广谱抗病毒中药单体汉防己乙素及其应用

1.本发明涉及中药单体广谱抗病毒药物技术领域，涉及广谱抗病毒中药单体汉防己乙素及其应用。


背景技术：

2.病毒因其简单的结构，具有突变率高、增殖迅速、种类繁多等特点，在病毒性疾病的治疗中，多重病毒感染、病毒变异和耐药性等诸多问题，大大增加了药物抗病毒的难度及迫切性。针对这些问题，如何高效地进行药物筛选等相关研究、有效应对病毒变异也成为亟待解决的问题。
3.中药多成分、多靶点、多途径的作用特点使其在抗病毒新药开发方面具有极大的优势和潜力。相比于化学合成新的化合物，从已有的药物单体中筛选出有效的抗病毒药物，在研发成本、研发周期、药物效果等方面都表现出明显的优势。


技术实现要素：

4.本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
5.本发明还有一个目的是提供一种广谱抗病毒中药单体。
6.本发明另有一个目的是提供广谱抗病毒药物组合物。
7.本发明再有一个目的是提供所述的广谱抗病毒中药单体或所述的广谱抗病毒药物组合物在作为病毒感染抑制剂、在制备预防和治疗病毒感染性疾病药物或科学研究中的应用。
8.为此，本发明提供的技术方案为：
9.一种广谱抗病毒中药单体，其为汉防己乙素(汉防己乙素fangchinoline简称fan)。
10.广谱抗病毒药物组合物，其包含汉防己乙素或一种或多种其药学上可接受的盐和其在药学上可接受的载体或稀释剂。
11.优选的是，所述的广谱抗病毒药物组合物中，包含汉防己乙素和氯喹。
12.所述的广谱抗病毒中药单体或所述的广谱抗病毒药物组合物在作为病毒感染抑制剂和/或在制备预防和治疗病毒感染性疾病药物中的应用。
13.优选的是，所述的应用中，所述病毒包括水疱性口炎病毒、甲型流感病毒、脑心肌炎病毒和i型单纯疱疹病毒。
14.优选的是，所述的应用中，所述的广谱抗病毒中药单体通过激活i型干扰素信号通路以产生抗病毒作用。
15.优选的是，所述的应用，还包含：汉防己乙素具有增强已知抗病毒药物的抗病毒功能的作用。
16.优选的是，所述的应用中，所述已知抗病毒药物为氯喹。
17.本发明至少包括如下有益效果：
18.本发明是从中药材粉防己中明确提取出来的中药单体，是具有药用价值的生物碱。是中医药在抗病毒研究方面的一个补充。
19.本发明从细胞水平证明汉防己乙素可抑制多种rna病毒和dna病毒，具有潜在抗病毒的广谱性。是目前广谱抗病毒药物的一个补充。
20.本发明采用多种实验技术手段探究汉防己乙素的抗病毒机制。通过激活宿主i型干扰素信号通路，提高宿主抗病毒免疫应答水平，增强宿主抗病毒感染能力，发挥预防和治疗病毒感染疾病的功能。
21.本发明为多种病毒感染性疾病的预防和治疗提供了一种潜在的广谱抗病毒药物。
22.本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
23.图1为本发明其中一个实施例中的fan在a549细胞中细胞毒性检测结果。
24.图2为本发明其中一个实施例中的fan在l929细胞中细胞毒性检测结果。
25.图3为本发明其中一个实施例中的fan在a549细胞中抑制vsv-egfp病毒复制的流式细胞术检测结果图，其中，a为fan与vsv-egfp共处理即病毒感染全程加药检测病毒复制的流式细胞术检测结果，b为a的柱状统计图。
26.图4为本发明其中一个实施例中的fan在a549细胞中抑制vsv-egfp病毒复制的流式细胞术检测结果图，其中，a为fan预处理时药物对病毒的抑制作用流式细胞术检测结果，b为a的柱状统计图。
27.图5为本发明其中一个实施例中的fan在a549细胞中抑制vsv-egfp病毒复制的流式细胞术检测结果，其中，a为病毒进入后给药方式时fan对病毒的抑制作用流式细胞术检测结果，b为a的柱状统计图。
28.图6为本发明其中一个实施例中的蛋白水平上检测fan抑制vsv病毒复制的westernblot结果图，其中，a为a549细胞fan浓度梯度或时间梯度抑制vsv病毒的g蛋白表达情况；b为l929细胞中fan浓度梯度或时间梯度抑制vsv病毒的g蛋白表达情况。
29.图7为本发明其中一个实施例中的不同病毒(a为emcv、b为h1n1、c为hsv-1) 与汉防己乙素共孵育a549细胞后qpcr检测病毒复制结果图。
