基于炎性管理策略的自递送纳米系统、制备方法与应用

1.本发明涉及抗肿瘤转移治疗的技术领域，具体涉及基于炎性管理策略的自递送纳米系统、制备方法与应用。


背景技术：

2.肿瘤转移是每个癌症患者的“噩梦”，已经成为导致癌症相关死亡的重要因素。由于转移过程的不确定性和隐蔽性，肿瘤转移也是癌症难以治愈且容易复发的根本原因之一。到目前为止，手术治疗、放疗和其他医学治疗如化学/靶向/免疫治疗等，是临床肿瘤治疗的主要方法。然而，无论采用何种治疗方法，肿瘤组织的破坏都不可避免地导致肿瘤微环境的改变，从而增加肿瘤侵袭和转移的风险。例如，有研究表明放疗可以提高肿瘤组织上皮间质转化程序，并加剧肿瘤细胞的扩散。尽管已经做出了相当大的努力，但不幸的是，目前临床上还没有找到有效的方法来限制肿瘤转移。
3.一般来说，肿瘤治疗不仅追求杀死尽可能多的肿瘤细胞，而且还希望抑制残存肿瘤细胞可能发生的侵袭和转移。然而非常遗憾的是，当前由纳米技术介导肿瘤治疗手段，通常会在肿瘤区域引发强烈的炎症反应，从而促进随后的侵袭和转移。
4.失调的炎症与肿瘤的发生发展密切相关，如促进血管生成和肿瘤转移。从原发肿瘤部位逃逸时，离散的肿瘤细胞(“种子”)引起炎症反应并突破细胞外基质屏障。此外，肿瘤种子传递的炎症信号可帮助其自身逃避免疫监视，从而形成转移性肿瘤。因此，炎性管理对预防肿瘤侵袭转移具有重要意义。临床研究表明，许多抗炎药(如非甾体抗炎药、cox－2抑制剂和皮质类固醇等)是肿瘤治疗的有效佐剂，尤其在抗转移治疗方面。这些药物通常针对肿瘤的炎性微环境或抑制炎症相关信号通路如核因子κb(nf－κb)等来发挥抗转移作用。然而，肿瘤治疗是建立在杀伤肿瘤细胞或摧毁肿瘤组织的基础上的，但抗炎药并不具备显著的抗肿瘤能力。尽管开发具有潜在细胞杀伤能力的抗炎药对肿瘤治疗具有重要的临床意义，但由于抗炎和细胞损伤之间存在的矛盾生理机制，导致很少有研究者关注这一方面。为了探索抗炎和抗肿瘤治疗的有效协同迫切需要开发新型的纳米药物递送系统来增强药物的杀伤能力，并通过合理的调控炎性微环境，以降低每次治疗后转移发生的风险。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，本发明旨在提供基于炎性管理策略的自递送纳米系统、制备方法与应用，本发明利用sas和ce6两种药物，通过超分子相互作用自组装形成一种新型的纳米制剂，显著地改善了药物分子的生物相容性和可用性。本发明与游离药物相比，受益于两种药物的联合构建的系统，使得scnps纳米颗粒在低剂量水平上可实现按需的光促肿瘤细胞铁死亡和肿瘤微环境的炎性管理。
6.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.基于炎性管理策略的自递送纳米系统，所述系统为柳氮磺吡啶(sas)与光敏剂二氢卟吩e6(ce6)联合组成的无载体药物递送系统的纳米颗粒scnps，其中，scnps纳米颗粒在
低剂量水平上可实现按需的光控肿瘤细胞的铁死亡和肿瘤微环境的炎性管理。
8.需要说明的是，当scnps纳米颗粒被肿瘤细胞内化后，sas介导胞内谷胱甘肽下调与ce6光诱导活性氧累积的协同结合，诱发肿瘤细胞铁死亡；当光照结束后，sas通过抑制炎症相关的nf－κb通路，调节肿瘤的炎性微环境，抑制残存肿瘤细胞的侵袭和转移。
9.本发明进一步提供一种基于炎性管理策略的自递送纳米系统的制备方法，所述方法包括：将sas和ce6分别溶解在二甲基亚砜(dmso)中，浓度为10mg/ml。随后，将150μl sas溶液与50μl ce6溶液均匀混合并剧烈搅拌1h；在剧烈搅拌下，将混合液逐滴加入到4ml去离子水中，再在暗处持续搅拌搅6h。搅拌结束后，将得到的溶液经透析袋透析纯化后去除去游离的sas和ce6；再使用超滤管离心浓缩得到的溶液，最后收集得到scnps纳米颗粒。
10.本发明还提供一种基于炎性管理策略的自递送纳米系统的应用，所述scnps纳米颗粒用于抗肿瘤转移治疗领域。
11.本发明的有益效果在于：
