非人哺乳动物f1-atpase(例如啮齿动物(小鼠、大鼠)、猫科动物、犬科动物或灵长类动物)。优选地，本发明的肽是人f1-atpase激活剂。
[0052]
在一些实施方案中，本发明的肽是与seq id no：1的氨基酸序列具有至少70％、例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、例如至少80％、如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、例如至少90％、如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的肽。因此，本发明涉及与seq d no：1的氨基酸序列相比，具有1至8个置换，例如1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸残基置换的肽。
[0053]
根据本发明的肽可以在n-末端、c-末端被修饰和/或具有内部修饰，以增加所述肽的稳定性、功效和/或半衰期。n-末端修饰可以是例如乙酰化、生物素化、丹磺酰化、2，4-二硝基苯基化和/或长效分子的附接。c-末端修饰可以是例如酰胺化和/或长效分子的附接。内部修饰可以是半胱氨酸脲甲基化(carbamidomethylation)、氨基酸置换、氨基酸替换为氨基异丁酸(aib)、磷酸化和/或长效分子的附接。肽可以包含一种或多种修饰。
[0054]
在一个实施方案中，根据本发明的肽具有n-末端乙酰化。n-末端乙酰化去除肽n-末端的正电荷。这种修饰通过防止n-末端降解来增加肽的稳定性。
[0055]
在另一个实施方案中，根据本发明的肽具有c-末端酰胺化，即肽的c-末端被合成为酰胺以中和由c-末端cooh产生的负电荷。添加此修饰以防止酶降解。
[0056]
因此，本发明包括具有n-末端乙酰化和c-末端酰胺化的肽，即本发明的肽具有下式：ch3co-[包含与seq id no：1的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的肽的肽]-nh2。
[0057]
在具体的实施方案中，本发明的肽可以具有下式：ch3co-[与seq id no：1的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的肽]-nh2。因此，本发明的肽可以具有下式ch3co-[与seq id no：1的氨基酸序列相比具有1至8个置换的肽]-nh2。
[0058]
在优选的实施方案中，本发明的肽具有下式：
[0059]
ch3co-[包含具有序列seq id no：1的肽的肽]-nh2(i)。
[0060]
在特别优选的实施方案中，当本发明的肽是具有seq id no：1的氨基酸序列的肽时，本发明的肽具有下式(i)：
[0061]
ch3co-[seq id no：1]-nh2ꢀꢀ
(i)。
[0062]
在图1a中表示式(i)。
[0063]
在另一个实施方案中，根据本发明的肽通过在氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基处附接至少一个长效分子来修饰，所述长效分子选自由白蛋白、白蛋白结合小分子(如肉豆蔻酸、萘酰基磺酰胺、二苯基环己醇磷酸酯和6-(4-(4-碘苯基)丁酰胺基)己酸酯)、脂肪酸、脂肪二酸、免疫球蛋白g的fc部分、聚乙二醇(peg)、天然聚合物如聚唾液酸(psa或羟乙基淀粉(hes)、基于长非结构化肽的重组peg模拟物，如由gly4ser重复序列和多肽xten组成的同型氨基酸聚合物(hap)。长效分子附接到肽上从而增加所述肽的血清半衰期。氨基酸和/或接头如2-氨基乙氧基-2乙氧基乙酰基(aeea)和低聚乙二醇(oeg)接头可以插入到seq d no：1和长效分子之间以避免空间位阻。
[0064]
在一些实施方案中，本发明的肽通过在氨基酸序列的c-末端附接至少一个长效分子来修饰。所述长效分子可以直接或通过接头附接到氨基酸序列的c-末端。接头优选是一个或多个氨基酸，例如1至10个氨基酸，如1至5个氨基酸，其将肽连接至长效分子。在一些实施方案中，接头是一个氨基酸，如丙氨酸(a)或赖氨酸(k)。
[0065]
peg附接到肽上称为聚乙二醇化。短的双功能peg(聚(乙二醇))可用作肽与其他分子生物缀合的间隔物。peg生物缀合用于改善肽的蛋白水解稳定性、生物分布和溶解度。在现有技术中，例如在[18]中详细描述了聚乙二醇化的技术。
[0066]
在特定的实施方案中，长效分子是脂肪酸分子，如棕榈酸。特别地，本发明的肽通过在氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基处附接至少一个脂肪酸分子来修饰，优选地所述肽通过在氨基酸序列的c-末端附接一个脂肪酸分子，如棕榈酸来修饰。
[0067]
棕榈酸(在本说明书中，特别是在下式中也称为“棕榈酰”)是具有下式的16-碳脂肪酸：
[0068][0069]
棕榈酸与本发明的肽缀合以增加其细胞渗透性并有助于肽与细胞膜的结合。
[0070]
脂肪酸可以通过化学环加成附接到本发明的肽上。一方面，该化学环加成包括铜催化的炔烃-叠氮化物环加成。在另一方面，环加成包括但不限于过渡金属催化或介导的[5 1]环加成、正式的[3 3]环加成和裂环反应。
[0071]
在优选的实施方案中，脂肪酸直接或通过接头附接到氨基酸序列的c-末端上。接头优选是一个或多个氨基酸，例如1到10个氨基酸，如1到5个氨基酸，其将肽连接到长效分子。在一些实施方案中，接头是一个氨基酸，如丙氨酸(a或ala)或赖氨酸(k或lys)。
[0072]
因此，本发明包括具有下式的肽：ch3co-[包含与seq id no：1的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的肽的肽]-k-[棕榈酰基]-nh2，如下式ch3co-[与seq id no：1的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的肽]-k-[棕榈酰基]-nh2。在优选的实施方案中，本发明的肽具有式ch3co-[包含具有序列seq id no：1的肽的肽]-k-[棕榈酰]-nh2，如式(ii)的肽：
[0073]
ch3co-[seq id no：1]-k-[棕榈酰基]-nh2(ii)。
[0074]
在图1b中表示式(ii)。
[0075]
在本说明书中，术语“至少70％的序列同一性”包括“至少70％，如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、例如至少80％、如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、例如至少90％、如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性”。
[0076]
本发明还涉及包含治疗活性量的根据本发明的肽和药学上可接受的赋形剂(vehicle)或载体的药物组合物。
[0077]
治疗用途
[0078]
本发明涉及根据本发明的肽或根据本发明的药物组合物，其用作药物，特别是用于治疗代谢综合征、非酒精性脂肪肝疾病(nafld)、心血管疾病(cvd)或胆汁淤积性肝疾病。
[0079]
可通过施用本发明的肽或其组合物治疗的代谢综合征、心血管疾病(cvd)、非酒精性脂肪肝疾病(nafld)或胆汁淤积性肝疾病的非限制性实例包括：
[0080]
(i)代谢综合征，其包括脂蛋白代谢障碍、异常脂蛋白血症、脂蛋白过度产生或缺乏、总胆固醇升高、低密度脂蛋白浓度升高、甘油三酯浓度升高、高密度脂蛋白胆固醇降低、胆汁和粪便中的脂质消除、胆汁和粪便中的磷脂消除、胆汁和粪便中的氧甾醇消除、胆汁和粪便中的胆汁酸消除，以及过氧化物酶体增殖物激活的受体相关障碍；
[0081]
(ii)代谢综合征，其包括葡萄糖代谢障碍、胰岛素抵抗、葡萄糖耐量受损、空腹血糖水平受损、糖尿病、脂肪营养不良、中心性肥胖、外周脂肪萎缩、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、肾病和败血症；
[0082]
(iii)心血管疾病或相关血管疾病，其包括高血压、冠状动脉疾病、心肌梗塞、中风、心律失常、心房纤颤化、心脏瓣膜病、心力衰竭、心肌病、心包炎和阳痿；
[0083]
(iv)非酒精性脂肪性肝疾病(nafld)，其包括肝脂肪变性和非酒精性脂肪性肝炎(nash)；
[0084]
(v)胆汁淤积性肝疾病，其包括原发性胆汁性胆管炎(pbc，以前称为原发性胆汁性肝硬化)和原发性硬化性胆管炎(psc)。
[0085]
