一种中亚苦蒿组织培养扩繁的方法

1.本发明涉及药用植物组织培养领域，尤其涉及一种中亚苦蒿组织培养扩繁的方法。


背景技术：

2.中亚苦蒿(artemisia absinthium)是菊科蒿属多年生的草本植物，广泛分布于亚洲中部或中西部、欧洲各国、非洲北部及西北部和北美洲的加拿大与美国东部等地区。在我国新疆有分布，在南京、山东有少量栽培。它作为欧洲著名的“苦艾酒”的主要原料，具有约300年的食用历史，同时也具有悠久的药用历史，在欧洲、克什米尔、伊朗、印度和巴基斯坦等国常被用于治疗肝炎、消化不良、胃痛、贫血和厌食等。现代药理研究表明，其具有抗菌、抗氧化、肝保护、神经保护和抗抑郁等活性。其提取物是化妆品原料，已被开发为众多上市的化妆品。随着中亚苦蒿在酿酒领域、化妆品领域、药用及保健品领域的需求增加，中亚苦蒿的规模化繁育已成为亟需解决的重要产业问题。因此，为了解决中亚苦蒿的规模化繁育及引种问题，急需一种快速的中亚苦蒿组培扩繁方法。


技术实现要素：

3.本发明针对中亚苦蒿作为新资源的引种与资源稀缺的问题，直接诱导中亚苦蒿带芽茎端直接生根一步成苗，提供了一种优质、快速、高效的中亚苦蒿组培快速繁殖的方法。
4.为解决上述技术问题，本发明提供了一种中亚苦蒿组织培养扩繁的方法，包括如下步骤：以生根培养基培养中亚苦蒿无菌带芽茎段，扩繁中亚苦蒿组培苗；所述生根培养基为向固体ms基本培养基中添加萘乙酸、蔗糖和凝固剂得到的固体培养基，所述生根培养基中，萘乙酸的含量为0.4-0.6mg/l，蔗糖的含量为30g/l。
5.所述生根培养基的ph值为6.2-6.5。
6.所述生根培养基的凝固剂为琼脂，所述生根培养基中，琼脂的含量为7-9g/l。
7.获取所述中亚苦蒿无菌带芽茎段包括消毒，所述消毒包括将外植体浸入0.1％升汞 0.04-0.06％吐温的混合液中6-7min的步骤。所述优选为包括将外植体浸入0.1％升汞 0.05％吐温的混合液中6min的步骤。
8.所述中亚苦蒿无菌带芽茎段的茎段长度为1.0-1.5cm。
9.所述中亚苦蒿无菌带芽茎段，来自a1或a2:
10.a1、采集生长旺盛、无病虫害的中亚苦蒿茎，切成带芽茎段，消毒，得到中亚苦蒿无菌带芽茎段；
11.a2、组培获得的中亚苦蒿组培苗，将其茎切成带芽茎段，得到中亚苦蒿无菌带芽茎段。
12.所述培养，培养25-30天。
13.所述培养的培养条件为温度23-26℃，相对湿度50-70％，每天12-14h光照/10-12h黑暗，光照强度为1000-3000lux。
14.本发明的中亚苦蒿组织培养扩繁的方法，还包括将亚苦蒿组培苗炼苗后移栽定植。
15.本发明的中亚苦蒿组织培养扩繁的方法使用少量的植株材料可在短时间内快速繁殖出大批的中亚苦蒿小苗，用于生产研究中。本发明的方法得到的组培苗，所有繁育的小苗均来自于同一植株，品种与遗传性状一致，同时便于为中亚苦蒿的遗传转化相关研究提供基础。
具体实施方式
16.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
17.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
18.下述实施例中的中亚苦蒿可市购获得。
19.预实验
20.中亚苦蒿组培外植体消毒方式筛选实验：
21.在天气晴朗的中午或下午，采集中亚苦蒿的枝条，清洗干净后，选取带芽的茎段，剪成1.0-1.5cm长度的段，得到带芽茎段作为外植体，备用。
22.设置了3种外植体的消毒方式，具体如下：
23.消毒方式1：将步骤1得到的外植体置于流水下冲洗30min做初步灭菌处理，备用。超净台紫外灭菌30min后，剩余操作在超净台中处理。将冲洗后的外植体浸入体积百分含量75％(v/v)的乙醇溶液中30s，随后立即取出，使用无菌水(高压灭菌锅121℃，15min灭菌)冲洗3次，再将外植体浸入0.1％升汞 0.05％吐温的混合液中6min，最后再用无菌水冲洗5次，得到无菌带芽茎段，备用。
24.消毒方式2：将步骤1得到的外植体置于流水下冲洗30min做初步灭菌处理，备用。超净台紫外灭菌30min后，将冲洗后的外植体浸入体积百分含量75％(v/v)的乙醇溶液中30s，随后立即取出，使用无菌水(高压灭菌锅121℃，15分钟灭菌)冲洗3次，再将外植体浸入0.1％升汞 0.05％吐温的混合液中8min，最后再用无菌水冲洗5次，得到无菌带芽茎段，备用。