12.在肿瘤治疗中，杀伤肿瘤组织、破坏肿瘤微环境稳态会增加转移的风险，这往往被研究人员所忽视。为了降低肿瘤破坏后转移的可能性，本发明合理选择的两种药物，即抗炎药sas和光敏剂ce6，通过简单的自组装方法构建成无载体的药物递送系统－scnps纳米颗粒，以整合不同药物的功能。其中，gsh的消耗与光诱导ros的积累相结合，赋予了scnps纳米壳体强大的诱导肿瘤细胞铁死亡的能力，从而显著提高了对肿瘤的杀伤效果。而更重要的是，治疗后存活肿瘤组织的转移行为得到了很好的抑制，因为释放的sas通过抑制炎症相关的信号通路，有效地管理了肿瘤的炎性微环境。本发明巧妙地通过纳米制剂在抗肿瘤治疗和抗炎治疗之间搭建了一座桥梁，为无载体的药物递送系统提供了一个新的范例。
附图说明
13.图1为本发明实施例中不同处理后4t1异位移植瘤小鼠在14天内的体重变化图；
14.图2为本发明实施例中不同处理后小鼠主要器官(心、肝、脾、肺、肾)的组织学评估示意图；
15.图3为本发明实施例中)静脉注射ce6或sc nps后，不同时间点的4t1荷瘤小鼠体内荧光成像；
16.图4为本发明实施例中注射24小时后小鼠的离体主要脏器和肿瘤荧光图像(he、li、sp、lu、ki和tu分别代表心、肝、脾、肺、肾和肿瘤)；
17.图5为本发明实施例中主要脏器和肿瘤中平均荧光强度的定量分析示意图；
18.图6为本发明实施例中治疗14天后各处理组的肿瘤照片示意图；
19.图7为本发明实施例中治疗14天后各处理组的平均肿瘤重量示意图；
20.图8为本发明实施例中治疗14天内各组荷瘤小鼠的相对肿瘤体积曲线示意图；
21.图9为本发明实施例中治疗后各组肿瘤组织的h&e染色示意图；
22.图10为本发明实施例中治疗后24小时，各组肿瘤组织的il－1β，il－6和tnf－α含量示意图；
23.图11为本发明实施例中不同处理组肿瘤组织内gpx4，nf－κb p65和vegf的免疫组化分析示意图；
24.图12为本发明实施例中不同时间点各组小鼠肺转移的体内生物发光图像；
25.图13为本发明实施例中治疗结束后各组小鼠肺组织的体外生物发光图像；
26.图14为本发明实施例中治疗结束后各组小鼠肺组织照片，白色箭头指向的是宏观的转移结节；；
27.图15为本发明实施例中各组小鼠肺组织中宏观转移结节数量的统计图；
28.图16为本发明实施例中各组小鼠肺组织切片的h&e染色示意图。
具体实施方式
29.以下将对本发明作进一步的描述，需要说明的是，以下实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于本实施例。
30.本发明为基于炎性管理策略的自递送纳米系统，所述系统为柳氮磺吡啶(sas)与光敏剂二氢卟吩e6(ce6)联合组成的无载体药物递送系统的纳米颗粒scnps，其中，scnps纳米颗粒在低剂量水平上可实现按需的光控肿瘤细胞的铁死亡和肿瘤微环境的炎性管理。
31.进一步的，当本发明的scnps纳米颗粒被肿瘤细胞内化后，sas介导胞内谷胱甘肽下调与ce6光诱导活性氧累积的协同结合，诱发肿瘤细胞铁死亡；当光照结束后，sas通过抑制炎症相关的nf－κb通路，调节肿瘤的炎性微环境，抑制残存肿瘤细胞的侵袭和转移。
32.本发明进一步提供一种基于炎性管理策略的自递送纳米系统的制备方法，所述方法包括：将sas和ce6分别溶解在二甲基亚砜(dmso)中，浓度为10mg/ml。随后，将150μl sas溶液与50μl ce6溶液均匀混合并剧烈搅拌1h；在剧烈搅拌下，将混合液逐滴加入到4ml去离子水中，再在暗处持续搅拌搅6h。搅拌结束后，将得到的溶液经透析袋透析纯化后去除去游离的sas和ce6；再使用超滤管离心浓缩得到的溶液，最后收集得到scnps纳米颗粒。
33.本发明还提供一种基于炎性管理策略的自递送纳米系统的应用，所述scnps纳米颗粒用于抗肿瘤转移治疗领域。
34.实施例1
35.1、制备本发明的scnps纳米颗粒
36.将sas和ce6分别溶解在二甲基亚砜(dmso)中，浓度为10mg/ml。随后，将150μl sas溶液与50μl ce6溶液均匀混合并剧烈搅拌1h；在剧烈搅拌下，将混合液逐滴加入到4ml去离子水中，再在暗处持续搅拌搅6h。搅拌结束后，将得到的溶液经透析袋透(选取分子量为3000da)析纯化后去除去游离的sas和ce6；再使用超滤管(选择分子量为10kda)离心浓缩得到的溶液，最后收集得到scnps纳米颗粒。
37.2、scnps纳米颗粒在体内生物安全性评估及体内生物分布
