一种血清细胞外囊泡中上皮性卵巢癌肿瘤标志物的检测方法

技术特征：
1.一种血清细胞外囊泡中上皮性卵巢癌肿瘤标志物的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：选择一组健康对照者、一组卵巢囊腺瘤患者和一组上皮性卵巢癌患者；步骤二：对患者和健康对照者提取血清样品，从患者血清中分离提取细胞外囊泡后利用tem、nta、wb和生物信息学分析对其进行鉴定；步骤三：通过lc-ms/ms分析，鉴定出所有的可定量蛋白质，并筛选出组间的差异表达蛋白，并通过prm验证，roc分析得出可作为卵巢癌诊断标志物的蛋白标记物；步骤四：进行单因素和多因素logistic回归分析，对蛋白标记物建立诊断模型，回归方程为logitp＝2.481*fgg 8.970*muc16
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1.709*apoa4-0.184，并判断是否具有诊断效能。2.根据权利要求1所述的一种血清细胞外囊泡中上皮性卵巢癌肿瘤标志物的检测方法，其特征在于：所述卵巢肿瘤患者为进行过卵巢肿瘤手术且有术后病理结果的患者，所述卵巢肿瘤患者在血液采集前未接受其他治疗，所述卵巢肿瘤患者没有其他器官或部位肿瘤病变，所述卵巢肿瘤患者没有其他血液疾病、感染性疾病、内分泌疾病、免疫或代谢性疾病。3.根据权利要求2所述的一种血清细胞外囊泡中上皮性卵巢癌肿瘤标志物的检测方法，其特征在于：所述血清样品均于患者入院后在空腹状态下采集，首先采集血液样本于bdvacutainer血清管中，室温下，血液静置凝固1到2小时，然后4℃冰箱过夜使血块固缩，血清析出，随后将析出的血清4℃，3000g离心10分钟，离心后的上清转移至新的eppendorf离心管中，分装保存于-80℃冰箱。4.根据权利要求1所述的一种血清细胞外囊泡中上皮性卵巢癌肿瘤标志物的检测方法，其特征在于：所述细胞外囊泡提取时，血清样品从－80℃冰箱取出，冰上融化，在4℃，12000g离心10-15分钟，离心后将上清液转移至新的离心管，0.22μm微孔滤膜过滤后用细胞外囊泡提取试剂盒qevoriginalsizeexclusioncolumn去分离提取细胞外囊泡，具体步骤如下，首先将分离柱放置在支架上，使其垂直，盖好底部的luer-slipcap，然后取下盖子，打破真空密封，取下luer-slipcap，用至少10mlpbs洗脱缓冲液冲洗柱子，盖上luer-slipcap，用移液器移去顶部的缓冲液，用移液器向分离柱中加入500μl血清样品，取下luer-slipcap，开始收集分离过滤后的样本，最开始的3ml是空隙体积，继续向分离柱中添加pbs以洗脱囊泡，最后收集空隙体积后的0.5ml液体为高纯度细胞外囊泡。5.根据权利要求4所述的一种血清细胞外囊泡中上皮性卵巢癌肿瘤标志物的检测方法，其特征在于：所述nta分析中，细胞外囊泡用pbs重悬，使用nanosightns300对重悬液体中纳米颗粒的布朗运动进行实时动态跟踪，观察并获得相应的粒径分布及浓度信息，所述tem分析中，使用透射电子显微镜，首先用pbs重悬试剂盒提取的细胞外囊泡，吸取5-10μl重悬的待观察细胞外囊泡样本滴加于电镜的专用的铜网上，室温下放置进行沉淀1～2分钟，并用滤纸吸去浮液，先用pbs进行漂洗，然后吸取磷钨酸5-10μl滴加于铜网上，沉淀并进行负染色1-2分钟，用滤纸吸去浮液，常温下干燥2分钟，上机成像，电镜下观察并记录细胞外囊泡的形态特征。6.根据权利要求4所述的一种血清细胞外囊泡中上皮性卵巢癌肿瘤标志物的检测方法，其特征在于：所述wb分析中，首先提取细胞外囊泡蛋白质，细胞外囊泡提取后放置于－80℃冰箱保存，使用时从冰箱取出，冰上溶解，避免反复冻融，向细胞外囊泡溶液中加入已配制好的ripa蛋白裂解液，冰上裂解10-15分钟，使细胞外囊泡蛋白质裂解；
