广谱抗病毒中药单体小檗胺及其应用

1.本发明涉及中药单体广谱抗病毒药物技术领域，涉及广谱抗病毒中药单体小檗胺及其应用。


背景技术：

2.病毒感染是指病毒通过多种途径侵入机体，并在易感的宿主细胞中增殖的过程。病毒感染性疾病具有高传播力和致病性强的特点，目前大多数病毒感染性疾病均无特效药物治疗，特异性疫苗和抗病毒药物仍是临床治疗病毒感染的最有效的工具。然而随着气候变化和全球化为病毒传播创造了更有利的条件，新发病毒的暴发可能更为频繁。因此，研制有效的抗病毒药物，尤其是可以治疗不同病毒引发疾病的广谱抗病毒药物，来对抗未来可能暴发的新发和变异病毒感染具有重大科学意义和应用前景。
3.目前已经研发出来的广谱抗病毒药物可分为：1.靶向病毒本身干预病毒感染活力；2.靶向病毒复制所必需的宿主因子来调节宿主细胞防御系统抗病毒。以板蓝根为代表的中药在预防和治疗病毒感染性疾病中占有重要地位，凸显了中医药防治病毒感染性疾病的显著优势。因此，利用现代科学研究方法和技术从传统中医药中发现新的广谱抗病毒药物必将是未来抗病毒研究的一大趋势，具有切实的可行性。


技术实现要素：

4.本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
5.本发明还有一个目的是提供一种广谱抗病毒中药单体。
6.本发明另有一个目的是提供广谱抗病毒药物组合物。
7.本发明再有一个目的是提供所述的广谱抗病毒中药单体或所述的广谱抗病毒药物组合物在作为病毒感染抑制剂和/或在制备预防和治疗病毒感染性疾病药物中的应用。
8.为此，本发明提供的技术方案为：
9.一种广谱抗病毒中药单体，其为小檗胺(berbamine，bbm)。
10.广谱抗病毒药物组合物，其包含小檗胺或一种或多种其药学上可接受的盐和其在药学上可接受的载体或稀释剂。
11.优选的是，所述的广谱抗病毒药物组合物中，包含小檗胺和氯喹。
12.所述的广谱抗病毒中药单体或所述的广谱抗病毒药物组合物在作为病毒感染抑制剂和/或在制备预防和治疗病毒感染性疾病药物中的应用。
13.优选的是，所述的应用中，所述病毒包括水疱性口炎病毒、甲型流感病毒、脑心肌炎病毒和i型单纯疱疹病毒。
14.优选的是，所述的应用中，所述的广谱抗病毒中药单体通过激活i型干扰素信号通路以产生抗病毒作用。
15.优选的是，所述的应用中，还包含：小檗胺具有增强已知抗病毒药物的抗病毒功能
的作用。
16.优选的是，所述的应用中，所述已知抗病毒药物为氯喹。
17.本发明至少取得了如下有益效果：
18.本发明在细胞水平证明小檗胺具有抑制多种病毒扩增的功能，并且可以有效的激活i型干扰素的表达。
19.本发明是对广谱抗病毒药物的补充。相较于已有广谱抗病毒药物，小檗胺通过提高宿主基于i型干扰素信号通路的抗病毒免疫应答水平来增强宿主抗病毒感染能力，发挥预防和治疗病毒感染疾病的功能。目前，基于增强宿主i型干扰素信号通路的广谱抗病毒药物并不多见。该发明的创新之处是发现了一个可以有效激活宿主i型干扰素及其下游干扰素诱导基因(interferon stimulated genes，isgs)表达的中药单体化合物。因此，本发明为多种病毒感染性疾病的预防和治疗提供了一种潜在的广谱抗病毒药物。本发明是对小檗胺临床应用的拓展。
20.本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
21.图1为本发明其中一个实施例中的bbm在细胞水平(肺癌人类肺泡基底上皮细胞a549和小鼠成纤维细胞l929)增殖-毒性检测图，其中，a为bbm对a549细胞的毒性，b为bbm对l929细胞的毒性。
22.图2为本发明其中一个实施例中的bbm在细胞水平抑制vsv-egfp病毒复制的检测结果图，其中，a为vsv-egfp病毒和bbm共孵育即病毒感染全程加药检测bbm对病毒的抑制作用流式细胞术检测结果，b为a的柱状统计图。
23.图3为本发明其中一个实施例中的bbm在细胞水平抑制vsv-egfp病毒复制的检测结果图，其中，a为bbm预处理时bbm对病毒的抑制作用流式细胞术检测结果，b为a图的柱状统计图。
