一种乳铁蛋白制备的防治霉菌毒素中毒药物及其应用

1.本发明属于乳铁蛋白应用技术领域，具体涉及到一种乳铁蛋白制备的防治霉菌毒素中毒药物及其应用。


背景技术：

2.自然条件下霉菌会污染玉米、小麦、大麦等农作物并进一步产生次级代谢产物——霉菌毒素，霉菌毒素被采食后会在动物器官和组织内积累并引发霉菌毒素中毒。动物长期、低剂量摄入霉菌毒素会导致其采食量、消化率、日增重以及生产性能均发生下降，这会给畜牧业造成极大的经济损失，因此如何防治霉菌毒素中毒造成的危害，对畜牧业的发展至关重要。
3.由于霉菌毒素污染范围广、稳定性强，在饲料生产过程中不容易去除，因此不能做到根除饲料中的霉菌毒素。在饲料或饮食中加入特定的添加剂能够起到缓解霉菌毒素造成的机体损伤、改善机体健康状况的作用。
4.霉菌毒素对人和动物机体造成损伤的前体条件是从环境中进入机体，而肠道是机体摄入霉菌毒素的主要器官，也是对抗霉菌毒素的第一道生理屏障，肠道屏障是防止肠内有害物质进入机体的重要结构。肠上皮的紧密连接是肠道屏障的关键部分。采食含有霉菌毒素的饲料后，霉菌毒素会经常消化道进入肠道，霉菌毒素会造成肠上皮细胞功能的改变。因此研究霉菌毒素损伤肠道是非常必要的。
5.动物霉菌毒素中毒后，首先应立即停止饲喂霉菌毒素污染的饲料，并使用一些药物来治疗霉菌毒素中毒。治疗要以提高动物机体免疫力、中和毒素、保肝解毒、排毒为原则。目前对于霉菌毒素中毒常用的治疗方法主要有以下三类。
6.(1)蒙脱石，蒙脱石能够吸附肠道中的霉菌毒素并排出体外，此产品价格低廉、尤其对黄曲霉毒素吸附作用较好，但同时蒙脱石会吸附饲料中的营养物质，影响畜禽正常的营养摄入。
7.(2)盐类泻剂通过添加葡萄糖、甘露糖、山梨酸钾等物质可以有效进行霉菌毒素的解毒，促使胃肠道内的毒素尽快排出；还需根据症状采取对症疗法，即补充充足的维生素a、维生素c和维生素e。该方法治疗不全面、彻底，有造成二次危害的缺陷。
8.(3)微生态制剂，该方法能够使霉菌毒素转化为低毒或无毒形式。但因抗生素杀菌没有选择性，微生态制剂不能和抗生素联合使用。此外，制剂对部分有益菌也有一定抑杀功能，联用将会导致药效下降。
9.而乳铁蛋白是一种天然的是一种多功能蛋白质，具有广谱抗菌，抗病毒感染作用，能调节体内铁的平衡；调节骨髓细胞的生成，促进细胞的生长；调节机体免疫功能，增强机体抗病能力；抑制人体肿瘤细胞的作用；还能同多种抗生素及抗真菌制剂协同作用，更有效地治疗疾病。


技术实现要素：

10.本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本技术的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
11.鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
12.因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种乳铁蛋白制备的防治霉菌毒素中毒药物。
13.为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：所述乳铁蛋白药物的制备方法为将乳铁蛋白粉末溶于生理盐水溶液中，制得乳铁蛋白-生理盐水溶液。
14.作为本发明所述的一种优选方案，其中：所述所述乳铁蛋白粉末的质量为5～20mg，生理盐水为100μl。
15.作为本发明所述的一种优选方案，其中：所述乳铁蛋白粉末的质量为10mg，生理盐水为100μl。
16.本发明的再一目的是，克服现有技术中的不足，提供一种乳铁蛋白制备的防治霉菌毒素中毒药物的应用。
17.作为本发明所述的一种优选方案，其中：所述应用包括，模拟一种小鼠采食霉菌毒素的饮食环境，再对小鼠进行乳铁蛋白-生理盐水溶液灌胃处理。
18.作为本发明所述的一种优选方案，其中：所述模拟采食霉菌毒素为在小鼠采食的商品化饲料中添加呕吐毒素制粒得饲料颗粒。
19.作为本发明所述的一种优选方案，其中：所述饲料颗粒的呕吐毒素浓度为12mg/kg。
20.作为本发明所述的一种优选方案，其中：模拟小鼠采食霉菌毒素的饮食环境包括，把配好的饲料颗粒倒入采食槽中让小鼠自由饮食，持续处理35天。
