血浆脑细胞来源外泌体中维生素D结合蛋白在诊断抑郁症中的应用

血浆脑细胞来源外泌体中维生素d结合蛋白在诊断抑郁症中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物科学领域，具体涉及血浆脑细胞来源外泌体中维生素d结合蛋白在诊断抑郁症中的应用。


背景技术：

2.抑郁症是最常见的重性精神疾病，高居人类疾病总负担第二位。但遗憾的是，至今尚无客观的诊断生物学标记物，诊断依然依赖临床表象。近年来，随着多组学高通量测定技术和生物信息学分析技术的迅猛发展，无论临床患者还是模式动物，基于多来源生物样本筛选候选分子如火如荼。遗憾的是，获得抑郁症患者活检或尸检脑组织极其困难，即使脑脊液获取也困难重重，并且近期研究分析进一步表明脑组织或脑脊液候选生物学标记物水平与外周血水平并不一致(pubmed pmid:31195092.)。因此提出，绝大多数采用外周血筛选的生物学标记物不能直接代表中枢。因此，从外周血中成功分离、提取、测定能代表中枢来源的候选分子迫在眉睫。


技术实现要素：

3.针对现有技术的不足，本发明提出了血浆脑细胞来源外泌体中维生素d结合蛋白在诊断抑郁症中的应用。
4.本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
5.一种用于诊断抑郁症的设备，包括：用于分离血浆脑细胞来源外泌体的装置与用于检测所述的血浆脑细胞来源外泌体的维生素d结合蛋白浓度/含量的试剂盒。
6.可选地，所述的脑细胞来源外泌体包括小胶质细胞来源外泌体、神经元细胞来源外泌体与星形胶质细胞来源外泌体。
7.可选地，所述的用于检测所述的血浆脑细胞来源外泌体的维生素d结合蛋白浓度/含量的试剂盒为elisa试剂盒。
8.可选地，其特征在于，所述的用于分离血浆脑细胞来源外泌体的装置为免疫沉淀试剂盒。
9.另一方面，本发明还提出了血浆脑细胞来源外泌体中维生素d结合蛋白作为标志物在制备抑郁症诊断试剂盒中的应用。
10.可选地，所述的试剂盒为elisa试剂盒。
11.可选地，所述的elisa试剂盒中提供的微孔板预先包被抗体。
12.可选地，所述的elisa试剂盒采用生物素偶联抗体作为检测抗体
13.本发明的有益效果：
14.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：首次在血浆中证实小胶质细胞来源外泌体中vdbp作为特异性诊断抑郁症的生物标志物的用途，为鉴别诊断抑郁症提供了一条全新的途径；小胶质细胞来源外泌体中vdbp水平与hamd24评分呈负相关；单独采用小胶质细
no.12321d)，然后去除上清液，重新悬浮在250ml隔离缓冲液中(pbs中0.1％bsa)。为了进行抗体标记，将5μg生物素标记的抗体与磁珠孵育，分别采用tmem119(cat.no.853302,biolegend,san diego,california,usa)(用于小胶质细胞来源外泌体)，l1cam/cd171-biotin(用于神经元来源的外泌体)(cat.no.13-1919-82,thermofisher scientific)和glast(cat.no.acsa-1-biotin,miltenyi biotec,auburn,california,usa)(用于星形细胞来源外泌体)三种外泌体特异性分子进行分离提取三种不同类型脑细胞来源外泌体，室温下连续混合1小时。将总外泌体(50μl)与抗体标记磁珠在4℃连续混合孵育过夜(24h)。然后磁化磁珠，去除上清液。用1ml洗涤缓冲液洗涤四次，最后用含1％bsa和ppi的200μl pbs重悬。最后，在新的ep管中加入100μl珠粒(带有脑细胞来源外泌体)，并在管中加入100μl洗脱缓冲液(0.1m glycine,ph 3.0)。将ep管在室温下混合5分钟。磁力架去除磁珠，得到的溶液就是我们想要收集的特定脑细胞亚群外泌体。然后将得到的溶液的ph调整为7.0(1m tris-hcl(ph＝8.6))。
25.(3)酶联免疫吸附试验(elisa)测定vdbp
26.使用磁珠分离出脑细胞来源的外泌体后，将ripa裂解液直接添加到磁珠中裂解外泌体。然后磁化并去除磁珠，收集外泌体裂解液。采用elisa方法进行vdbp定量，所用试剂盒详细信息如下：human dbp/vitamin d binding protein(vitamin d binding protein)elisa kit，eh2937，fine biotech co.,ltd，wuhan，china。该试剂盒的检测范围为3.906-250ng/ml。