如本文所用，术语“脂蛋白代谢障碍”是指“血脂异常”。血脂异常包括但不限于高血脂和高密度脂蛋白(hdl)胆固醇的低血液水平。因此，根据本发明的肽或其组合物还可以改变受试者的脂质代谢，例如增加受试者血液中的hdl胆固醇和/或hdl颗粒数，降低受试者血液中的ldl，改善hdl代谢，改善受试者的hdl功能，减少受试者血液中的游离甘油三酯和/或增加受试者血液中hdl与ldl的比率。
[0086]
如本文所用，术语“葡萄糖代谢的障碍”或“葡萄糖代谢障碍”涉及异常的葡萄糖储存和/或利用。就一种或多种葡萄糖代谢指标(即血胰岛素、血糖)异常高的程度而言，将本发明的肽或其组合物施用于受试者以恢复正常水平。相反，就一种或多种葡萄糖代谢指标异常低的程度而言，将本发明的肽或其组合物施用于受试者以恢复正常水平。葡萄糖代谢的正常指标为本领域技术人员所熟知。葡萄糖代谢障碍包括但不限于：葡萄糖耐量受损；糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病、胰岛素抵抗；与胰岛素抵抗相关的癌症，如乳腺癌、结肠癌或前列腺癌；糖尿病，包括但不限于非胰岛素依赖型糖尿病(niddm)、胰岛素依赖型糖尿病(iddm)、妊娠期糖尿病(gdm)和青少年成年发病型糖尿病(mody)；胰腺炎；高血压；多囊卵巢
疾病；和高水平的血液胰岛素或葡萄糖，或两者兼有之。
[0087]
如本文所用，术语“心血管疾病”或“cvd”是指心脏或循环系统的疾病。心血管疾病可能与异常脂蛋白血症或异常血脂或两者有关。心血管疾病包括但不限于动脉硬化；动脉粥样硬化；中风；缺血；血管周围疾病(pvd)；短暂性脑缺血发作(tia)，闪电状(fulgurant)动脉粥样硬化；器官移植动脉粥样硬化；内皮功能障碍，特别是影响血管弹性的那些功能障碍；外周血管疾病；冠状动脉心脏疾病；心肌梗塞；脑梗塞和再狭窄。心血管疾病症状的非限制性实例包括心绞痛、气短、头晕、恶心、疲劳、心律不齐和阳痿。在一些实施方案中，心血管疾病的治疗治疗心血管疾病的一种或多种症状。在一些实施方案中，心血管疾病的治疗治疗阳痿。
[0088]
在优选的实施方案中，nafld是非酒精性脂肪性肝炎(nash)
[0089]
本发明的肽及其药物组合物可以通过任何方便的途径施用，例如，口服、通过静脉输注或快速浓注、通过上皮或粘膜皮肤内层(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜，等)吸附并且可以与另一种生物活性剂一起施用。施用可以是全身的或局部的。多种递送系统是已知的，例如包封在脂质体、微粒、微胶囊、胶囊等中，并且可以用于施用本发明的肽。在某些实施方案中，向受试者施用多于一种本发明的肽。施用方法包括但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、口服、舌下、鼻内、脑内、阴道内、经皮、直肠、吸入或局部，特别是耳、鼻、眼睛，或皮肤。施用方式可由执业医师自行决定，并部分取决于医疗状况的部位。在大多数情况下，施用导致本发明的化合物释放到血流中。
[0090]
也可以采用肺部施用，例如通过使用吸入器或喷雾器，以及与雾化剂一起配制，或通过灌注碳氟化合物或合成肺表面活性剂。在某些实施方案中，本发明的化合物可以与传统的粘合剂和赋形剂(vehicle)如甘油三酯一起配制成栓剂。
[0091]
有利地，根据本发明的肽或药物组合物通过静脉内或皮下施用。
[0092]
根据施用方式，剂型会被调整。本领域技术人员知道如何调整剂型以使其适合所选择的施用途径。例如，对于口服施用，剂型可以选自片剂，包括口腔分散片、胶囊、饮料或糖浆。对于肺部施用，剂型可以是喷雾或吸入产品的形式。对于静脉内施用，剂型可以是用于注射的无菌溶液。
[0093]
根据本发明的肽或药物组合物可以以一个或多个剂量施用。向有需要的受试者施用的剂量将根据若干因素而变化，包括但不限于施用途径、治疗的疾病或受试者的年龄。本领域技术人员可以基于其在本领域的知识容易地确定基于这些因素和其他因素所需的剂量范围。
[0094]
在治疗本文公开的特定疾病中有效的本发明肽的量可以取决于疾病的性质，并且可以通过标准临床技术确定。可以使用体外或体内测定来帮助确定最佳剂量范围。组合物中待使用的精确剂量还可以取决于施用途径或状况的严重程度，并且可以根据从业者的判断和每个受试者的情况来决定。
[0095]
本发明的其他目的
[0096]
本发明涉及编码肽的核苷酸序列，所述肽包含与seq d no：1的氨基酸序列具有至少70％、如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、例如至少80％、如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、例如至少90％、如至少91％、至少92％、至少93％、
至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的肽。
[0097]
在一些实施方案中，本发明涉及编码这样的肽的核苷酸序列，所述肽与seq id no：1的氨基酸序列具有至少70％、例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、例如至少80％、如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、例如至少90％、如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。
[0098]
核苷酸序列可以是核糖核酸(rna)序列或脱氧核糖核酸(dna)序列，优选地，核苷酸序列是dna序列。核苷酸序列可以包含一个或多个内含子以增加相应rna的稳定性。内含子的选择及其在核苷酸序列中的定位在本领域技术人员的能力范围内。有利地，优化编码根据本发明的肽的核苷酸序列以提高所述肽的翻译效率。核苷酸序列的优化对于能够容易实施现有技术的教导的本领域技术人员不存在任何特别的障碍。
[0099]
本发明还涉及包含根据本发明的核苷酸序列的载体。优选地，载体是用于表达肽的表达载体，所述肽包含与seq id no：1的氨基酸序列具有至少70％，如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、例如至少80％、如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、例如至少90％、如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的肽。在一些实施方案中，载体是用于表达肽的表达载体，所述肽与seq id no：1的氨基酸序列具有至少70％，如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、例如至少80％、如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、例如至少90％、如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。
[0100]
本发明还涉及包含根据本发明的核苷酸序列或根据本发明的载体的细胞(宿主细胞)。特别地，根据本发明的细胞已经被根据本发明的核苷酸序列和/或载体转染、感染或转化。
[0101]
本领域技术人员熟知的任何转染方法可用于制备根据本发明的细胞，例如脂转染或磷酸钙细胞转染或电穿孔。
[0102]
对于本发明的目的，术语“转化”是指将核苷酸序列引入宿主细胞，使得宿主细胞能够表达引入的核苷酸序列以产生所需的肽。特别地，根据本发明的宿主细胞能够表达本发明的肽。
[0103]
宿主细胞的实例包括但不限于原核细胞(如细菌)和真核细胞(如酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等)。具体实例包括大肠杆菌(e.coli)、克鲁维酵母(kluyveromyces)或酵母(saccharomyces)、哺乳动物细胞系(例如vero、cho、3t3、bhk、cos、huh-7、hek等)以及原代或已建立的哺乳动物细胞培养物(例如淋巴母细胞、成纤维细胞、胚胎细胞、上皮细胞、神经细胞、脂肪细胞等)。还可以提及细胞系如sp2/o-agl4(atcc crl1581)、p3x63-ag8.653(atcc crl1580)、cho dhfr、yb2/0(atcc crl1 662)或huh-7(atcc ccl-185)。它也可以是取自患者的干细胞，例如间充质细胞。干细胞尤其可用于基因治疗或细胞治疗，无论是自体的还是异源的。
[0104]
根据本发明的核酸序列、载体或细胞可以用作药物，例如用于治疗上文“治疗用途”部分中公开的疾病。
[0105]
治疗方法
[0106]