21.作为本发明所述的一种优选方案，其中：所述乳铁蛋白药物能够促进肠道有益菌定植，降低有害菌增殖，从而通过改变肠道菌群结构，提高肠道挥发性脂肪酸的含量，从而增强肠道抗霉菌能力。
22.作为本发明所述的一种优选方案，其中：所述乳铁蛋白药物通过上调紧密连接蛋白的表达和降低促炎细胞因子的水平来减轻营养不良引起的肠道损伤。
23.作为本发明所述的一种优选方案，其中：所述乳铁蛋白通过与呕吐毒素之间的交互作用，促进小肠绒毛生长，加强肠道对营养物质的吸收能力。
24.本发明有益效果：
25.(1)本发明采用在小鼠日常饮食的同时灌胃乳铁蛋白，为在家畜日常生活中防治霉菌毒素提供了一个新的思路，一方面乳铁蛋白能够削弱mapk的激活，从而抑制肠道炎症并维持肠道完整性；另一方面乳铁蛋白还能够发挥“益生菌”作用，促进有益菌(乳酸杆菌)的定植和短链脂肪酸(scfas)的产生，这些脂肪酸可以从肠腔转运到宿主血液中，并显示出多种生物学功能。
26.(2)本发明采用灌胃乳铁蛋白来防治霉菌毒素，优选出最佳的灌胃浓度，该方法能够有效的抵消呕吐毒素在肠道中引起的不利影响，同时，乳铁蛋白属于动物体内源性物质，安全无毒，无需大剂量添加且防治效率极高。
附图说明
27.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
28.图1为本发明实施例3中不同浓度的乳铁蛋白药物对暴露于呕吐的小鼠体重的影响结果图。
29.图2a为本发明实施例4中不同实验组小鼠在5周内的体重变化趋势图；
30.图2b为本发明实施例4中不同实验组小鼠第5周小鼠的最终体重图；
31.图2c为本发明实施例4中不同实验组小鼠5周内小鼠的平均日采食量图。
32.图3为本发明实施例4中不同实验组的肠道形态关键指标结果图。
33.图4为本发明实施例4中不同实验组的he染色图。
34.图5a-图5e为本发明实施例4中不同实验组血浆中il-1β、il-6、il-8、tnf-α和il-10的蛋白水平结果图；
35.图5f-图5j为本发明实施例4中不同实验组空肠中il-1β、il-6、il-8、tnf-α和il-10的基因水平结果图。
36.图6a-图6b为本发明实施例4中不同实验组血浆中dao(二胺氧化酶)水平，claudin-1、occludin、itln1和gapdh的western blot结果图；
37.图6c-图6g为本发明实施例4中不同实验组空肠中claudin-1的蛋白表达水平，空肠中occludin的蛋白表达水平，空肠中itln1的蛋白表达水平，空肠中p38的磷酸化水平，空肠中erk1/2的磷酸化水平图。
38.图7a-图7h为本发明实施例4中不同实验组的ace指数，chao指数，主坐标分析，shannon指数，simpson指数，门级结肠微生物群中细菌类群的平均相对丰度，结肠消化液中厚壁菌群的相对丰度，结肠消化液中拟杆菌的相对丰度图。
39.图8为本发明实施例4中不同实验组的菌种丰富度图。
40.图9为本发明实施案例4中不同实验组的显著差异的血浆指数、结肠微生物群和短链脂肪酸的相关性分析图。
具体实施方式
41.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
42.在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
43.其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
44.本发明中所涉及原料：
45.乳铁蛋白购买于法国ingrediadairy experts公司
46.呕吐毒素购买于青岛普瑞邦生物工程有限公司(货号为mss1011)；
47.其他原料无特殊说明均为普通市售。
48.实施例1
49.本实施例制备不同浓度的防治霉菌毒素中毒的药物。
50.将无菌ep管放在天平上称取归置为零，用药匙把乳铁蛋白(lf)纯品粉末放入ep管内，分别至胶囊内乳铁蛋白粉末重量为5、10、20mg，在ep管中加入100μl生理盐水并混匀，制得不同浓度的乳铁蛋白-生理盐水溶液。
51.实施例2