30.图8为本发明其中一个实施例中的与图7相同处理条件下l929细胞中的qpcr检测病毒复制结果图。
31.图9为本发明其中一个实施例中的a549细胞中fan激活i型干扰素信号通路的 qpcr结果图。
32.图10为本发明其中一个实施例中的mef细胞中fan激活i型干扰素信号通路的 qpcr结果图。
33.图11为本发明其中一个实施例中的thp-1细胞中fan增强isd诱导的i型干扰素信号通路激活的qpcr结果图。
34.图12为本发明其中一个实施例中的thp-1细胞中不同浓度fan促进i型干扰素通路相关蛋白磷酸化的western blot的结果图。
35.图13为本发明其中一个实施例中的fan 10μmol/l浓度条件下，孵育thp-1细胞不同时间点后的western blot检测tbk1和stat1磷酸化水平的结果图。
36.图14为本发明其中一个实施例中的不同浓度氯喹或不同浓度氯喹与fan联用处理 a549细胞，同时感染vsv-egfp(moi＝0.05)，12h后流式检测gfp阳性细胞比率变化图。
具体实施方式
37.下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
38.应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
39.汉防己乙素(fangchinoline，fan)是一种来自粉防己的生物碱，具有良好的生物活性，在抗肝纤维化、治疗高血压、诱导肿瘤细胞凋亡等方面都有较好的效果，但是目前对于抗病毒方面的研究较少。
40.粉防己，系防已科千金藤属植物，是常用的药材，其有效成分为生物碱-汉防己碱，总生物碱含量为1％-2％，其中主要成分为汉防已甲素和汉防己乙素，粉防己生物碱具有镇痛、消炎、降压、抗菌、抗过敏、抗肿瘤、松驰横纹肌等功能。
41.汉防己乙素又称防己诺林碱，其化学本质是双苄基异喹啉类生物碱，是具有抗癌活性的化合物，目前研究表明其通过诱导细胞凋亡抑制乳腺癌的增殖。
42.汉防己乙素的药理功效除上述诸多方面外，本发明探究其在抗病毒方面的药理作用，并深入阐明汉防己乙素抗病毒作用的高效性及其广谱性。
43.本发明提供一种广谱抗病毒中药单体，其为汉防己乙素。本发明以汉防己乙素为研究对象，探索出其常规作用以外在抗病毒领域的新的药用价值，并证明了汉防己乙素是一种高效病毒感染抑制剂。
44.本发明还提供了广谱抗病毒药物组合物，其包含汉防己乙素或一种或多种其药学上可接受的盐和其在药学上可接受的载体或稀释剂。
45.在上述方案中，作为优选，所述的广谱抗病毒药物组合物，包含汉防己乙素和氯喹。汉防己乙素具有增强氯喹抗病毒功能的作用。
46.所述的广谱抗病毒中药单体或所述的广谱抗病毒药物组合物在作为病毒感染抑制剂和/或在制备预防和治疗病毒感染性疾病药物中的应用。
47.在上述应用中，作为优选，所述病毒包括水疱性口炎病毒、甲型流感病毒、脑心肌炎病毒和i型单纯疱疹病毒。
48.在上述应用中，作为优选，所述的广谱抗病毒中药单体通过激活i型干扰素信号通路以产生抗病毒作用。本发明分别从基因水平和蛋白质水平进行了相关研究：汉防己乙素在细胞水平激活i型干扰素信号通路。
49.在上述应用中，作为优选，还包含：汉防己乙素具有增强已知抗病毒药物抗病毒功能的作用。
50.在上述方案中，作为优选，所述已知抗病毒药物为氯喹。
51.为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，现提供如下的实施例进行说明：实施例1
(2.5、5、10μmol/l)降低细胞中gfp阳性细胞百分率，***p《0.001(差异极显著)。 vsv-egfp于4℃吸附2h后加入汉防己乙素，gfp阳性比率降低，证明fan在vsv-egfp 进入细胞后，可抑制vsv病毒复制。
67.为了进一步证明汉防己乙素对vsv病毒复制的抑制作用，发明人用野生型vsv (moi＝0.01)感染培养于24孔板的a549细胞(1.5
×
105/孔)，同时加入含有不同浓度(2.5、 5、10μmol/l)的汉防己乙素完全培养基(dmem培养基 10％fbs，药物按一定的浓度加入培养基)，每孔500μl，继续孵育24h后收细胞进行western blot检测vsv病毒的g 蛋白表达情况。发明人用10μmol/l fan处理a549细胞，同时加入野生型vsv(moi＝0.01) 感染不同时间点(0、8、16、24h)后收细胞进行western blot检测vsv病毒的g蛋白表达情况。此外，用野生型vsv(moi＝0.05)感染培养于24孔板的l929细胞(1.8