25.消毒方式3：将步骤1得到的外植体置于流水下冲洗30min做初步灭菌处理，备用。超净台紫外灭菌30min后，将冲洗后的外植体浸入体积百分含量75％(v/v)的乙醇溶液中30s，随后立即取出，使用无菌水(高压灭菌锅121℃，15分钟灭菌)冲洗3次，再将外植体浸入0.1％升汞 0.15％吐温的混合液中6min，最后再用无菌水冲洗5次，得到无菌带芽茎段，备用。
26.将获得的消毒外植体接种到初代培养基中。初代培养基为以固体ms基本培养基为基础培养基，6-ba(6-苄氨基嘌呤)的浓度为2.0mg/l、蔗糖的浓度为30g/l、琼脂的浓度为9g/l，ph值为6.2的培养基。初代培养基的具体配制方法(以1l为例)可为：在2000ml的锥形瓶(洗净，并用去离子水润洗3遍)中利用水溶解4.48g的ms培养基基础盐(phytotechnology
公司，hgy0519284a)、30g蔗糖(国药集团化学试剂有限公司，20211118)和9g琼脂粉(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，b214101300)，并在其中添加最终浓度为2.0mg/l的6-ba，加水定容至1l，调ph值至6.2，121℃高压灭菌15min，灭菌完成后趁热在超净台中分装于组培瓶中，待其冷却后，将不同消毒方式处理的的组培苗接种于瓶中。密封组培瓶，置于组培间培养。
27.上述步骤中，每瓶接种3颗苗，每个处理接种10瓶，3次重复。培养条件为温度23-26℃，相对湿度50-70％，光照强度为1000-3000lux，光照12h，黑暗12h。
28.统计使用消毒方式1、消毒方式2和消毒方式3处理的染菌率，结果如表1所示：
29.表1不同消毒方式的外植体染菌率
30.消毒方式染菌率/％消毒方式127％消毒方式280％消毒方式383％
31.通过对比消毒方式1与消毒方式2，可得出结论，当将外植体浸入0.1％升汞 0.05％吐温的混合液消毒时，外植体浸泡6min，消毒效果更好，时间增加，污染率升高。通过对比消毒方式1和消毒方式3，可得出结论，升汞和吐温的混合溶液中吐温的浓度为0.05％时，消毒效果更好，浓度升高至0.15％时，污染率增高。综上所诉，在其他条件不变的情况下，将外植体浸入0.1％升汞 0.05％吐温的混合溶液中6min消毒效果较好。
32.实施例1
33.中亚苦蒿组培扩繁方法，包括如下步骤：
34.步骤1：外植体材料的选取
35.在天气晴朗的中午或下午，采集中亚苦蒿的枝条，清洗干净后，选取带芽的茎段，剪成1.0-1.5cm长度的段，得到带芽茎段作为外植体，备用。
36.步骤2：外植体的消毒
37.消毒方式(即预实验中的消毒方式1)：将步骤1得到的外植体置于流水下冲洗30min做初步灭菌处理，备用。超净台紫外灭菌30min后，剩余操作在超净台中处理。将冲洗后的外植体浸入体积百分含量75％(v/v)的乙醇溶液中30s，随后立即取出，使用无菌水(高压灭菌锅121℃，15分钟灭菌)冲洗3次，再将外植体浸入0.1％升汞 0.05％吐温的混合液中6min，最后再用无菌水冲洗5次，得到无菌带芽茎段，备用。
38.步骤3：生根培养
39.设置5种生根培养，具体如下：
40.生根培养基1：生根培养基1为以固体ms基本培养基为基础培养基，naa(萘乙酸)的浓度为0.5mg/l、蔗糖的浓度为30g/l、琼脂的浓度为9g/l，ph值为6.2的培养基。生根培养基1的具体配制方法(以1l为例)可为：在2000ml的锥形瓶(洗净，并用去离子水润洗3遍)中利用水溶解2.24g的ms培养基基础盐(phytotechnology公司，hgy0519284a)、30g蔗糖(国药集团化学试剂有限公司，20211118)和9g琼脂粉(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，b214101300)，并在其中添加最终浓度为0.5mg/l的naa，加水定容至1l，调ph值至6.2，121℃高压灭菌15min，灭菌完成后趁热在超净台中分装于组培瓶中，待其冷却。