52.本实施例提供一种模拟小鼠采食霉菌毒素的饮食环境。
53.称取12mg的呕吐毒素纯品粉末和1kg商品化饲料粉料混合均匀制粒配成呕吐毒素(don)浓度为12mg/kg的饲料颗粒，把配好的饲料颗粒倒入采食槽中让小鼠自由饮食。
54.实施例3
55.本实施例探究乳铁蛋白药物浓度对防治霉菌毒素中毒的影响效果。
56.固定好如实施例2处理的小鼠，抽取实施例1制得的不同浓度的乳铁蛋白-生理盐水溶液100μl，把针头放入小鼠舌体后部，采用每天灌胃的方式，连续处理35天后观察小鼠情况，结果如图1所示。
57.可见图1，展示了不同浓度的乳铁蛋白药物对暴露于呕吐的小鼠体重的影响。结果表明，当乳铁蛋蛋白浓度为10mg时，对小鼠体重恢复作用最为明显。而当乳铁蛋白含量为20mg时，小鼠体重恢复效果反而弱于10mg，这因为当乳铁蛋白含量较高，可引起小鼠铁中毒且存在增加小鼠肾脏负担的可能，因此乳铁蛋白含量不能过高。
58.实施例4
59.本实施例验证乳铁蛋白药物在防治霉菌毒素中毒的作用。
60.设置四组实验进行验证，分别为：
61.空白组：饲喂小鼠普通的商品化饲料，每天灌胃100μl生理盐水，35天后观察小鼠的情况；
62.乳铁蛋白组：饲喂小鼠普通的商品化饲料，同时每天灌胃100μl含乳铁蛋白的生理盐水溶液，35天后观察小鼠的情况；
63.呕吐毒素组：按照实施例2的处理方法，饲喂小鼠呕吐毒素(don)浓度为12mg/kg的饲料颗粒，让小鼠自由采食，35天后观察小鼠的情况；
64.呕吐毒素 乳铁蛋白组：按照实施例2的处理方法，饲喂小鼠呕吐毒素(don)浓度为12mg/kg的饲料颗粒，让小鼠自由采食，同时每天灌胃100μl含乳铁蛋白的生理盐水溶液，35天后观察小鼠的情况。
65.参见图2～图8，展示了上述实验的结果。
66.如图2所示，图2中的a、b、c分别为本发明实施案例4中空白组、乳铁蛋白组、呕吐毒素组和呕吐毒素 乳铁蛋白组在5周内小鼠体重变化趋势(a)，第5周小鼠的最终体重(b)和5周内小鼠的平均日采食量(c)；可以看出，乳铁蛋白处理有效提升了经呕吐毒素处理过的小鼠的生长性能，同时在体重和采食量方面均有较好表现。
67.图3为本发明实施案例4中空白组、乳铁蛋白组、呕吐毒素组和呕吐毒素 乳铁蛋白组四组实验中肠道形态关键指标，其中各字母分别代表十二指肠绒毛高度(a)，十二指肠绒
毛宽度(b)，十二指肠隐窝深度(c)，十二指肠绒毛高度/十二指肠隐窝深度(d)，空肠绒毛高度(e)，空肠绒毛宽度(f)，空肠隐窝深度(g)，空肠绒毛高度/空肠隐窝深度(h)，回肠绒毛高度(i)，回肠绒毛宽度(j)，回肠隐窝深度(k)，回肠绒毛高度/回肠隐窝深度(l)；图4为实施例4中四个实验组的he染色图。
68.由图3以及图4可以看出，乳铁蛋白可以调节暴露于呕吐毒素的小鼠的肠道形态，十二指肠的绒毛高度(vh)和绒毛宽度(vw)显著受到呕吐毒素和乳铁蛋白之间的交互作用影响，呕吐毒素组的vh和vw低于对照组和呕吐毒素 乳铁蛋白组,空肠的vh受呕吐毒素和乳铁蛋白之间的交互作用影响，呕吐毒素组的vh低于对照组和呕吐毒素 乳铁蛋白组，vh/cd(肠绒毛高度比隐窝深度)的比值也因呕吐毒素处理而降低。且从图3中特别是图3a、图3b、图3f、图3g中可以明显看到这几个指标下的乳铁蛋白组的十二指肠、空肠绒毛高度、宽度明显低于呕吐毒素 乳铁蛋白组，这是由于单独添加乳铁蛋白对小肠绒毛的促生长作用低于呕吐毒素 乳铁蛋白共同作用，这是因为该指标影响的是小鼠的消化吸收能力，而呕吐毒素 乳铁蛋白之间的交互作用更能刺激小鼠吸收外界营养物质。
69.图5中的a-e展示了本发明实施案例4中空白组、乳铁蛋白组、呕吐毒素组和呕吐毒素 乳铁蛋白组四组实验中血浆中il-1β、il-6、il-8、tnf-α和il-10的蛋白水平，f-j展示了空肠中il-1β、il-6、il-8、tnf-α和il-10的mrna水平。从图中可以看出添加乳铁蛋白可以减少霉菌毒素处理小鼠促炎细胞因子的分泌，血浆中的促炎细胞因子(il-1β、il-6、il-8和tnf-α)在统计学意义上受don和lf之间的交互作用影响，呕吐毒素组il-1β、il-8和tnf-α水平均高于对照组和呕吐毒素 乳铁蛋白组。此外，血浆中的抗炎细胞因子il-10受呕吐毒素和乳铁蛋白之间的交互作用显著影响，呕吐毒素组的il-10水平低于对照组和呕吐毒素 乳铁蛋白组。