38.使用雌性balb/c小鼠的4t1皮下移植瘤模型来进一步评估scnps纳米颗粒体内的抗肿瘤能力。4t1荷瘤小鼠被均分为八个治疗组，即pbs、ce6、sas、sas ce6、scnps、ce6 light、sas ce6 light和scnps light组。首先，我们在小鼠模型中初步评估了scnps的生物相容性。如图1所示，在治疗期间，治疗处理的小鼠体重没有显示出明显的变化。与此同时，治疗结束后，各实验组小鼠主要器官(心、肝、脾、肺、肾)的h&e切片与对照组的切片相比，基本没有差别(如图2所示)。此外，各实验组小鼠的血生化指标和血常规参数与对照组的结果相比也没有明显差异。这些结果表明，本发明的scnps纳米颗粒具有良好的生物相容性。
39.随后，我们通过小动物活体成像系统(in vivo imaging system，ivis)评估了scnps在4t1荷瘤小鼠中的肿瘤富集和组织分布行为。如图3所示，静脉注射scnps后，肿瘤部
位的荧光信号随着时间的推移逐渐增强，并在4小时达到最高水平，这表明scnps在肿瘤部位的有效积累。24小时后，对分离的主要器官和肿瘤进行体外荧光成像。正如预期的那样，与游离ce6相比，scnps表现出更优异的肿瘤富集能力(图4)。荧光定量分析进一步表明，除了包括肝脏在内的网状内皮系统外，与游离ce6相比，scnps可通过epr效应被动靶向到肿瘤部位，实现有效的富集(图5)。这些结果表明，本发明的scnps纳米颗粒具有优异的被动靶向能力。
40.3、scnps体内抗肿瘤效果评估
41.基于scnps在肿瘤部位的有效生物分布，我们进一步研究了其抗肿瘤作用。由实验结果可知，与非光照组相比，光照组的肿瘤大小(图6)、肿瘤重量(图7)及相对肿瘤体积(图8)明显减小，尤其是scnps light组。同时，各组肿瘤组织切片的苏木精和伊红(h&e)染色也显示，scnps light处理组的肿瘤部位明显观察到更大规模的组织损伤(图9)。由此表明，scnps纳米颗粒可以在光照下有效地抑制肿瘤的生长。
42.此外，在治疗24小时后，通过elisa检测试剂盒检测各组肿瘤组织中促炎细胞因子(il－1β、il－6和tnf－α)的水平。如图10所示，scnps纳米颗粒可显著降低肿瘤部位的促炎细胞因子水平。为了深入探究scnps纳米颗粒在体内的抗肿瘤机制，在体内的抗肿瘤机制，我们采用免疫组化(immunohistochemistry，ihc)染色对各组)染色对各组小鼠的肿瘤组织进行切片分析。从图11可以看出，与其他治疗处理组相比，scnps light处理的肿瘤组织内gpx4的表达显著降低。与此同时，通过ihc染色，我们还对nf－κb p65和vegf两种转移相关蛋白进行了检测。正如预期的那样，scnps处理组中nf－κb p65的核易位和vegf的表达明显少于其他处理组(图11)，这也与细胞层面的结果相符。因此，本实验结果可表明，scnps不仅能在光照下有效抑制肿瘤的生长，还能通过抑制nf－κb通路的激活和下调炎性细胞因子水平，来调节光诱导铁死亡治疗后的炎性微环境。
43.4、scnps体内抗转移效果评估
44.基于scnps纳米颗粒对乳腺癌细胞迁移和侵袭能力的抑制作用，我们通过尾静脉向雌性的balb/c小鼠体内注射4t1－luc细胞，来建立实验性的乳腺癌肺转移模型，以评价活体内scnps纳米颗粒对乳腺癌转移能力的影响。尾静脉接种后，利用小动物活体成像系统监测治疗期间各组小鼠的肺转移情况。如图12所示，虽然各治疗组肺脏部位的生物发光信号随时间的推移逐渐增强，但在治疗后的第12天，scnps light治疗组的肺部生物发光信号明显低于体内其他治疗组，这是与离体肺组织的体外荧光成像结果一致的(图13)。接下来，我们通过分析小鼠的肺转移结节数目来评估不同治疗组的肺转移情况。由各组肺组织照片(图14)及定量统计结果(图15)可知，scnps light组的肺部上仅观察到极少量的宏观转移结节，并且其转移结节的数目要明显少于其他组，这与各组肺组织的h&e染色结果一致(图16)。h&e染色结果更加直观地显示，scnps light治疗的肺组织切片上出现的转移性病灶要明显少于其他治疗组。这些结果表明，scnps纳米颗粒可通过降低肿瘤微环境的炎性水平，有效抑制治疗后乳腺癌的肺转移。
45.对于本领域的技术人员来说，可以根据以上的技术方案和构思，给出各种相应的改变和变形，而所有的这些改变和变形，都应该包括在本发明权利要求的保护范围之内。