本发明涉及用于治疗代谢综合征、非酒精性脂肪肝疾病(nafld)、心血管疾病(cvd)或胆汁淤积性肝疾病的方法，该方法包括将根据本发明的肽或根据本发明的药物组合物向受试者施用。
[0107]
治疗方法的具体实施方案源自以上描述。
[0108]
本发明通过参考以下实施例进一步定义。
[0109]
附图描述
[0110]
图1表示fmoc-lys-[棕榈酰基]-oh的式和式(i)、(ii)、(iii)和(iv)。
[0111]
图2表示式(i)的肽和式(ii)的肽与纯化的人f1fo-atpase的相互作用的表面等离子共振分析。显示了用作分析物的人f1f
o-atpase与固定在传感器芯片上的式(i)的肽(a)和式(ii)的肽(b)的剂量依赖性结合。所有传感图都将ru表示为时间的函数。
[0112]
图3表示人if1、衍生自成熟人if1的肽(1-60、10-56、10-47)、式(i)的肽和式(ii)的肽对人f1fo-atpase的atpase活性(f1-atpase活性)的影响。在if1(1μm)、if1衍生肽(各1μm)、式(i)的肽(1μm)、式(ii)的肽(1μm)或加扰肽(scr和scr-k-c16，各1μm)存在下，如材料和方法中所述测量f1-atpase活性测定。结果表示为对照(pbs)的百分比。每个条件n＝3次独立实验。除非另有说明，否则数据表示为均值
±
sem并通过单因素方差分析，然后是dunnett’s多重比较测试相对于对照进行分析。***p＜0.001，ns：无统计学意义。
[0113]
图4表示式(i)的肽和式(ii)的肽对ecto-f1-atpase活性的影响，其通过测量细胞外adp含量进行分析。如材料和方法中所述，通过萤光素-萤光素酶测定法测量细胞外adp浓度。通过使用f1-atpase抑制剂if1评估ecto-f1-atpase活性对细胞外adp浓度的贡献。(a)hepg2细胞与增加浓度的式(i)的肽温育5分钟，并测量细胞外adp浓度。加扰肽(scr，1μm)和apoa-i(10μg/ml)分别用作阴性和阳性对照(n＝3-7每个条件)。(b)hepg2细胞在有或没有if1(1μm)的情况下预温育10分钟，然后用apoa-i(10μg/ml，阳性对照)、式(i)的肽(1μm)、式(ii)的肽(1μm)或加扰肽(scr和scr-k-c16，1μm)处理5分钟并测量细胞外adp浓度。每个条件n＝3-7次独立实验。除非另有说明，数据表示为均值
±
sem，并通过单因素方差分析，然后是dunnett’s多重比较测试相对于对照(pbs)进行分析。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，ns：无统计学意义。
[0114]
图5表示式(i)的肽和式(ii)的肽对人肝细胞的hdl内吞作用的影响。hepg2细胞与apoa-i(10μg/ml)、式(i)的肽(1μm)、式(ii)的肽(1μm)或加扰肽(scr和scr-k-c16，1μm)在有或没有if1(1μm)的情况下预温育，然后与hdl-alexa568(50μg/ml)温育25分钟，并如材料和方法中所述定量细胞荧光含量。每组n＝3-7次独立实验。除非提及，数据表示为高于或低于通过单因素方差分析，然后是dunnett’s多重比较测试相对于对照(pbs)分析的对照值(pbs)的百分比(
±
sem)。***p＜0.001。
[0115]
图6表示式(i)的肽和式(ii)的肽对人内皮细胞中一氧化氮(no)产生的影响。如材料和方法中所述，通过使用no敏感荧光探针daf-fm-da测量huvec中的no产生。加扰肽(scr，1μm)和apoa-i(10μg/ml)分别用作阴性和阳性对照。(a)在基础条件(pbs)下或在增加浓度的式(i)的肽存在下10分钟的no产生。每组n＝3-6次独立实验。(b)在基础条件(pbs)下或在
式(i)的肽(1μm)或式(ii)的肽(1μm)存在下10分钟，有或没有if1(1μm)预先处理10分钟的情况下的no产生。每组n＝3-6次独立实验。除非另有说明，数据表示为高于或低于通过单因素方差分析，然后是sudak’s(a)或d dunnett’s(b)多重比较测试相对于对照(pbs)分析的对照值(pbs)的百分比(
±
sem)。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
[0116]
图7表示式(i)的肽和式(ii)的肽对人肝细胞(hepg2细胞)和原代小鼠肝细胞中油酸/棕榈酸诱导的脂肪变性的影响。(a)hepg2细胞在含有1％bsa(赋形剂(vehicle))或油酸(oa，0.33mm)和棕榈酸(pa，0.16mm)(oa∶pa，2∶1)的培养基中培养48小时以诱导脂肪变性。在诱导脂肪变性24小时后，将细胞与式(i)的肽(1μm)或式(ii)的肽(1μm)温育24小时。然后在5％np-40缓冲液中刮取细胞，用于定量细胞内甘油三酯的含量。(b)从喂食西方饮食的c57bl/6j小鼠中分离的原代小鼠肝细胞与apoa-i(10μg/ml)、式(i)的肽(1μm)或式(ii)的肽(1μm)温育24小时。每组n＝7次独立实验。数据表示为通过单因素方差分析dunnett’s多重比较测试相对于对照(pbs)分析的均值(
±
sem)。*p＜0.05，**p＜0.005，***p＜0.001。
[0117]
图8表示式(i)的肽和式(ii)的肽对人肝细胞(hepg2细胞)中的细胞毒性的影响。mtt测定用于检测hepg2细胞中的细胞生长速率和毒性。(a)细胞用pbs(赋形剂(vehicle))、加扰肽(scr，1μm)或升高浓度的单剂量的式(i)的肽处理一次24h(a)、48h(b)或72h(c)然后进行mtt测定。(d)用加扰肽(scr，1μm)或升高浓度的式(i)的肽处理细胞48小时，在24h内重复剂量一，然后进行mtt测定。每组n＝3次独立实验。数据表示为高于或低于通过kruskal-wallis测试以及dunn’s post hoc相对于对照(pbs)分析的对照值(pbs)的百分比(
±
sem)。没有观察到显著差异。
[0118]
图9表示式(i)的肽(圆形)和式(ii)的肽(正方形)在4℃(空心形状)和37℃(完整形状)下在pbs(a、b)、人血浆(c、d)、人血清(e、f)、小鼠血浆(g、h)和小鼠血清(i、j)中随时间的降解。相对于在时间点零确定的量计算肽量。
[0119]
图10表示式(i)的肽和式(ii)的肽在小鼠中的药代动力学性质。(a、b、c)。以25mg/kg静脉内(i.v.，a)或皮下(s.c.，b-c)施用后，式(i)的肽(a-b)和式(ii)的肽(c)在小鼠血浆中的平均血浆浓度-时间曲线(每种条件下每个时间点n＝3只小鼠)。实心方块：平均浓度 /-sd；空心圆：从拟合曲线生成的数据点。
[0120]
图11表示式(i)的肽和式(ii)的肽对野生型c57b/l6j和血脂异常的ldlr ko小鼠的胆汁脂质分泌物的体内功效。在单剂量腹膜内(ip)施用式(i)的肽(12.5mg/kg或25mg/kg)、加扰肽(scr，25mg/kg)或赋形剂(vehicle)(pbs)后2、4和6小时，在c57b/l6j小鼠中测量胆汁流量(a)、胆汁胆固醇(b)和胆汁酸(c)分泌物。每组n＝5-8只小鼠。在单剂量腹膜内(ip)施用式(i)的肽(25mg/kg)、式(ii)的肽(25mg/kg)、scr(25mg/kg)或赋形剂(vehicle)(pbs)后2小时，在c57b/l6j和ldlr ko小鼠中测量胆汁流量(d)、胆汁胆固醇(e)和胆汁酸(f)分泌物。每c57bl/6小鼠组n＝4-6，每ldlr ko小鼠组n＝7-15。在alzet渗透泵皮下放置后14天，在c57bl/6j小鼠中测量胆汁流量(g)和胆汁胆固醇(h)和胆汁酸(i)分泌物，以确保式(i)的肽以估计的0.5μl/h的速率释放，其对应于每天每千克体重(5mg/kg bw/天)5mg式(i)的肽的估计递送量。每组n＝3-4只小鼠。数据表示为均值(
±
sem)，并通过mann whitney测试相对于对照(pbs)进行分析。*p＜0.05，**p＜0.01。
[0121]
图12表示式(ii)的肽在西方饮食诱导的肝脂肪变性中的影响。用式(i)的肽或pbs(对照组)以1mg/kg/天每天经腹膜内向小鼠施用2周。ogtt在肽施用开始后10天实现，其他
测量在治疗期结束时进行。(a)体重，(b)肝脏与体重的比率，(c)肝脏甘油三酯含量，(d-e-f)血浆甘油三酯、胆固醇和hdl-c浓度，(g-h)ast和alt的血浆水平，(i-j)ogtt和ogtt在-15和 30分钟时的血浆胰岛素浓度。每组n＝5只小鼠。数据表示为平均值(
±
sem)并使用非配对t检验进行分析。
[0122]