70.图6中的的a-g分别为本发明实施案例4中空白组、乳铁蛋白组、呕吐毒素组和呕吐毒素 乳铁蛋白组四组实验中血浆中dao(二胺氧化酶)水平(a)，claudin-1、occludin(封闭蛋白)、itln1和gapdh的western blot结果(b)，空肠中claudin-1的蛋白表达水平(c)，空肠中occludin的蛋白表达水平(d)，空肠中itln1的蛋白表达水平(e)，空肠中p38的磷酸化水平(f)，空肠中erk1/2的磷酸化水平(g)图；从图中可以看出，lf通过增强空肠紧密连接蛋白的表达而降低肠道通透性，血浆中dao的水平受到呕吐毒素和乳铁蛋白的交互作用影响，呕吐毒素组的水平显著低于对照组和呕吐毒素 乳铁蛋白组。此外，空肠中密封蛋白的表达也显示出与上述相同的变化。同时，乳铁蛋白增强itln1的蛋白表达并抑制mapk通路的激活，空肠itln1蛋白表达的水平受到呕吐毒素和乳铁蛋白的交互作用影响，呕吐毒素组的蛋白水平显著低于对照组和呕吐毒素 乳铁蛋白组。此外，p38的磷酸化在呕吐毒素组显示出高于对照组和呕吐毒素 乳铁蛋白组的水平。相较于对照组和呕吐毒素 乳铁蛋白组，呕吐毒素处理显著上调了erk1/2的磷酸化水平。
71.图7中的a-h分别为本发明实施案例4中空白组、乳铁蛋白组、呕吐毒素组和呕吐毒素 乳铁蛋白组四组实验中ace指数(a)，chao指数(b)，主坐标分析(pcoa)(c)，shannon指数(d)，simpson指数(e)，门级结肠微生物群中细菌类群的平均相对丰度(f)，结肠消化液中厚壁菌群的相对丰度(g)，结肠消化液中拟杆菌的相对丰度(h)图；从图中可以看出，乳铁蛋白可以调控呕吐毒素处理小鼠的结肠微生物群。shannon和simpon指数受到呕吐毒素和乳铁蛋白的交互作用影响，与对照组和呕吐毒素 乳铁蛋白组相比，呕吐毒素组小鼠的shannon
指数较低，simpson指数较高。此外，结肠微生物群落的pcoa揭示出，呕吐毒素和乳铁蛋白组的微生物群被区分。在门水平上，类杆菌是结肠中最主要的门，拟杆菌和厚壁菌的相对丰度受到呕吐毒素处理的显著影响。
72.图8中的a-j分别为本发明实施案例4中空白组、乳铁蛋白组、呕吐毒素组和呕吐毒素 乳铁蛋白组四组实验中最丰富的20个属(a)，梭菌、瘤胃球菌、另枝菌和臭杆菌的相对丰度(b-d)，乙酸、丙酸、丁酸和戊酸的水平(浓度单位)(g-j)的图；在属水平上，梭菌-xiva和乳酸菌属是优势菌，呕吐毒素组梭菌-xiva的相对丰度低于对照组和呕吐毒素 乳铁蛋白组，而乳酸菌属的相对丰度则更高。此外，较对照组而言，呕吐毒素处理降低了另枝菌属和臭杆菌属的相对丰度。同时，乳铁蛋白促进呕吐毒素暴露小鼠肠道微生物代谢产物生成，结肠丙酸水平受到呕吐毒素和乳铁蛋白的交互作用影响，表现为呕吐毒素组具有较于对照组和呕吐毒素 乳铁蛋白组更高的丙酸水平和更低的丁酸水平。
73.图9为本发明实施案例4中空白组、乳铁蛋白组、呕吐毒素组和呕吐毒素 乳铁蛋白组四组实验中显著差异的血浆指数、结肠微生物群和短链脂肪酸的相关性分析的图。其中蓝色代表显著正相关，红色代表显著负相关。如图9所示，展示了血浆、微生物群和结肠短链脂肪酸中细胞因子和dao水平的相关性分析，il-1β水平与il-8、tnf-α和dao水平、瘤胃球菌属相对丰度呈显著正相关，与il-10、丙酸水平和梭菌-xiv a相对丰度呈显著负相关。此外，il-10水平与结肠丙酸水平呈正相关。对于短链脂肪酸而言，它和丁酸水平、另枝菌属、梭菌-xiv a和臭杆菌的相对丰度呈正相关。
74.综上所述，本发明所述的添加乳铁蛋白能够降低呕吐毒素造成的炎症因子的表达，同时可以增强空肠紧密连接蛋白的表达，从而缓解呕吐毒素对肠道功能的损伤。此外，乳铁蛋白还可以调控呕吐毒素处理小鼠的结肠微生物群并改善肠道微生物代谢，并通过乳铁蛋白与呕吐毒素之间的交互作用，促进小肠绒毛生长，加强肠道对营养物质的吸收能力。
75.应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。