41.生根培养基2：生根培养基2为以固体ms基本培养基为基础培养基，naa(萘乙酸)的
浓度为1.0mg/l、蔗糖的浓度为30g/l、琼脂的浓度为9g/l，ph值为6.2的培养基。生根培养基2的具体配制方法(以1l为例)可为：在2000ml的锥形瓶(洗净，并用去离子水润洗3遍)中利用水溶解2.24g的ms培养基基础盐、30g蔗糖和9g琼脂粉，并在其中添加最终浓度为1.0mg/l的naa，加水定容至1l，调ph值至6.2，121℃高压灭菌15min，灭菌完成后趁热在超净台中分装于组培瓶中，待其冷却。
42.生根培养基3：生根培养基3为以固体ms基本培养基为基础培养基，naa(萘乙酸)的浓度为1.5mg/l、蔗糖的浓度为30g/l、琼脂的浓度为9g/l，ph值为6.2的培养基。生根培养基3的具体配制方法(以1l为例)可为：在2000ml的锥形瓶(洗净，并用去离子水润洗3遍)中利用水溶解2.24g的ms培养基基础盐、30g蔗糖和9g琼脂粉，并在其中添加最终浓度为1.5mg/l的naa，加水定容至1l，调ph值至6.2，121℃高压灭菌15min，灭菌完成后趁热在超净台中分装于组培瓶中，待其冷却。
43.生根培养基4：生根培养基4为以固体ms基本培养基为基础培养基，iaa(吲哚-3-乙酸)的浓度为0.5mg/l、蔗糖的浓度为30g/l、琼脂的浓度为9g/l，ph值为6.2的培养基。生根培养基4的具体配制方法(以1l为例)可为：在2000ml的锥形瓶(洗净，并用去离子水润洗3遍)中利用水溶解2.24g的ms培养基基础盐、30g蔗糖和9g琼脂粉，并在其中添加最终浓度为0.5mg/l的iaa，加水定容至1l，调ph值至6.2，121℃高压灭菌15min，灭菌完成后趁热在超净台中分装于组培瓶中，待其冷却。
44.生根培养基5：生根培养基5为以固体ms基本培养基为基础培养基，naa(萘乙酸)的浓度为0.5mg/l、iaa(吲哚-3-乙酸)的浓度为0.5mg/l、蔗糖的浓度为30g/l、琼脂的浓度为9g/l，ph值为6.2的培养基。生根培养基5的具体配制方法(以1l为例)可为：在2000ml的锥形瓶(洗净，并用去离子水润洗3遍)中利用水溶解2.24g的ms培养基基础盐、30g蔗糖和9g琼脂粉，并在其中添加最终浓度为0.5mg/l的naa，最终浓度为0.5mg/l的iaa，加水定容至1l，调ph值至6.2，121℃高压灭菌15min，灭菌完成后趁热在超净台中分装于组培瓶中，待其冷却。
45.将步骤2得到的无菌带芽茎段分别接种到生根培养基1、生根培养基2、生根培养基3、生根培养基4和生根培养基5中，密封组培瓶，置于组培间培养。
46.上述步骤中，每瓶接种3颗苗，每个处理接种3瓶，3次重复。培养条件为温度23-26℃，相对湿度50-70％，光照强度为1000-3000lux，光照12h，黑暗12h。
47.统计使用生根培养基1、生根培养基2、生根培养基3、生根培养基4和生根培养基5的处理的生根时间，以及培养30天时的生根率和根长，结果如表2所示：
48.表2不同生根培养基的生根指标
49.[0050][0051]
通过对比生根培养基1与生根培养基2和生根培养基3，可得出结论，在生根培养基中，加入0.5mg的naa有助于促进生根，缩短生根时间，促进根系生长。通过对比生根培养基1和生根培养基4，可得出结论，在培养基中加入iaa也能诱导生根，但总体效果明显不如naa。通过对比生根培养基1和生根培养基5，可得出结论，在生根培养基中，加入naa可促进生根，但总体效果不如单独加入0.5mg/l的naa。综上所述，单独加入0.5mg/l naa生长激素不仅方法简单，节约成本且生根率高，缩短生根时间。
[0052]
步骤4：炼苗移栽：
[0053]
首先准备定植基质(草炭灰：珍珠岩＝3：1，体积比)，置于121℃高压灭菌锅灭菌60min，待混合基质冷却后备用；观察组培苗，待组培苗长至地上部高8-10cm时，打开组培瓶使之暴露在50％遮阴环境下进行炼苗，炼苗3～5d后，洗净根部的培养基，将组培苗转移至混合基质上定植。
[0054]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。