图13表示式(i)的肽在cdahfd诱导的肝纤维化中的影响。使用alzet渗透泵将式(i)的肽皮下输注2周，以确保每天每千克体重(5mg/kg bw/天)5mg式(i)的肽的估计递送量。(a)在最后两周饮食中，在有或没有(sham)式(i)的肽处理的情况下，通过用天狼星红染色对喂食cdahfd 6周的小鼠进行肝脏组织学分析的代表性图像。(b)胶原沉积的定量，其从天狼星红面积的百分比评估。(c)在最后两周饮食中，在有或没有(sham)式(i)的肽处理的情况下，来自喂食cdahfd 6周的小鼠肝组织的羟脯氨酸定量(μg/g)。数据表示为均值(
±
sem)并通过wilcoxon-mann whitney检验进行分析。**p＜0.01。每组n＝6只小鼠
实施例
[0123]
实施例1：肽的制备
[0124]
以下肽由bachemag(bubendorf，瑞士)生产，在醋酸盐中具有》90％的纯度，并在使用前溶解在磷酸盐缓冲盐水(pbs)溶液中：
[0125]-式(i)：ch3co-[seq id no：1]-nh2，下文称为“式(i)的肽”或“式(i)”(图1a所示)；
[0126]-式(ii)：ch3co-[seq d no：1]-k-[棕榈酰基]-nh2，下文称为“式(ii)的肽”或“式(ii)”(图1b所示)；
[0127]-seq id n
°
2：geaksyaekgeargergtkgefrifkreatd
[0128]-式(iii)：ch3co-[seq id no：2]-nh2，下文称为“加扰肽”或“scr”(图1c所示)；和
[0129]-式(iv)：ch3co-[seq id no：2]-k-[棕榈酰基]-nh2，下文称为“加扰肽k-c16”或“scr-k-c16”(图1d所示)。
[0130]
棕榈酸是通过偶联预先形成的衍生物fmoc-k-[棕榈酰基]-oh(图1e所示)引入的。
[0131]
其他标记和未标记的肽seq id no：3(eaggafgk)和seq id no：4(eaggafg-[
13
c6，
15
n4]-k)购自thermofisher scientific，其具有＞90％的纯度，并以1mm溶于50％乙腈。
[0132]
实施例2：式(i)的肽和式(ii)的肽与人f1fo-atpase的相互作用的表面等离子共振分析。
[0133]
材料和方法：
[0134]
表面等离子共振(spr)测定。基于spr技术的结合研究在biacore t200光学生物传感器仪器(geuppsala，瑞典)上进行。具有c-末端6xhis-标签的式(i)的肽(式(i)-his-标签：ch3co-[seq d no：1]-hhhhhh)和具有c-末端生物素的式(ii)的肽(式(ii)-生物素：ch3co-[seq id no：1]-k-[棕榈酰基]-aeeac-k-[生物素]-nh2)由bachem ag(bubendorf，瑞士)定制合成，在三氟乙酸盐中具有＞90％的纯度。根据制造商的说明，使用小鼠单克隆抗atp合酶抗体(12f4ad8af8，#ab109867，abcam)通过免疫捕获从hepg2细胞中纯化人f1fo-atpase。
[0135]
式(i)-6his-标签的肽的固定在hbs-p 缓冲液(10mm hepes ph 7.4、150mm nacl和0.05％表面活性剂p20)中的次氮基三乙酸(nta)传感器芯片(ge healthcare)上进行。为了用ni
2
饱和nta表面，流通池(fc)装载了0.5mm nicl2溶液。通道fc1留空并用作非特异性
结合测量的参考表面。将式(i)-6xhis以5μl/min的流速注入通道fc2，并通过胺偶联进行稳定(实验室指南29-0057-17ab)。固定的式(i)-his-标签的总量为300-350个共振单位(ru)：最终浓度为25μg/ml。
[0136]
式(ii)-生物素的c-末端生物素化肽的固定在hbs-ep缓冲液(10mm hepes[ph 7.4]、150mm nacl、3mm edta、0.005％表面活性剂p20)中的链霉抗生物素蛋白包被(sa)的传感器芯片(ge healthcare)上进行。通道fc1留空并用作非特异性结合测量的参考表面。式(ii)-生物素以5μl/min的流速注入通道fc2中。固定的式(ii)-生物素的总量为350-380ru：最终浓度100ng/ml。对于结合分析，f1f0分析物(584kda)在单个循环中以增加的浓度范围(3.125nm-6.25nm-12.5nm-25nm-50nm)顺序注射到固定化肽上，而在注射之间不再生传感器(sensorship)。允许单循环动力学(sck)分析确定结合、解离和亲和常数(分别为ka、kd和kd)。通过在biaevaluation软件3.0版中使用1∶1朗缪尔(langmuir)结合模型或稳态常数rmax模型拟合叠加传感图来获得结合参数。
[0137]
结果：
[0138]
结果显示在图2中。图2中的传感图显示了用作分析物的纯化的c-atpase与biacore传感器芯片上包被的式(i)的肽(图2a)和式(ii)的肽(图2b)之间的直接相互作用。f1fo-atpase与固定的式(i)的肽和式(ii)的肽的结合是剂量依赖性的(31.25nm-500nm)，这允许我们确定多亚基复合物与式(i)的肽之间的亲和力(kd＝18.97nm)和与式(ii)的肽之间的亲和力(kd＝4.45nm)
[0139]
结论：
[0140]
测量了f1fo-atpase与式(i)的肽之间以及f1fo-atpase与式(ii)的肽之间的直接高亲和力相互作用。
[0141]
实施例3：式(i)的肽和式(ii)的肽对f1-atpase活性的影响
[0142]
材料和方法：
[0143]
f1-atpase活性测定。
[0144]
成熟的人if1蛋白(seq id no：5)由genscript(piscataway，nj，usa)化学合成，纯度》80％。源自成熟的人if1序列的肽(if1-1-60、if1-10-56、if1-10-47)由bachemag(bubendorf，瑞士)生产，纯度》90％。
[0145]
根据制造商的说明，使用小鼠单克隆抗atp合酶抗体(12f4ad8af8，#ab109867，abcam)，通过免疫捕获从hepg2细胞中纯化人f1fo-atpase。
[0146]
如前所述测定f1-atpase活性的测量[20]。简言之，将10μg f1fo-atpase制备成50μl活性测定缓冲液(10mm hepes、150mm nacl、5mm kcl、5mm mgcl2、0.5mm磷酸烯醇丙酮酸、250μm nadh、100μm atp、20u乳酸脱氢酶，120u丙酮酸激酶)。将混合物在37℃下温育30分钟。然后在96孔微孔板中通过在37℃下将5μl混合物/孔(每点1μg的f1fo-atpase)添加到200μl活性测定缓冲液中，并通过添加含或不含肽(各1μm)的5μl缓冲液来测量f1-atpase活性。使用varioskantm flash multimode reader(thermo fisher scientific)在340nm处测量nadh吸光度的降低5分钟。计算每个孔的斜率并将结果表示为对照斜率的百分比。
[0147]
结果：
[0148]
结果显示在图3中。人if1、if1-1-60、if1-10-56和if1-10-47(各1μm)强烈抑制f1-atpase活性。正如预期的那样，if1显示出最强的抑制活性(与对照相比，96％的抑制)，其次
是if1-10-60(94％)，然后是if1-10-56(88％)和if1-10-47(75％)。相反，式(i)的肽和式(ii)的肽分别刺激f1-atpase活性36％和43％，而它们各自的加扰肽scr和scr-k16没有影响。
[0149]
结论：
[0150]
与if1和其他衍生自if1序列的肽不同，式(i)的肽和式(ii)的肽不抑制而是刺激f1-atpase活性。因此，这些肽是f1-atpase激活剂。
[0151]
实施例4：式(i)的肽和式(ii)的肽的体外活性：f1-atpase激活。
[0152]
材料和方法：
[0153]
人肝细胞系hepg2获自美国典型培养物保藏中心(#hb-8065)。hepg2在补充有10％胎牛血清(10270098，life technologies)、1％青霉素-链霉素溶液(p0781，sigma-aldrich)的dulbecco’s modified eagle’s培养基(dmem)-高葡萄糖(d0822，sigma-aldrich)中培养。hepg2细胞以75,000个细胞/孔(第0天)接种在24孔板上。生长24小时后，将细胞血清饥饿24小时以同步细胞周期(第1天)，然后在完全细胞生长培养基中再更换24小时(第2天)。在第3天，在新鲜的dmem-不含红色苯酚的高葡萄糖(d1145，sigma-aldrich)中洗涤和平衡细胞1小时。