×
105/ 孔)，同时加入含有不同浓度(2.5、5、10μmol/l)的汉防己乙素完全培养基，每孔500μl，继续孵育16h。收集并裂解细胞，提取胞内蛋白，western blot检测vsv病毒的g蛋白表达情况。
68.如图6结果显示，a图中，fan显著抑制vsv g蛋白在a549细胞的表达，并呈现浓度梯度(2.5、5、10μmol/l)和时间梯度(0、8、16、24h)地抑制vsv病毒的复制。b 图中，fan显著抑制vsv g蛋白在l929细胞中的表达，且呈现浓度梯度(2.5、5、10μmol/l) 和时间梯度(0、8、16、24h)地抑制vsv病毒的复制。
69.实施例3
70.fan在细胞水平抑制多种病毒复制
71.为了探究fan广谱抗病毒作用，发明人使用多种rna病毒包括vsv(水疱性口炎病毒)、emcv(脑心肌炎病毒)、h1n1(甲型流感病毒)和dna病毒hsv-1(i型单纯疱疹病毒)感染a549细胞或l929细胞，检测fan对病毒复制的影响。具体如下：
72.fan对emcv的抑制：a549细胞或l929细胞中，emcv(moi＝3)与fan浓度梯度 (0、1.25、2.5、5、10μmol/l)共孵育细胞8h后，qpcr检测两种细胞中emcv病毒复制情况。
73.fan对h1n1的抑制：a549细胞或l929细胞中，h1n1(moi＝0.05)与fan浓度梯度(0、1.25、2.5、5、10μmol/l)共孵育细胞8h后，qpcr检测细胞中h1n1病毒复制情况。
74.fan对hsv-1的抑制：a549细胞或l929细胞中，hsv-1(moi＝1)与(fan浓度梯度0、1.25、2.5、5、10μmol/l)共孵育细胞12h后，qpcr检测细胞中hsv病毒复制情况。
75.图7、图8示出fan在细胞水平抑制多种病毒(包括emcv病毒、h1n1病毒和hsv-1 病毒)的qpcr结果示意图。
76.如图7、8结果发现，dmso对照组中多种病毒扩增明显，而加入汉防己乙素的实验组以剂量依赖的方式显著抑制病毒基因表达，10μmol/l时抑制最为显著。病毒感染宿主后会向宿主释放病毒遗传物质，而后利用宿主细胞资源进行子代病毒复制。病毒基因表达强弱可反映病毒在宿主细胞内扩增情况，汉防己乙素处理细胞后，病毒基因表达受抑制，说明fan可有效抵抗上述多种病毒感染，具有潜在广谱抗病毒功能。
77.实施例4
78.汉防己乙素在细胞水平激活i型干扰素信号通路
79.为了探究fan对i型干扰素信号通路相关基因的表达是否有调控作用，10μmol/l的 fan处理a549细胞，不同时间点(0h、12h、24h)收集细胞，提取rna后进行qpcr 检测i型干扰素ifnb1和干扰素诱导基因(ifit1/ifit2/ifi44)的表达情况。此外，fan 10 μmol/l孵育
mef细胞(小鼠原代胚胎成纤维细胞)不同时间点(0、4、8、12h)后收集细胞，提取rna进行qpcr检测i型干扰素基因ifnb1和干扰素诱导基因(ifit1/ifit2/ifi44) 的表达情况。
80.图9、图10分别示出fan在细胞水平激活i型干扰素信号通路的qpcr结果示意图。具体地，图9示出在a549细胞中，10μmol/l的fan孵育不同时间(0h、12h、24h)， qpcr检测ifnb1和干扰素诱导基因(ifit1/ifit2/ifi44)的激活情况。图10示出在mef 细胞中，fan 10μmol/l孵育mef细胞不同时间(0、4、8、12h)后收集细胞，qpcr检测ifnb1和干扰素诱导基因(ifit1/ifit2/ifi44)的表达情况。
81.如图9、10结果显示，在a549细胞和mef细胞中，fan可上调ifnb1和干扰素诱导基因(ifit1/ifit2/ifi44)的表达，并呈现时间依赖性增强。
82.实施例5
83.fan增强isd诱导的i型干扰素信号通路的激活
84.病毒核酸类似物isd(3μg/ml)转染thp-1细胞5h后，换液加入不同浓度(2.5、5、 10μmol/l)的fan，继续孵育12h后收集细胞，qpcr检测ifnb1和干扰素诱导基因 (ifit1/ifit2/ifi44)的激活情况，图11示出。