24.图4为本发明其中一个实施例中的bbm在细胞水平抑制vsv-egfp病毒复制的检测结果图，其中，a为病毒进入后给药方式时bbm对病毒的抑制作用流式细胞术检测结果，b为a图的柱状统计图。
25.图5为本发明其中一个实施例中的蛋白水平上检测bbm抑制vsv病毒复制的western blot结果图，其中，a为bbm抑制a549细胞中vsv病毒的g蛋白表达情况；b为bbm抑制l929细胞中vsv病毒的g蛋白表达情况。
26.图6为本发明其中一个实施例中的bbm在a549细胞中抑制多种病毒的qpcr检测结果图，其中，a为bbm在a549细胞中抑制emcv病毒的功能检测；b为bbm在a549细胞中抑制h1n1病毒的功能检测；c为bbm在a549细胞中抑制hsv-1病毒的功能检测。
27.图7为本发明其中一个实施例中的bbm在l929细胞中抑制多种病毒复制的的qpcr检测结果图，其中，a为bbm在l929细胞中抑制emcv病毒的功能检测；b为bbm在l929细胞中抑制h1n1病毒的功能检测；c为bbm在l929细胞中抑制hsv-1病毒的功能检测。
28.图8为本发明其中一个实施例中的qpcr检测bbm激活小鼠原代胚胎成纤维细胞(mef)中i型干扰素信号通路的结果图。
29.图9为本发明其中一个实施例中的western blot检测bbm在人单核细胞白血病thp-1细胞中促进stat1和tbk1磷酸化水平情况结果图。
30.图10为本发明其中一个实施例中的qpcr检测bbm增强isd诱导的i型干扰素信号通路的激活结果图，其中，a为bbm在isd刺激下的thp-1细胞中增强ifnb1的mrna的表达情况；b、c、d分别为bbm在isd刺激下的thp-1细胞中增强干扰素诱导基因(ifit1/ifit2/ifi44)的表达情况。
31.图11为本发明其中一个实施例中的bbm增强已知抗病毒药物氯喹的抗病毒功能流式结果图。
具体实施方式
32.下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
33.应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
34.小檗胺(berbamine，bbm)，别名升白胺，是一种白色固体的化学品。分子式为c
37h40
n2o6，分子量为608.72，熔点225℃，是一种主要从三颗针、细叶小檗、黄柏等小檗属(berberis)植物中分离而来的双苄基异喹啉类天然产物，具有多种药理作用。在临床上常用于治疗心肌缺氧、心律失常、白细胞减少症等。近年来研究发现，小檗胺的药理作用非常广泛，在抗肿瘤、免疫调节和心血管等方面都表现出了良好的药理活性。目前盐酸小檗胺已在临床应用，适应症为改善放、化疗引起的白细胞减少症，或苯中毒、放射性物质及药物引起的白细胞减少症等。
35.小檗胺的药理功效除上述诸多方面外，是否具有抑制病毒复制的作用？深入阐明小檗胺的抗病毒作用及其广谱性是拓展小檗胺药用价值的重点，亦是研发广谱抗病毒药物的难点。
36.本发明提供一种广谱抗病毒中药单体，其为小檗胺。小檗胺是从三颗针、细叶小檗、黄柏等小檗属植物中提取得到的一种双苄基异喹啉类生物碱。
37.本发明为多种病毒感染性疾病的预防和治疗提供了一种潜在的广谱抗病毒药物。本发明是对小檗胺临床应用的拓展。
38.本发明还提供广谱抗病毒药物组合物，其包含小檗胺或一种或多种其药学上可接受的盐和其在药学上可接受的载体或稀释剂。
39.在上述方案中，作为优选，所述的广谱抗病毒药物组合物包含小檗胺和氯喹。二者联合使用，抗病毒效果更佳。
40.本发明还提供所述的广谱抗病毒中药单体或所述的广谱抗病毒药物组合物在作为病毒感染抑制剂和/或在制备预防和治疗病毒感染性疾病药物中的应用。
41.在上述方案中，作为优选，所述病毒包括水疱性口炎病毒、甲型流感病毒、脑心肌炎病毒和i型单纯疱疹病毒。
42.在上述方案中，作为优选，所述的广谱抗病毒中药单体通过激活i型干扰素信号通路以产生抗病毒作用。i型干扰素在宿主抗病毒免疫应答中具有重要作用，其下游干扰素诱导基因可以在病毒的入侵、病毒核酸的复制、病毒蛋白的翻译和病毒粒子的释放等各个环