然后测定蛋白浓度，配制bca的工作液：按照50:1的比例将bca蛋白浓度检测试剂盒中的a液和b液混合后配制成bca工作液，室温放置备用，按照每个反应孔200μl工作液准备，取一个96孔板，根据实验需求设置好标准蛋白孔和待测样品孔，将bca工作液加入到96孔板中，每孔200μl，bca蛋白浓度测定试剂盒提供的标准的蛋白液浓度为2mg/ml，用ddh2o稀释试剂盒中的标准蛋白液，配制成梯度蛋白，浓度分别为2000μg/ml，1000μg/ml，500μg/ml，250μg/ml，125μg/ml，0μg/ml，待测蛋白样品用ddh2o稀释10倍，向每孔中加入20μl的梯度蛋白液和稀释后的待测蛋白样品，混匀，37℃避光孵育30分钟，测定562nm波长下的吸光度，用标准蛋白品的浓度和吸光度od562值绘制标准曲线，计算浓度公式，根据公式计算出待测蛋白样品的浓度；蛋白变性，将测好浓度的蛋白用ddh2o进行稀释，根据wb每孔50μg/20μl的上样量，计算所要加入的ddh2o和4
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蛋白上样缓冲液，进而配制wb的上样体系，然后将配制好的wb上样体系混匀后放入100℃金属浴，加热变性10分钟，取出后立即将蛋白样品置于冰上或者于-20℃冰箱冻存备用；sds-page凝胶电泳，选择玻璃板，流水冲洗，洗涤剂洗刷，洗净玻璃板表面的污渍和颗粒物，室温晾干或烤箱烘干，将玻璃板安装在制胶架上，据待测蛋白样品的分子量大小选择合适的浓度，中等分子量选择10％sds-page，小分子量选择12％sds-page，大分子量选择8％sds-page，分离胶配制完成后，混匀，加入玻璃板中至距离顶端2cm处，检查有无渗漏，若无渗漏加入异丙醇压平，室温静置30分钟，分离胶静置30分钟无漏胶且凝固后，弃去玻璃板间异丙醇，按配方配制浓缩胶，混匀后加在分离胶的上面，然后选择梳子，向浓缩胶内垂直插入，注意梳齿之间不能产生气泡，室温静置20分钟，待浓缩胶完全凝固后，制胶完成，取出备用，蛋白上样：将配制好的电泳胶放置于电泳槽中，预先配制好10x电泳缓冲液，电泳时用ddh2o稀释成1x电泳缓冲液，向槽中加入1x电泳缓冲液，在缓冲液中垂直向上拔去梳子，然后用加样枪按照一定顺序向各孔中加入蛋白样品和预染的蛋白marker，电泳：打开电源，先用80v电压恒压电泳30分钟，当蛋白marker到达分离胶且条带分离清可辨时，调整电压为120v继续恒压电泳直至目的蛋白电泳到合适位置，关闭电源，结束电泳；恒流湿转，材料准备：0.45μm的pvdf转印膜切成和蛋白胶块相当的大小，大小为6.5
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0.1cmx8
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0.1cm，同时裁剪相应大小的滤纸，pvdf膜浸泡于甲醇中激活，取10x转膜缓冲液100ml，加入200ml甲醇，700mlddh2o，混匀配制成1x转膜缓冲液，预冷备用，取出电泳后的玻璃板，撬开，沿着分离胶边界切去上层胶，取出分离胶，放在预先配制好的1x转膜缓冲液中，将转膜用的塑料夹打开，海绵垫和滤纸依次叠放在夹子上，黑色面夹子滤纸上放电泳胶，白色面夹子上放活化后的pvdf膜，按照三明治顺序叠放，随后赶走pvdf膜与分离胶之间的气泡，将夹紧后的塑料夹放到转膜槽中，槽内加入预冷的1x转膜缓冲液，同时放入冷冻的冰板，将转膜槽整体放入冰盒中并加满冰，接好电源，300ma恒流转膜，根据分子量大小选择合适的转膜时间，分子量蛋白质选择2小时，小分子量蛋白质可选择1小时；蛋白免疫印迹，封闭：转膜结束后，取出pvdf膜，标注好正反面及上样顺序，然后将pvdf膜放在5％bsa或5％脱脂牛奶的封闭液中，室温于摇床上低速封，一抗：封闭完成后，根据预染蛋白marker的位置将pvdf膜按照目的蛋白的大小剪出所需条带，将其放入稀释好的一抗中，4℃置摇床上孵育过夜，二抗：一抗孵育结束后，回收一抗，用tbst摇床上洗膜3遍，每次10分钟，将洗好的膜放入相对应的二抗，室温摇床上低速孵育2小时，曝光：二抗孵育结束