[0154]
然后用不同浓度的式(i)的肽(0.1至5μm)、式(ii)的肽(1μm)、scr(1μm)、scr-k-16(1μm)或从人血浆中纯化的apoa-i(10μg/ml)处理细胞5分钟[5]。
[0155]
在存在if1蛋白(1μm)的情况下，评估了特异性ecto-f1-atpase激活，if1蛋白是天然的f1-atpase抑制剂，与β-亚基相互作用以抑制atp水解活性[1][5]。
[0156]
然后收集上清液并离心(10,000g，5分钟，4℃)并处理用于adp和atp测量。对于adp测量，adp在含有0.5mm磷酸烯醇丙酮酸(pep)和丙酮酸激酶(pk，每点6u，在37℃下持续15分钟)的150mm nacl、5mm kcl、2mm mgcl2、ph 7.5缓冲液中转化为atp。对于atp测量，使用atp生物发光测定试剂盒cls ii(roche diagnostics)分析100μl样品。将样品添加到atp测定混合物中，并在酶标仪infinite f500(tecan，瑞士)中测量发光1000ms。atp标准曲线在与样品相同的培养基中产生，并且在10-5
至10-10
m浓度范围内。然后将adp浓度计算为adp转换后的atp浓度减去基础atp浓度。数据表示为产生的纳摩尔adp。
[0157]
结果：
[0158]
结果显示在图4中。在生理条件下，ecto-f1fo-atpase以与功能性线粒体中描述的相反的方向催化工作。事实上，apoa-i与ecto-f1fo-atpase的结合刺激了细胞外atp水解为adp和磷酸盐，而这一过程被f1-atpase的天然抑制剂if1抑制[1]。本文中，我们使用if1来抑制ecto-f1-atpase活性[5]。正如预期的那样，hepg2细胞与apoa-i的温育增加了细胞外adp浓度(图4a)，而用if1抑制f1-atpase活性减弱了这种影响(图4b)，其反映了apoa-i刺激ecto-f1-atpase水解活性的能力。式(i)的肽以剂量依赖性方式增加细胞外adp浓度，在1μm时达到最大功效(图4a)，而用if1进行抑制减弱了这种影响(图4b)。用1μm的式(i)的肽观察到类似的结果(图4b)。那些结果表明式(i)的肽和式(ii)的肽都刺激了ecto-f1-atpase水解活性。
[0159]
结论：
[0160]
式(i)的肽和式(ii)的肽刺激肝细胞中的ecto-f1-atpase活性，并与if1竞争结合细胞表面f1fo-atpase。因此，这些肽是激活细胞表面孔fo-atpase的良好候选者。
[0161]
实施例5：体外活性：肝细胞的hdl内吞作用
[0162]
材料和方法：
[0163]
hdl内吞作用测定。
[0164]
hepg2细胞以50,000个细胞/孔接种在96孔板上。hdl3(d 1.12-1.21)从健康人类供体的血浆中分离[12]并称为hdl。根据制造商的说明，用568染料(a10238，thermofisher scientific)对hdl进行荧光标记。测定前1h30，细胞血清饥饿1h30以稳定核苷酸分泌。在用不同的肽(1μm)或从人血浆中纯化的apoa-i(10μg/ml)处理之前，将细胞与抑制剂(h49k，1μm)温育10分钟[5]。肽处理后5分钟，内吞作用由50μg/ml标记的hdl启动。使用25倍过量的未标记hdl(2.5mg/ml)进行相同的实验以确定非特异性荧光信号。在37℃下25分钟后，然后在无血清dmem中洗涤细胞，并通过在无血清dmem中在4℃下温育细胞90分钟来解离细胞外膜结合的hdl。洗涤后，将细胞在naoh 0.1m sds 1％中裂解2小时，将裂解物转移到黑色96孔板中，并在568nm处记录荧光(varioscan flash)。对于每种条件的荧光是底物，其具有在未标记的hdl条件下获得的值，并且结果表示为与基础条件(未处理的细胞)相比的倍数变化。
[0165]
结果：
[0166]
结果显示在图5中。f1fo-atpase介导的hdl内吞途径依赖于apoa-i对细胞表面f1fo-atpase的激活和细胞外adp产生以及p2y受体激活[6]。如先前在[7]中报道的那样，因为与if1预温育已消除了apoa-i对hdl内吞作用的影响，在严格依赖于ecto-f1-atpase活性的过程中，与未受刺激的细胞相比，apoa-i(10μg/ml)已显著刺激了hdl内吞作用约45％(图5)。类似地，式(i)的肽(1μm)和式(ii)的肽(1μm)已刺激了hdl内吞作用，并且用if1(1μm)的预处理已完全消除了这种影响。scr(1μm)和scr-k-c16(1μm)对hdl内吞作用没有影响，所述hdl内吞作用保持在pbs处理的水平。
[0167]
结论：
[0168]
当式(i)的肽和式(ii)的肽在药理学上刺激f1-atpase活性时，肝细胞中孔fo-atpase介导的hdl内吞作用显著增加。鉴于肝细胞中的hdl内吞作用是反向胆固醇转运以去除过量胆固醇的关键最后一步[6]，因此式(i)和式(ii)的肽是改善反向胆固醇转运和从体内去除过量胆固醇的良好候选者。
[0169]
实施例6：体外活性：内皮一氧化氮(no)产生
[0170]
材料和方法：
[0171]
一氧化氮的产生。
[0172]
使用daf-fm-da探针(d2321，sigma-aldrich)检测一氧化氮(no)，该探针在与no反应时形成荧光苯并三唑。将huvec细胞(promocell#c-12203)接种在96孔板中(每孔10,000个细胞)，并在补充有gm2补充剂混合物(promocell#c-39211)的内皮细胞基础培养基2(promocell#c-22211)中培养，直到80-90％汇合。然后用不含血清的m-199替换培养基4小时，并将细胞与在pbs中稀释的daf-fm-da(5μm)温育45分钟。用增加浓度的不同肽或从人血浆中纯化的apoa-i(10μm)[5]或作为阳性对照的组胺(1mm)处理细胞。在另一组实验中，细胞与抑制剂(if1，1μm)温育10分钟，然后用肽或apoa-i处理。用tecan flash多模式阅读器(thermo fisher scientific)记录荧光30分钟(λex＝495nm，λem＝515nm)。将每种条件的荧光与未处理细胞中获得的值进行比较，结果表示为与基础条件(未处理细胞)相比的倍数
变化。
[0173]
结果：
[0174]
结果显示在图6中。ecto-f1fo-atpase在内皮细胞的质膜上表达并参与no的产生[5]。如[5]中所述，apoa-i激活ecto-f1fo-atpase刺激内皮细胞产生no(图6a)，并且当细胞用if1预处理时，这种影响被消除(图6b)。类似地，式(i)的肽(1μm)和式(ii)的肽(1μm)刺激了no产生通过内皮细胞的约50％的产生，并且这种影响被if1完全消除(图6b)。
[0175]
根据[5]中公开的方案，式(i)的肽在严格依赖内皮no产生的过程中增加有意识的野生型c57b/l6j小鼠的股动脉血流量(数据未显示)。
[0176]
结论：
[0177]
在人内皮细胞中，当式(i)的肽和式(ii)的肽在药理学上刺激f1-atpase活性时，通过enos的f1fo-atpase介导的no产生显著增加。鉴于通过enos的no产生保持血管稳态[16]并维持与参与肝纤维化的肝星状细胞和参与肝脏炎症的kupffer细胞的静止[8]，式(i)和式(ii)的肽因此是治疗代谢综合征、心血管疾病(cvd)、非酒精性脂肪肝疾病(nafld)或胆汁淤积性肝疾病的良好候选者。
[0178]
实施例7：体外活性：肝脂肪变性
[0179]
材料和方法：
[0180]
油酸盐和棕榈酸盐溶液的制备。
[0181]
首先在0.1m naoh中在70℃制备含有250mm棕榈酸盐(p0500，sigma-aldrich)的溶液30分钟，然后在含有10％无脂肪酸bsa(a7030，sigma-aldrich)的dmem低葡萄糖(d5546，sigma-aldrich)中稀释以产生10mm棕榈酸盐溶液并在37℃下溶解30分钟，过滤灭菌并储存在-20℃的玻璃小瓶中直至使用。该棕榈酸盐储存液和即用油酸盐溶液(o3008，sigma-aldrich)用于在含有dmem低葡萄糖、10％胎牛血清、1％青霉素-链霉素和1％无脂肪酸的bsa的完全培养基中制备油酸盐和棕榈酸盐比例为2∶1的0.5mm溶液。
[0182]
脂肪变性的体外评价。
[0183]
hepg2细胞在12孔板中生长至60-70％汇合，然后暴露于单独培养基(dmem低葡萄糖、10％胎牛血清、1％青霉素-链霉素和1％无脂肪酸的bsa)或含有0.5mm油酸盐/棕榈酸盐混合物(2∶1)的培养基中48小时以诱导脂肪变性。在48小时的最后24小时，用1μm的式(i)肽或式(ii)肽处理细胞。