节抑制病毒复制或调控宿主免疫应答以增强宿主抗病毒能力。
43.在上述方案中，作为优选，还包含：小檗胺具有增强抗病毒药物的抗病毒功能的作用。
44.在上述方案中，作为优选，所述已知抗病毒药物为氯喹。
45.为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，现提供如下的实施例进行说明：
46.实施例1
47.bbm在细胞水平的增殖-毒性检测
48.将不同浓度(0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64μmol/l)的小檗胺加入培养于96孔板的肺癌人类肺泡基底上皮细胞a549或小鼠成纤维细胞l929中，每个浓度3个复孔，孵育12h或24h后，加入cck8试剂，37℃孵育30min后，酶标仪检测450nm吸光度。实验独立重复3次，实验组与对照组之间具有统计学差异，结果采用平均值
±
标准误表示，***，p＜0.001。
49.如图1结果所示，小檗胺在a549细胞中孵育12h的ic
50
为72.95μmol/l，24h的ic
50
为39.57μmol/l；在l929细胞中孵育12h的ic
50
为43.02μmol/l，24h的ic
50
为33.99μmol/l。
50.实施例2
51.bbm在细胞水平抑制vsv病毒复制
52.为了确定bbm不同给药方式对病毒复制的影响，发明人采用病毒感染过程全程给药、预处理给药和病毒进入后给药三种方式，通过流式细胞术检测gfp阳性细胞的百分率，并用柱形图分别统计不同处理条件下gfp阳性细胞的百分比。gfp阳性细胞的百分比代表vsv病毒的复制情况，gfp阳性比率越高，表明vsv复制越强。具体加药方式如下:
53.全程药物处理：将带有gfp标签的水疱性口炎病毒vsv病毒(vsv-egfp)(moi＝0.05)和不同浓度(2.5、5、10μmol/l)的小檗胺同时加入培养于24孔板的a549细胞(细胞量1.5
×
105/孔)中，共孵育12h后，收集细胞进行流式细胞术检测含有gfp阳性细胞的百分率。实验独立重复3次，实验组与对照组之间具有统计学差异，结果采用平均值
±
标准误表示，***，p＜0.001。
54.图2、图3、图4示出bbm在细胞水平抑制vsv-egfp病毒复制的结果。
55.如图2结果显示，小檗胺处理a549细胞，可剂量依赖性(2.5、5、10μmol/l)降低gfp阳性细胞百分率，柱形图统计了gfp阳性细胞的百分比，***p《0.001(差异极显著)。gfp阳性比例越高，表明vsv病毒复制越强。加入小檗胺后，gfp阳性率下降，证明bbm在全程给药时可抑制vsv病毒复制。
56.药物预处理实验：将不同浓度(2.5、5、10μmol/l)小檗胺加入培养于24孔板的a549细胞(细胞量1.5
×
105/孔)中，孵育12h后更换新鲜培养基并加入vsv-egfp病毒(moi＝0.05)继续孵育12h，收集细胞进行流式细胞术检测含有gfp阳性细胞的百分率。实验独立重复3次，实验组与对照组之间具有统计学差异，结果采用平均值
±
标准误表示，***，p＜0.001。
57.如图3结果显示，小檗胺预处理a549细胞，可剂量依赖性(2.5、5、10μmol/l)降低gfp阳性细胞百分率，柱形图统计了gfp阳性细胞的百分比。gfp阳性比例越高，表明vsv病毒复制越强，加入小檗胺后，gfp阳性率下降，证明bbm预处理可抑制vsv病毒复制。
58.病毒进入后加药：vsv-egfp病毒(moi＝0.1)感染a549细胞，4℃吸附2h，换液并加入含有不同浓度(2.5、5、10μmol/l)小檗胺的完全培养基，继续孵育12h，收集细胞进行流式细胞术检测含有gfp阳性细胞的百分率。实验独立重复3次，实验组与对照组之间具有统计学差异，结果采用平均值
±
标准误表示，***，p＜0.001。