27.试剂盒组件外所需器材和试剂：酶标仪(波长：450nm)，37℃恒温箱，自动洗板机，精密的单道和多道移液器以及干净的一次性枪头，干净的ep管，去离子水或蒸馏水
28.具体地说，elisa试剂盒基于双抗体夹心elisa检测法。试剂盒中提供的微孔板已预先包被抗体。采用生物素偶联抗体作为检测抗体。依次将标准品、待测样品和生物素偶联检测抗体加入孔中，用洗涤液洗去未结合的成分。加入hrp-链霉亲和素(sabc)，用洗涤液洗去未结合的偶联物。再将tmb底物溶液添加到每个孔中。通过添加硫酸溶液终止酶-底物反应，并通过分光光度法在450nm的波长处测量od值。将样品的od450值与标准曲线进行比对，确定样品中待测蛋白的浓度。
29.具体实验步骤：
30.稀释样品和试剂时，必须将它们完全均匀地混合。在将tmb加入孔中之前，请将tmb底物在37℃下平衡30分钟。每次测试都绘制标准曲线。
31.设定标准品孔、待测样品孔(用样品稀释液至少稀释一倍)、空白孔，并记录其位置。为减小实验误差，每个标准品和样品一式两份进行测量。加样前，可先用洗涤缓冲液洗板2次。
32.加样：向相应孔中加入100ul标准品或待测样品，覆膜，并在37℃下孵育90分钟。(将溶液添加到微孔板的底部，并尽可能避免接触管壁和吸打起泡沫。)
33.洗板:取下覆膜或盖板，并用洗涤缓冲液洗板2次。最后一次洗涤后，通过抽吸或倾倒除去所有的洗涤缓冲液。
34.加生物素标记抗体工作液:每孔加100ul生物素标记抗体工作液。盖上新的覆膜，37℃孵育60分钟。
35.洗板:取下覆膜或盖板，并用洗涤缓冲液洗板3次，每次浸泡1分钟。最后一次洗涤
后，通过抽吸或倾倒除去所有的洗涤缓冲液。
36.加hrp-链霉亲和素结合物(sabc):每孔加100ul sabc工作液。盖上新的覆膜，37℃孵育30分钟。
37.洗板:取下覆膜或盖板，用洗涤缓冲液洗涤板5次，每次浸泡1-2分钟。最后一次洗涤后，通过抽吸或倾倒除去所有的洗涤缓冲液。
38.加tmb底物溶液:每孔加入90ul tmb底物溶液，覆膜，在37℃下于暗箱中孵育10-20分钟(根据颜色的实际变化，反应时间可以缩短或延长，但不能超过30分钟。当标准孔中出现明显的蓝色梯度时，可以终止反应)。
39.加终止液:向每孔中添加50ul终止液。颜色将由蓝色立即变为黄色。添加终止液的操作与添加tmb底物溶液的操作相同。
40.od值的测量:加入终止溶液后，立即在酶标仪的450nm吸光处进行吸光度测定，读取od450数值。
41.至于计算，可以将标准曲线绘制为标准品溶液的每个梯度的od450值(y轴)与标准品溶液各自对应的浓度(x轴)的关系。通过计算机软件进行标准曲线的绘制，例如curve expert 1.3or 1.4。将样本的od值代入标准曲线，即可计算得到样品的目标浓度。
42.注:如果待测样品被稀释过，则标准曲线中计算得到的浓度需乘以稀释倍数，得到稀释前的浓度。
43.受试者的人口学和临床特征见表1，mdd和非精神疾病对照者的血浆中总外泌体vdbp蛋白浓度结果见图1，血浆总外泌体中vdbp的诊断与诊断效能分析见图2。
44.图1抑郁症患者中血浆小胶质细胞来源外泌体中vdbp显著下降，而神经元和星形胶质细胞来源外泌体中无差异性表达。
45.图2血浆小胶质细胞来源外泌体vdbp水平和hamd-24得分之间呈负相关。
46.图3血浆小胶质细胞来源外泌体vdbp水平roc曲线下面积为0.830，疾病诊断敏感性高达89.8％，特异性为65.8％。
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注：数据使用平均值(标准差)或例数(百分比％)表示；
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mdd:抑郁症；hc:非精神疾病健康人；
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标记“a”表示两独立样本t检验；
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标记“b”表示卡方检验。
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在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
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以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。