[0184]
如实施例3中所述，从喂食西方饮食11周的小鼠中分离原代小鼠肝细胞(envigo#td.88137，含有0.2％胆固醇、来自脂肪的42％kcal、以重量计的34％蔗糖)。将原代小鼠肝细胞以600,000个细胞/孔的密度接种在12孔板中的生长培养基中，并用apoa-i(10μg/ml)、式(i)的肽(1μm)或式(ii)的肽(1μm)处理24小时。
[0185]
为了测量细胞内甘油三酯含量，用pbs洗涤细胞，在5％np-40裂解缓冲液中刮擦并在85℃加热10分钟。然后使用甘油三酯商业试剂盒(biolabo#87319)对甘油三酯进行定量。将值归一化为细胞裂解物中的蛋白质浓度。
[0186]
结果：
[0187]
结果显示在图7中。与未处理的细胞(赋形剂(vehicle)，bsa 1％)相比，暴露在脂肪酸(油酸盐和棕榈酸盐比例为2：1的0.5mm溶液)中的hepg2细胞显示高多于300％的细胞内甘油三酯含量(图8a)。与pbs对照相比，当用式(i)的肽处理hepg2细胞时，这种由脂肪酸
诱导的细胞内甘油三酯积累显著减少了18％(p＜0.05，图7a)，当用式(ii)的肽处理细胞时减少了32％(p＜0.001，图7a)。此外，与pbs对照相比，用式(i)的肽和式(ii)的肽处理24小时显著降低了脂肪变性原代小鼠肝细胞中甘油三酯的细胞内积累(分别为p＜0.05和p＜0.005，图7b)。当用apoa-i处理原代小鼠肝细胞时观察到类似的影响(与pbs相比，p＜0.005，图7b)。
[0188]
结论：
[0189]
式(i)的肽和式(ii)的肽确实减少了脂肪变性人肝细胞模型和脂肪变性原代小鼠肝细胞中的脂肪变性。鉴于脂肪变性肝细胞是nafld/nash中致病过程的关键驱动因素[11]，因此式(i)的肽和式(ii)的肽是预防和治疗非酒精性脂肪性肝疾病(nafld)和非酒精性脂肪性肝炎(nash)的良好候选者。
[0190]
实施例8：体外毒性测定(肝细胞)
[0191]
材料和方法：
[0192]
细细毒性测定。
[0193]
hepg2细胞以10,000个细胞/孔的密度接种在96孔板中的生长培养基(dmem高葡萄糖，10％胎牛血清)中。次日，更换生长培养基，以递增剂量加入式(i)的肽一次，持续24h、48或72h或48h，24h内重复一次。类似地，式(ii)的肽以递增剂量添加一次，持续24h或48h或持续48h，24h内重复一次。将细胞与5mg/l mtt温育4h，并在孔中加入100μl dmso。使用微孔板分光光度计系统(varioscan flash)在570和660nm处记录吸光度。通过将570nm吸光度减去在660nm处测量的背景来计算细胞活力。
[0194]
结果：
[0195]
结果显示在图8中。用0.1至50μm的单次递增剂量的式(i)的肽处理肝细胞24、48或72小时对细胞活力没有影响，在多次递增剂量处理24小时和48小时时也没有影响。用0.1至25μm的单次递增剂量的式(ii)的肽处理肝细胞24或48小时对细胞活力没有影响，在多次递增剂量处理24小时和48小时时也没有影响。
[0196]
结论：
[0197]
随着时间的推移，式(i)的肽和式(ii)的肽没有表现出任何细胞毒性，无论是递增的单剂量还是重复剂量。
[0198]
实施例9：式(i)的肽和式(ii)的肽在pbs、血浆和血清中的稳定性
[0199]
材料和方法：
[0200]
试剂。
[0201]
uplc/ms级乙腈和水、磷酸盐缓冲盐水(pbs)和甲酸购自biosolve(valkenswaard，荷兰)。
[0202]
稳定性测定。
[0203]
式(i)的肽或式(ii)的肽以200μg/ml的浓度在pbs中制备或与来自人(etablissementdu sang，efs)或小鼠(c57bl/6j，心脏穿刺)的edta血浆或血清混合。来自pbs样品(40μl)的等分试样在4℃或37℃下温育0、1、2和4周。来自血浆和血清样品(50μl)的等分试样在4℃或37℃下温育0、1、2、4、6、12、24小时。
[0204]
样品分析。
[0205]
配制式(i)和(ii)的肽的混合溶液，并在pbs中连续稀释以获得七种标准溶液，范
围从200μg/ml至0.2μg/ml。平行地，在pbs中以100μg/ml制备式(i)和(ii)的标记肽的混合溶液(thermo scientific，biopolymers darmstadt，德国)。将标记肽的混合溶液(25μl)添加到25μl标准溶液以及pbs、血浆和血清样品中。向每个样品中加入乙腈(150μl)以沉淀血浆/血清蛋白。离心(10,000
×
g，4℃，10分钟)后，将澄清的上清液(150μl)在温和的氮气流(45℃)下干燥，用含有0.1％甲酸(100μl)的10％乙腈重构，并注入液相色谱-高分辨率质谱(lc-hrms)系统。在h-class uplc系统(waters corporation，milford，ma，usa)上通过将10μl样品注入peptide csh c
18
色谱柱(2.1mm
×
150mm，1.7μm；waterscorporation)上保持60℃进行lc-hrms分析。流动相由作为溶剂a的5％乙腈和作为溶剂b的100％乙腈组成，各含有0.1％甲酸。在250μl/min的恒定流速下，使用溶剂b在溶剂a中的梯度进行洗脱20分钟。流动相b在1％保持恒定1分钟，从1％线性增加至80％，持续15分钟，保持恒定1分钟，超过1分钟恢复到初始状态，并在下一次注射之前再次保持恒定2分钟。hrms检测由配备用于电喷雾电离的z-spray接口的synapt g2 hrms q-tof质谱仪(waters corporation)进行。在正离子化模式下，分辨率模式以25,000半峰全宽的质量分辨率在200到4,000范围内的质荷比(m/z)下应用。电离参数如下：毛细管电压3kv，锥面电压30v，脱溶剂气体流量900l/hr，源温度120℃，脱溶剂温度450℃，氮气作为脱溶剂气体。以每秒四个光谱的速率以连续模式收集数据。在乙腈/水(50/50，v/v)混合物中以2μg/ml制备的亮氨酸脑啡肽溶液以恒定流量(10μl/分钟)注入锁定喷雾通道中。每20秒获取1秒的光谱，并允许在实验期间进行质量校正。根据其主要精确m/z(
±
5ppm，表1)分析肽，并将每个肽信号与其标记的内标信号归一化化。使用从标准溶液绘制的校准曲线计算肽浓度(线性回归，1/x加权，不包括原点)。
[0206]
表1：用于通过lc-hrms检测肽的质谱参数。
[0207][0208]
is：内标
[0209]
结果：
[0210]
结果显示在图9中，其代表在4℃和37℃在不同基质(pbs、人和小鼠血清、人和小鼠血浆)中随时间推移的肽稳定性。式(i)的肽和式(ii)的肽在pbs中在4℃和37℃下稳定4周(图9a-b)。式(i)的肽和式(ii)的肽在人血浆中都比在人血清中降解得更快(图9c-f)。对于小鼠血浆和血清中的式(i)的肽观察到相同的观察结果(图9g和9i)，而式(ii)的肽在小鼠血清中与在小鼠血浆中一样稳定(图9h和9j)。当比较37℃相比于4℃下的肽稳定性时，在任何测试的基质(血清和血浆)和物种(人和小鼠)中，式(i)的肽在37℃下比在4℃下降解得更快，而在37℃和4℃之间没有观察到式(ii)的肽的稳定性有显著差异。在37℃下，式(ii)的
肽在血清和血浆中的降解远低于式(i)的肽：在37℃下24小时，式(ii)的肽的回收率在血清中为100％，在血浆中为50％，而式(i)的肽只有30％和10％。
[0211]
结论：式(i)的肽和式(ii)的肽可以在4℃和高达37℃下在pbs中储存至少4周，而不会被降解。式(ii)的肽包括在37℃和长达24小时在人和小鼠生物基质中显示极少的降解，并因此比式(i)的肽更适合长期注射。
[0212]
实施例10：式(i)的肽和式(ii)的肽的体内药代动力学
[0213]
材料和方法：
[0214]
lc-ms/ms肽定量。
[0215]
使用经验证的测定法在小鼠edta血浆中分析式(i)的肽和式(ii)的肽，所述测定涉及胰蛋白酶蛋白酶解和随后通过液相色谱-串联质谱法(lc-ms/ms)分析特征肽(seq id no：3)。将未标记肽(seq id no：3，1mm)的工作溶液在水中连续稀释，以得到范围在0.05-5μm之间的7种标准溶液。根据制造商的说明(除了优化到7小时的胰蛋白酶温育时间)，使用proteinworks
tm
express试剂盒(waters corporation，milford，ma，usa)的即用型溶液对血浆和标准样品(40μl)进行还原、烷基化和过夜胰蛋白酶消化。将标记的蛋白裂解肽([seq id no：4]-[
13
c6，
15