85.如图11结果显示，isd有效上调i型干扰素信号通路相关基因表达，且fan(2.5、5、 10μmol/l)可剂量依赖性增强isd对于ifnb1和干扰素诱导基因(ifit1/ifit2/ifi44)表达的上调。此结果说明fan可剂量依赖性的增强isd诱导的i型干扰素通路的激活和干扰素诱导基因的表达。
86.实施例6
87.fan促进i型干扰素信号通路相关蛋白磷酸化增强抗病毒信号转导
88.为了进一步探究汉防己乙素对i型干扰素信号通路的调控作用，在thp-1细胞(人急性单核细胞白血病细胞)中，加入不同浓度(2.5、5、10μmol/l)的fan共同孵育12h 或10μmol/l fan孵育thp-1(0、3、6、9、12、24h)，western blot检测i型干扰素信号通路关键激酶tbk1和关键转录因子stat1的磷酸化水平。二者的磷酸化表明i型干扰素信号通路的激活，最终诱导ⅰ型干扰素及干扰素诱导基因isg的表达，进而发挥抗病毒作用。
89.如图12结果所示，fan促进i型干扰素信号通路相关蛋白tbk1、stat1磷酸化，且在10μmol/l浓度下磷酸化水平最高。
90.如图13结果所示，在fan使用浓度为10μmol/l的条件下，随着药物孵育时间延长， fan对tbk1和stat1的磷酸化呈现时间依赖性增强且在12h磷酸化水平最高。
91.实施例7
92.fan增强氯喹的抗病毒功能
93.早年，氯喹就已用于抗hiv的临床研究，2003年又发现氯喹可以抑制sars，此外，有研究表明氯喹对流感病毒、登革热病毒、埃博拉病毒、人类免疫缺陷病毒及新型冠状病毒等有一定的抑制作用。
94.vsv-egfp(moi＝0.05)与不同浓度氯喹或不同浓度氯喹联合fan共同处理a549细胞12h，氯喹使用浓度(10-4
、10-3
、10-2
、10-1
、10 0
、10 1
μmol/l)，fan使用浓度：(5μmol/l)，流式细胞术检测gfp阳性细胞比率变化。
95.图14示出了fan增强氯喹(chloroquine)的抗病毒功能。
96.如图14结果所示，氯喹在浓度大于1μmol/l时开始抑制vsv复制，在10μmol/l时较
为显著抑制vsv扩增；当fan与氯喹联合给药时，10-4
μmol/l的氯喹可显著抑制vsv 复制。此结果表明fan可以显著增强氯喹的抗病毒功能。
97.综上所述，本发明的研究证明汉防己乙素具有抑制多种病毒复制的功能。本发明采用了流式细胞术、western blot和qpcr等技术，以病毒复制情况为指标，来指征汉防己乙素对病毒的抑制功能。
98.本发明是对于广谱抗病毒中药单体的补充，选用emcv、hsv-1、h1n1和vsv病毒，来验证汉防己乙素其抗病毒活性，实验结果表明汉防己乙素具有抗多种病毒的功能。这也提高了本发明应用的广泛性，为病毒感染性疾病的预防和治疗提供了一个潜在的新广谱抗病毒药物。
99.汉防己乙素对于宿主的抗病毒免疫的增强。采用western blot和qpcr等技术，验证 fan可以有效激活a549细胞和mef细胞中i型干扰素及干扰素诱导基因的表达。i型干扰素是参与抗病毒免疫的重要效应分子。它的产生主要由先天免疫细胞(主要是巨噬细胞) 表面或内部受体接触到病毒特异性的抗原物质(dna，rna)，然后通过胞内的信号分子传递，激活激酶tbk1及其下游转录因子irf3/7从而启动i型干扰素基因的表达。分泌到细胞外的i型干扰素通过jak-stat通路促进下游isgs(ifn stimulated genes)的表达，进而靶向病毒的复制周期，包括入侵、脱壳、复制、装配以及释放阶段，或者调节宿主的免疫应答水平，从而达到抑制病毒复制的能力。汉防己乙素通过增强宿主基于i型干扰素信号通路的抗病毒免疫应答发挥广谱抗病毒的活性与用途，尚未见公开文献报道。
100.这里说明的模块数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的广谱抗病毒中药单体汉防己乙素及其应用的修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
101.尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。