后，用tbst摇床上洗膜3遍，每次10分钟，将ecl发光试剂盒中的a液和b液按1:1配制成发光液，将发光液均匀滴加在膜上，放入凝胶成像仪中成像闭1小时。7.根据权利要求1所述的一种血清细胞外囊泡中上皮性卵巢癌肿瘤标志物的检测方法，其特征在于：所述生物信息学分析包括go分析、kegg分析、go功能富集分析、kegg通路富集分析、蛋白质互作网络分析、数据分析。8.根据权利要求1所述的一种血清细胞外囊泡中上皮性卵巢癌肿瘤标志物的检测方法，其特征在于：所述lc-ms/ms分析中，细胞外囊泡蛋白质提取：由qev细胞外囊泡提取试剂盒从血清中提取分离的细胞外囊泡中加入蛋白酶抑制剂以及1％浓度的聚乙二醇辛基苯基醚对其蛋白质进行裂解，裂解完后bca法检测蛋白浓度；蛋白质胰酶酶解：向裂解后的蛋白质溶液中加入dtt和iam，后室温下避光孵育15分钟，随后加入胰蛋白酶进行酶解；肽段标记及高效液相色谱分级：对胰蛋白酶酶解后的蛋白样品进行标记，将tmt试剂盒中的标记试剂与蛋白样品混合并进行孵育，并对肽段进行高效液相色谱分级；lc-ms/ms分析：将经上述步骤处理标记以后的肽段上机检测，进行液相色谱-质谱联用lc-ms.ms分析；质谱数据处理及分析：对质谱平台检测得到的质谱图进行处理，并将得到的实验数据在相应的数据库中maxquant进行检索及分析。9.根据权利要求7所述的一种血清细胞外囊泡中上皮性卵巢癌肿瘤标志物的检测方法，其特征在于：所述蛋白质互作网络分析用于对恶性组和健康组之间的deps与恶性组和良性组之间的deps的交叉重复部分进行了蛋白质互作网络分析。10.根据权利要求1所述的一种血清细胞外囊泡中上皮性卵巢癌肿瘤标志物的检测方法，其特征在于：所述prm的实验方法为蛋白提取及浓度检测，胰酶酶解：各待测样品蛋白取等量进行酶解，加入标准蛋白，用裂解液将体积调整至一致，再加入dtt和iam，室温避光孵育15分钟，将烷基化好的样本转移至超滤管，室温12000g离心20分钟，用8m尿素置换3次，再用置换缓冲液置换尿素3次，以1:50的比例加入胰蛋白酶，酶解过夜，室温12000g离心10分钟回收肽段，再用ddh2o回收肽段一次，合并两次肽段溶液；质谱分析：肽段溶液上机检测，数据采集模式使用数据非依赖型扫描程序，hcd碰撞池的碎裂能量设置为27，一级质谱自动增益控制设置为3e6，最大离子注入时间设置为50ms；二级质谱自动增益控制设置为1e5，最大离子注入时间设置为120ms，隔离窗口设置为1.6m/z，数据分析处理：根据实验目的设置肽段参数，分析处理数据。

技术总结
本发明公开了一种血清细胞外囊泡中上皮性卵巢癌肿瘤标志物的检测方法，1、包括以下步骤：步骤一：选择一组健康对照者、一组卵巢囊腺瘤患者和一组上皮性卵巢癌患者。本研究中关于卵巢癌血清细胞外囊泡的蛋白组学研究，提出了血清细胞外囊泡中的蛋白质分子FGA,FGB,FGG,FGL1,APOL1,APOA4,ITIH3,MUC16可作为卵巢癌诊断的分子标志物，并通过PRM进行了验证，此外，研究中基于血清细胞外囊泡蛋白组学结果建立的卵巢癌诊断模型在全部以及早期的卵巢癌病人中都表现出较好的诊断效能，可对临床上现有的卵巢癌诊断措施进行补充，提供一个新的卵巢癌诊断思路和策略，能够帮助实现卵巢癌的早期诊断，从而改善患者生存和预后。从而改善患者生存和预后。从而改善患者生存和预后。


技术研发人员：杨国奋 赖慧玲 何伟鹏 郭云云 孙婷婷 李媛媛 田黎明 吴琳祥 张祖威
受保护的技术使用者：中山大学附属第一医院
技术研发日：2022.07.27
技术公布日：2022/10/11