n4]-k，1mm)的工作溶液用作内标(is)并添加到消化缓冲液中至0.5μm的终浓度。消化后，使用30mg oasis hlb 1cc cartridges(waters corporation)清洗样品。分别使用甲醇(1ml)、水(1ml)、样品(～200μl)、含有0.1％tfa的5％甲醇(1ml)和含有0.1％tfa的60％甲醇(1ml)对cartridges进行调节、平衡、上样、洗涤和洗脱。洗脱液在氮气流下干燥，用100μl含有0.1％甲酸的10％乙腈重构，并将10μl注入lc-ms/ms系统。lc-ms/ms分析在具有电喷雾(esi)接口和acquityuplctm设备的tqd质谱仪(waters corporation)上进行。使用流动相b(100％乙腈)在流动相a(5％乙腈)中的线性梯度在60℃下保持的beh c
18
柱(2.1
×
100mm，1.7μm，waters corporation)上以600μl/分钟的流速分离蛋白裂解肽，所述每个流动相含有0.1％甲酸。流动相b从1％线性增加到50％，持续5分钟，保持恒定1分钟，超过1分钟回到初始状态，并在下次注射前保持恒定2分钟。然后通过具有以正离子模式运行的esi接口的质谱仪检测蛋白裂解肽(毛细管电压，3kv；去溶剂化气体(n2)流和温度，900l/h和400℃；源温度，150℃)。将多反应监测模式应用于ms/ms检测(seq id no：3，m/z368.8
→
536.5，y
6
；[seq id no：4]-[
13
c6，
15
n4]-k，m/z 372.8
→
544.4，y
6
)，其锥体电压和碰撞电压分别设置为20和14v。分别使用和软件(4.1版，waters corporation)进行数据采集和分析。未标记肽和is之间的色谱峰面积比构成检测器响应。标准溶液用于绘制校准曲线用于肽定量。线性由大于0.998的平均r2表示(线性回归，1/x加权，不包括原点)。每个样品测定3次，并且变异系数不超过4.5％。式(i)的肽和式(ii)的肽的浓度以μm表示，假设1摩尔肽分别相当于1摩尔式(i)的肽和式(ii)的肽。假设式(i)的肽和式(ii)的肽的分子量分别为3540da和3917da，则将浓度转换为其标准单位(ng/ml)。
[0216]
动物。
[0217]
野生型c57b/l6j雄性小鼠购自janvier labs(le genest saint isle，法国)。在rangueil(anexplo平台，us006，图卢兹，法国)的动物设施的特定无病原体条件下，将小鼠
关在动物室中，光照/黑暗时间表为12小时/12小时，并以正常饲料随意喂食(#v1535r/m-h，ssniff，德国)。所有动物实验程序均按照当地动物护理伦理委员会批准的动物实验机构指南进行并符合来自欧洲议会关于保护用于科学目的的动物的指令2010/63/eu的指南或nih指南。
[0218]
药代动力学(pk)研究。
[0219]
体重为24.5
±
1.3g的8周龄c57b/l6j雄性小鼠用于以下药代动力学研究。在实验过程中，所有动物都被允许自由进食和饮水。式(i)的肽以25mg/kg在尾静脉经静脉内(i.v.)或皮下(s.c.)施用。式(ii)的肽以25mg/kg经皮下施用。每个时间点使用三只不同的动物。施用后，对于式(i)的肽，心内血在0.03、0.117、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、4h收集，而对于式(ii)的肽，在0.03、1、4、6、8、10、12、16、20、24、30、48小时收集。edta用作抗凝剂，并在4℃下以4,000rpm离心10分钟分离血浆。将血浆样品置于湿冰上，收集后1小时内，将其储存在-80℃下，直至通过液相色谱-质谱/质谱(lc-ms/ms)分析用于定量。表2报告了在血浆中计算的药代动力学参数，即分布和消除半衰期(t1/2lbd1和t1/2lbdz)、最大浓度(cmax)、达到cmax的时间(t max)、曲线下面积(auc)、总血浆清除率(cl)、分布容积(vd)、平均停留时间(mrt)。
[0220]
表2：式(i)的肽和式(ii)的肽的药代动力学特征
[0221][0222]
结果：
[0223]
结果显示在图10和表2中。在以25mg/kg静脉内(i.v.)和皮下(s.c.)施用一剂后，式(i)的肽如图10a(i.v.)和10b(s.c.)所示迅速分布和消除。在这些条件下，式(i)的肽的消除半衰期(t1/2lbdz)对于i.v.和s.c.施用分别为0.26小时和0.21小时(表2)。式(i)的肽显示出中等清除率(对于两种施用方式，cl＝1.9l/小时/kg)和分布容积(对于i.v.和s.c.施用分别为vd＝0.7l/kg和0.5l/kg)。
[0224]
与式(i)的肽相比，以25mg/l皮下施用的式(ii)的肽的分布和消除速度较慢(图10c)，其消除半衰期比式(i)的肽长50倍以上(t1/21bdz＝12.54小时)并且具有更低的清除率(cl＝0.05l/小时/kg)。
[0225]
结论：
[0226]
与式(i)的肽相比，式(ii)的肽显示出改进的药代动力学性质。
[0227]
实施例11：式(i)的肽和式(ii)的肽对胆汁脂质分泌的体内功效。
[0228]
材料和方法：
[0229]
动物。
[0230]
野生型c57b/l6j雄性小鼠购自janvier labs(le genest saint isle，法国)。ldlr敲除小鼠(雄性，c57b/l6j背景)获自the jackson laboratory(bar harbor，缅因州，usa)。在rangueil(anexplo平台，us006，图卢兹，法国)的动物设施的特定无病原体条件下，将小鼠关在动物室中，光照/黑暗时间表为12小时/12小时，并以正常的饲料随意喂食(#v1535 r/m-h，ssniff，德国)。所有动物实验程序均按照当地动物护理伦理委员会批准的动物实验机构指南进行并符合来自欧洲议会关于保护用于科学目的的动物的指令2010/63/eu的指南或nih指南。
[0231]
胆囊插管和胆汁收集。
[0232]
根据实验，用pbs、式(i)的肽、式(ii)的肽和scr腹膜内注射8周龄小鼠。在图11的描述中说明了肽的使用、施用剂量和方式以及时间进程的详细信息。鉴于式(i)的肽的消除半衰期短，渗透泵也用于确保连续递送14天。简言之，将200μl渗透泵装满10mg/ml的pbs中的式(i)的肽，并根据制造商的说明(模型泵#2002)将其皮下植入小鼠体内，以确保式(i)的肽以0.5vl/小时的估计速率释放，其对应于每天每千克体重5mg式(i)的肽的估计递送量(5mg/kg bw/天)。治疗后，小鼠禁食2小时，然后通过腹腔内注射氯胺酮和盐酸甲苯噻嗪进行麻醉。在靠近十二指肠结扎胆总管，穿刺胆囊并用聚乙烯10导管插管。稳定30分钟后，收集新分泌的胆汁30分钟。在胆汁收集期间，使用温度床垫稳定体温。假设胆汁的密度为1g/ml，通过重量法测定胆汁流量(以μl/分钟/100g体重表示)。在实验结束时，收集血液并通过颈椎脱臼处死小鼠。
[0233]
胆汁脂质分析。
[0234]
对于胆汁酸分析，将1μl胆汁样品用99μl milliq水稀释，然后与工作试剂(6mg nad、0.5m水合肼缓冲液、0.05m焦磷酸钠)温育4分钟。然后将混合物与起始试剂(0.03m tris-edta；0.3u/ml 3-α-oh类固醇脱氢酶)温育，并在340/330nm的激发和440/420nm的发射下测量30分钟。对于磷脂分析，将1μl胆汁样品用49μl milliq水稀释，然后与工作试剂(100mm mops，ph 8；0.55mm hva；20mm cacl2；11u/ml磷脂酶-d；1.66u/ml过氧化物酶；0.1％triton x-100)温育4分钟。然后将混合物与起始试剂(1m mops，ph 8，50u/ml胆碱氧化酶)温育，并在340/330的激发和440/40的发射下测量67.5分钟。对于胆固醇分析，将1μl胆汁样品用29μl milliq水稀释，然后与工作试剂(100mm mops，ph 8，0.25mm hva；0.1％triton x-100)温育4分钟。然后将混合物与起始试剂(0.1m mops，ph 8，0.06u/ml胆固醇氧化酶，0.15u/ml胆固醇酯酶，0.45u/ml过氧化物酶，0.06mm牛磺胆酸盐)温育，并在340/330nm的激发和440/420nm的发射测量45分钟。胆汁酸、磷脂和胆固醇的分泌值通过浓度和胆汁流量值相乘计算得出，并以nmol/分钟/100g体重(bw)表示。
[0235]
结果：
[0236]
结果显示在图11中。与用pbs或25mg/kg scr注射的小鼠相比，用25mg/kg的式(i)的肽经腹膜内快速浓注处理的c57bl/6小鼠表现出胆汁流量和胆汁分泌胆固醇和胆汁酸的