59.如图4结果显示，小檗胺在病毒进入细胞后处理a549细胞，可剂量依赖性(2.5、5、10μmol/l)降低gfp阳性细胞百分率，柱形图统计了gfp阳性细胞的百分比。gfp阳性比例越高，表明vsv病毒复制越强，病毒进入细胞后加入小檗胺，gfp阳性率下降，证明bbm可在病毒进入细胞后抑制vsv病毒在细胞内的复制。
60.以上结果表明，小檗胺能在多种加药方式下显著抑制vsv病毒感染。
61.实施例3
62.蛋白质水平检测bbm抑制vsv病毒复制情况
63.通过western blot检测vsv病毒g蛋白的变化，具体条件如下：
64.不同浓度的bbm(2.5、5、10μmol/l)处理a549细胞或l929细胞，同时感染野生型vsv病毒(moi＝0.1)，16h后收集细胞，提取蛋白后进行western blot检测vsv病毒g蛋白的表达情况。
65.如图5中western blot结果显示，随着bbm浓度的增加，vsv病毒g蛋白的表达逐渐减弱甚至完全消失。这些结果表明，小檗胺可在蛋白水平有效抑制vsv病毒复制。
66.实施例4
67.bbm在细胞水平抑制多种病毒复制
68.为了探究bbm抗病毒的广谱性，发明人使用rna病毒emcv(脑心肌炎病毒)、h1n1(甲型流感病毒)和dna病毒hsv-1(i型单纯疱疹病毒)感染a549细胞或l929细胞，检测bbm对病毒复制的影响。具体如下：不同浓度(1.25、2.5、5、10μmol/l)的小檗胺处理a549细胞或l929细胞，同时加入emcv病毒(moi＝3，感染8h)/h1n1病毒(moi＝0.05，感染12h)/hsv-1病毒(moi＝1，感染12h)，孵育相应时间后，收细胞提取rna，qpcr检测细胞中病毒载量变化。实验独立重复3次，实验组与对照组之间具有统计学差异，结果采用平均值
±
标准误表示，***，p＜0.001。
69.图6、图7示出bbm在不同细胞中抑制多种病毒(包括emcv病毒、h1n1病毒和hsv-1病毒的)的qpcr检测结果。如图6和图7结果发现，对照组中多种病毒扩增明显，而加入小檗胺的实验组以剂量依赖的方式显著抑制病毒基因表达，其中10μmol/l时抑制最为显著。病毒感染宿主后会释放病毒基因组，而后利用宿主细胞资源进行子代病毒扩增。病毒基因表达强弱可反映病毒在宿主扩增情况，小檗胺处理细胞后，病毒基因表达受抑制，说明bbm可有效抵抗上述多种病毒感染，具有潜在的广谱抗病毒功能。
70.实施例5
71.小檗胺激活i型干扰素通路
72.抗病毒天然免疫是抵御病原体入侵的第一道防线，i型干扰素信号通路的激活在抗病毒免疫应答中具有重要作用。为了探究bbm对i型干扰素信号通路是否有调控作用，用10μmol/l的bbm处理小鼠原代胚胎成纤维细胞mef，孵育12h后收集细胞，提取rna后进行qpcr检测ifnb1和干扰素诱导基因(ifit1/ifit2/ifi44)的表达情况。实验独立重复3次，实验组与对照组之间具有统计学差异，结果采用平均值
±
标准误表示，***，p＜0.001。
73.如图8中qpcr结果显示，单独加bbm处理细胞显著诱导ifnb1表达，与此同时，干扰素诱导基因(ifit1/ifit2/ifi44)也上调表达。这些结果表明，小檗胺可有效激活i型干扰素信号通路，诱导抗病毒免疫相关基因表达。
74.为了进一步探究bbm对i型干扰素信号通路的调控作用，发明人用10μmol/l的小檗胺处理thp-1细胞，孵育不同时间(0、3、6、9、12、24h)，收集细胞提取蛋白后进行western blot检测i型干扰素信号通路中重要激酶tbk1和转录因子stat1的磷酸化水平。
75.如图9中western blot结果显示，随着bbm浓度的增加，tbk1和stat1的磷酸化水平增强。这些结果表明，小檗胺可有效激活i型干扰素信号通路，诱导抗病毒免疫相关基因表达。
76.实施例6
77.bbm增强isd诱导的i型干扰素的激活
78.用dna病毒核酸类似物isd(3μg/ml)刺激thp-1细胞，转染5h后换液，同时加入不同浓度bbm(5、10μmol/l)继续孵育12h后收细胞提取rna进行qpcr检测ifnb1和干扰素诱导基因(ifit1/ifit2/ifi44)表达情况。实验独立重复3次，实验组与对照组之间具有统计学差异，结果采用平均值