显著增加。式(i)的肽的这种作用在注射后保持长达4小时(图11a-c)。作为比较，以12mg/kg快速浓注式(i)的肽比25mg/kg剂量对胆汁流量和胆汁脂质分泌更低效(图11a-c)。在c57bl/6小鼠中腹膜内快速浓注25mg/kg式(ii)的肽也刺激胆汁流量和胆汁分泌胆固醇和胆汁酸至用式(i)的肽类似处理的相同程度(图11d-f)。也在血脂异常的ldl ko小鼠中维持式(i)的肽和式(ii)的肽对刺激胆汁流量和胆汁脂质分泌的那些影响(图11d-f)。当以5mg/kg bw/天连续递送14天时，式(i)的肽还刺激胆汁流量和胆汁胆固醇分泌(图11g-i)。
[0237]
结论：
[0238]
式(i)的肽和式(ii)的肽在野生型和血脂异常小鼠中刺激胆汁流量和胆汁分泌胆固醇和胆汁酸。胆汁中胆固醇的肝脏排泄，无论是胆汁酸还是胆固醇，均代表了去除导致动脉粥样硬化发展的过量胆固醇的主要途径[6]。同样，胆汁流量和胆汁脂质分泌的下调导致肝脂毒性，并已在nash[13]和胆汁淤积性肝病症[17]中得到证实。因此，式(i)和式(ii)的肽是预防代谢综合征、心血管疾病(cvd)、非酒精性脂肪肝疾病(nafld)或胆汁淤积性肝疾病发展的良好候选者。
[0239]
实施例12：式(ii)的肽对nash相关肝脂肪变性发展的体内功效。
[0240]
材料和方法：
[0241]
动物。
[0242]
野生型c57b/l6j雄性小鼠购自janvier labs(le genest saint isle，法国)。在rangueil(anexplo平台，us006，图卢兹，法国)的动物设施的特定无病原体条件下，将小鼠关在动物室中，光照/黑暗时间表为12小时/12小时。在饮食干预开始时，所有动物均为8周龄，并以正常的饲料随意喂食(#v1535 r/m-h，ssniff，德国)。所有动物实验程序均按照当地动物护理伦理委员会批准的动物实验机构指南进行并符合来自欧洲议会关于保护用于科学目的的动物的指令2010/63/eu的指南或nih指南。
[0243]
饮食诱导的肝脂肪变性的小鼠模型。
[0244]
用西方饮食喂养8周龄小鼠4周(envigo#td.88137，含有0.2％胆固醇、来自脂肪的42％kcal、以重量计的34％蔗糖)。在4周期间的最后2周，每天以1mg/kg/天向小鼠腹膜内施用式(i)的肽或pbs(对照组)。在治疗期之后，将小鼠禁食过夜，通过腹膜内注射氯胺酮和盐酸甲苯噻嗪来麻醉，然后通过放血处死。在处死时测定体重、肝脏甘油三酯含量、血浆脂质和转氨酶。
[0245]
肝脏甘油三酯含量。
[0246]
将100mg肝组织在900μl ph 7.4的磷酸盐缓冲液中匀浆，直到组织完全裂解。通过将125μl裂解物与1ml chcl3∶meoh(2∶1)混合来提取脂质。离心后，氯仿相在氮气流下进行蒸发，干燥的残留物溶解在200μl异丙醇中。使用基于gpo-pap检测方法的商业试剂盒(biolabo sa，maizy，法国)测量甘油三酯。结果表示为mg甘油三酯/g肝。
[0247]
血浆脂质和转氨酶水平的分析
[0248]
基于chod-pap和gpo-pap检测方法、偶联酶促反应和反应终产物的分光光度法检测，使用商业比色试剂盒(biolabo sa，maizy，法国)测定甘油三酯和胆固醇水平。丙氨酸氨基转移酶(alt)和天冬氨酸氨基转移酶(ast)水平使用cobas-mira 生化分析仪(anexplo facility，图卢兹，法国)测定。
[0249]
口服葡萄糖耐量试验(ogtt)
[0250]
在8周的饮食之后，在过夜禁食期之后用口服管饲葡萄糖负荷(3mg/g体重)处理小鼠。在口服葡萄糖负荷前30分钟和口服葡萄糖负荷后0、15、30、45、60、90和120分钟，用便携式血糖仪(accu-check，roche)通过尾静脉取样测量血糖水平。根据制造商的说明，使用elisa试剂盒(mercodia，乌普萨拉，瑞典)在5μl血浆中加载葡萄糖前30分钟和加载后15分钟测定血浆胰岛素浓度。
[0251]
结果：
[0252]
结果显示在图12中。两周腹膜内注射式(ii)的肽显著减少了肝脏脂肪变性，如肝脏/体重比的降低(图12b，相比于pbs，p＜0.01))和肝脏甘油三酯浓度的降低(图12c，相比于pbs，p＜0.05)所支持的。用式(ii)的肽的处理对血浆甘油三酯和hdl-胆固醇(hdl-c)水平没有影响(图12d和12f)，但显著降低总胆固醇的血浆水平(图12e，相比于pbs，p＜0.05)，表明式(ii)的肽在降低高胆固醇血症中的有益作用。用式(ii)的肽的处理显著降低血浆alt水平(图12h，相比于pbs，p＜0.05)，表明肝功能的潜在改善。
[0253]
关于葡萄糖代谢，式(ii)的肽改善了口服葡萄糖耐量(图12i)并降低了基础胰岛素水平(图12j，相比于pbs pbs，p＜0.05)。
[0254]
用式(i)的肽的处理证明了对nash相关的脂肪变性和葡萄糖代谢的益处。因此，式(i)的肽是治疗和逆转肝脂肪变性和解决葡萄糖代谢失调，特别是在非酒精性脂肪性肝炎(nash)中的良好候选者。
[0255]
实施例13：式(i)的肽对nash相关肝纤维化进展的体内功效。
[0256]
材料和方法：
[0257]
动物。
[0258]
野生型c57b/l6j雄性小鼠购自janvier labs(le genest saint isle，法国)。在rangueil(anexplo平台，us006，图卢兹，法国)的动物设施的特定无病原体条件下，将小鼠关在动物室中，光照/黑暗时间表为12小时/12小时。在饮食干预开始时，所有动物均为8周龄，并以正常的饲料随意喂食(#v1535r/m-h，ssniff，德国)。所有动物实验程序均按照当地动物护理伦理委员会批准的动物实验机构指南进行并符合来自欧洲议会关于保护用于科学目的的动物的指令2010/63/eu的指南或nih指南。
[0259]
饮食诱导的nash相关肝纤维化的小鼠模型。
[0260]
8周龄的小鼠被喂食由以重量计60kcal％脂肪和0.1％甲硫氨酸组成的胆碱缺乏、l-氨基酸确定的高脂肪饮食(cdahfd#a06071302，research diet，usa)6周[11]。在6周期间的最后2周，将含有式(i)的肽的渗透泵植入一组小鼠。简言之，将200μl渗透泵装满10mg/ml的pbs中的式(i)的肽，并根据制造商的说明(模型泵#2002)将其皮下植入小鼠体内，以确保式(i)的肽以0.5μl/小时的估计速率释放，其对应于每天每千克体重5mg式(i)的肽的估计递送量(5mg/kg bw/天)。对照组由经历用于渗透泵植入的相同外科手术的小鼠(假手术小鼠)组成。
[0261]
肝脏组织学。在治疗期之后，将小鼠禁食过夜，通过腹膜内注射氯胺酮和盐酸甲苯噻嗪来麻醉，然后通过放血处死。用多聚甲醛固定肝主叶样品，包埋在石蜡中，然后切成5μm切片，然后脱蜡、再水化。纤维化通过天狼星红染色评估。简言之，将切片在溶解于饱和苦味酸中的1％天狼星红(sigma-aldrich)中温育10分钟，然后用蒸馏水冲洗。然后用无水乙醇
将切片脱水15分钟，并与清除剂(euromedex，法国)温育，然后用联苯乙烯增塑剂二甲苯(distyrene plasticizer xylene)(dpx)封片并盖上盖玻片。染色后，用nanozoomer 2.0rs(hamamatsu，日本)扫描载玻片。
[0262]
肝羟脯氨酸定量。
[0263]
肝羟脯氨酸通过在110摄氏度下在6n hcl溶液中过夜水解80-140mg肝脏来测定。将样品在柠檬酸醋酸盐缓冲液中稀释，并用氯胺t(sigma-aldrich-aldrich)和4-(二甲基)氨基苯甲醛(sigma-aldrich-aldrich)处理。在550nm处测量吸光度，结果以微克肝羟脯氨酸/mg组织表示。
[0264]
结果：
[0265]
结果显示在图13中。式(i)的肽的两周皮下输注显著减弱了cdahfd饮食诱导的小鼠肝纤维化增加。首先，通过天狼星红染色对小鼠肝脏的组织学检查(图13a，代表性图像)显示用式(i)的肽处理的小鼠比未处理的假手术小鼠具有更少的胶原蛋白沉积(相比于假手术小鼠，p＜0.01，图13b)。其次，通过测量纤维化标志物羟脯氨酸中的肝含量来评估肝纤维化。如图14c中报告的，用式(i)的肽处理的小鼠每毫克肝脏的羟脯氨酸含量浓度具有超过35％的降低(相比于假手术小鼠，p＜0.05)。
[0266]
结论：
[0267]
用式(i)的肽的治疗证明了对nash相关纤维化的益处。因此，式(i)的肽是治疗和逆转肝纤维化，特别是在非酒精性脂肪性肝炎(nash)中的良好候选物。
[0268]
序列表
[0269][0270]
参考文献
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