±
标准误表示，***，p＜0.001。
79.如图10结果显示，isd有效激活i型干扰素信号通路，而bbm可剂量依赖性增强isd诱导的ifnb1及干扰素诱导基因的表达。此结果表明bbm可剂量依赖性的增强i型干扰素信号通路的激活。
80.实施例7
81.bbm增强氯喹的抗病毒功能
82.氯喹(chloroquine)作为治疗疟疾的首选药物，研究证明其具有广谱抗病毒活性，对流感病毒、登革热病毒、埃博拉病毒、人类免疫缺陷病毒及新型冠状病毒等有一定的抑制作用。为了探究bbm对氯喹抗病毒功能的影响，用vsv-egfp感染a549细胞后，加入不同浓度的氯喹(10-4
、10-3
、10-2
、10-1
、100、101μmol/l)或不同浓度氯喹(10-4
、10-3
、10-2
、10-1
、100、101μmol/l)与bbm(10μmol/l)的混合物，流式细胞术检测gfp阳性细胞比率变化。实验独立重复3次，实验组与对照组之间具有统计学差异，结果采用平均值
±
标准误表示，***，p＜0.001。
83.如图11结果所示，氯喹在大于1μmol/l时开始抑制vsv复制扩增，在10μmol/l时较为显著抑制vsv复制扩增；当bbm与氯喹联合给药时，10-4
μmol/l的氯喹即可显著抑制vsv复制扩增。此结果表明bbm可以显著增强氯喹的抗病毒功能。
84.本发明中，发明人在细胞水平检测小檗胺对多种病毒复制的抑制作用及对i型干扰素ifnb1及isgs的诱导功能。
85.1.细胞水平检测小檗胺的抗病毒功能：发明人选用抗病毒免疫应答常用细胞株肺癌人类肺泡基底上皮细胞a549、人单核细胞白血病thp-1、小鼠成纤维细胞l929和小鼠原代胚胎成纤维细胞mef开展药理药效研究。实验用多种病毒包括rna病毒vsv(水疱性口炎病毒)、h1n1(甲型流感病毒)、emcv(脑心肌炎病毒)和dna 病毒hsv-1(i型单纯疱疹病毒)感染细胞，小檗胺的加入可显著地抑制上述多种病毒在细胞中的扩增。
86.2、小檗胺诱导i型干扰素及干扰素诱导基因(isgs)表达：细胞水平给药小檗胺，qpcr检测ifnb1、ifit1、ifit2、ifi44，与对照组相比，仅加药就能显著上调i型干扰素及干扰素诱导基因表达。此外，病毒核酸类似物isd刺激细胞后，有效诱导i型干扰素及isgs的表
达，小檗胺处理可进一步增强i型干扰素及isgs表达。
87.3、小檗胺与已知抗病毒药物氯喹联用，可显著增强该药物的抗病毒功能。
88.本发明的研究证明小檗胺具有抑制多种病毒扩增的功能，并且可以有效的激活i型干扰素及干扰素诱导基因的表达。i型干扰素在宿主抗病毒免疫应答中具有重要作用，其下游干扰素诱导基因可以在病毒的入侵、病毒核酸的复制、病毒蛋白的翻译和病毒粒子的释放等各个环节抑制病毒复制或调控宿主免疫应答以增强宿主抗病毒能力。
89.本发明是对广谱抗病毒药物的补充。相较于已有广谱抗病毒药物，小檗胺通过提高宿主基于i型干扰素的抗病毒免疫应答水平来增强宿主抵抗力，达到预防和治疗病毒感染性疾病的目的。目前，国内基于增强i型干扰素表达发挥广谱抗病毒功能的药物不多，该发明的创新之处即是发现了一个可以有效激活宿主i型干扰素及干扰素诱导基因(isgs)表达的中药单体化合物。因此，本发明为病毒感染性疾病的预防和治疗提供了一个潜在的新广谱抗病毒药物。小檗胺通过增强宿主基于i型干扰素通路的抗病毒免疫应答发挥广谱抗病毒功能的活性与用途，尚未见公开文献报道。
90.这里说明的模块数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的广谱抗病毒中药单体小檗胺及其应用的修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
91.尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。