含有人参、甘草和玉竹等中药组合物的应用的制作方法

1.本发明属于中药组合物应用领域，具体涉及含有人参、甘草和玉竹等中药组合物的应用。


背景技术：

2.活性氧(reactive oxygen species，ros)水平和抗氧化防御机制通常在机体中存在一个动态平衡，该平衡对维持生理功能有着重要作用。当ros产生过多或消除ros的能力减弱，便会发生氧化应激(oxidative stress)，诱发多种疾病，常见的有心脏病、癌症、骨关节炎、风湿性关节炎、糖尿病以及由脑组织氧化损伤所致的认知功能障碍疾病如阿尔兹海默症、帕金森病等。机体为控制ros水平并防止其积累，形成了一套非常完善的抗氧化防御系统，这个系统就是nrf2调节系统。nrf2是该系统的枢纽分子，作为重要的氧化还原敏感性转录因子，通过调控诸多内源性的抗氧化分子参与维持细胞的氧化还原稳态。nrf2在机体发生氧化应激时被激活，其表达量增加。
3.通常机体多系统氧化损伤往往是可逆的，但对于中枢神经系统的损伤则难以逆转，目前也没有发现有效的治疗氧化损伤所致的认知功能障碍的药物及特异性手段。西医对于抗氧化的治疗，常用维生素，如维生素a、c和e，另外叶酸片、辅酶q10，硫辛酸、谷胱甘肽等药物也具有抗氧化作用，但很多情况下并没有获得预期治疗效果，而且长期大量服用会出现肌肉衰弱、疲劳、呕吐、腹泻甚至抗凝血的毒性作用。中药在许多复杂病症的治疗上显示了卓越的优势，如副作用较小、药效持久、患者依从性高，可以多靶点发挥作用等，明显改善患者临床症状和预后。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供含有人参、甘草和玉竹等中药组合物的应用。
5.本发明含有人参、甘草和玉竹等中药组合物是药食同源的中药组合物，具有能抗氧化功能，在抗氧化、抗衰老及预防、延缓或治疗神经系统退行性疾病和动脉粥样硬化领域显示了广泛的应用前景。
6.本发明提供了中药组合物制备抗氧化产品中的应用：
7.中药组合物在制备抗氧化产品中的应用：
8.所述中药组合物，按重量份计，包括以下组分：甘草3～7份；人参1～3份；干姜1～3份；玉竹1～3份；罗汉果3～7份；玉竹2～5份；大枣2～6份。
9.本发明中，所述含有人参、甘草和玉竹等中药组合物(英文简称为gcny)，按重量份计，具体由以下组分组成：甘草5份；人参2.5份；干姜2.5份；玉竹2份；罗汉果4份；玉竹3份；大枣2份。
10.上述的应用中，所述产品包括食品、药品和保健品中的至少一种。
11.本发明还提供了所述含有人参、甘草和玉竹的中药组合物(gcny)在如下1)-5)中任一中的应用：
12.1)预防和/或延缓动脉粥样硬化的产品；
13.2)预防和/或延缓神经退行性疾病的产品；
14.3)治疗神经退行性疾病药物；
15.4)抗衰老的产品；
16.5)抗氧化干预亚健康产品。
17.上述的应用中，所述产品包括食品、药品和保健品中的至少一种。
18.本发明进一步提供了一种中药药剂或中药提取物，它由所述中药组合物煎煮或提取获得；
19.所述中药组合物，按重量份计，包括以下组分：甘草3～7份；人参1～3份；干姜1～3份；玉竹1～3份；罗汉果3～7份；玉竹2～5份；大枣2～6份。
20.本发明中，所述中药组合物煎煮或提取的方法均为本领域中常规方法。
21.本发明的有益效果为：
22.1、本发明提供的含有人参、甘草和玉竹等中药组合物(gcny)能够降低氧化应激条件下小胶质细胞内的ros水平。采用含有人参、甘草和玉竹等中药组合物(gcny)煎煮的汤剂给大鼠灌胃获取的药物血清能够降低过氧化氢刺激下小胶质细胞(hmc3)的胞内ros水平，但并不会引起细胞的过度增殖。而小胶质细胞的过度生长及激活与神经退行性病变密切相关，会导致生物体认知能力下降。因此，采用本发明提供的含有人参、甘草和玉竹等中药组合物(gcny)可在控制细胞正常生长的情况下，有效降低神经小胶质细胞的氧化应激水平。
23.2、本发明提供的含有人参、甘草和玉竹等中药组合物(gcny)可以有效抑制小胶质细胞炎症因子的释放。小胶质细胞作为中枢神经系统中唯一的免疫细胞，其长时间的释放炎症介质导致的生物体大脑慢性炎症对机体是有害的，可造成神经组织损伤。采用含有人参、甘草和玉竹等中药组合物(gcny)煎煮的汤剂给大鼠灌胃获取的药物血清能够抑制由氧化应激而激活的nf-κb炎症信号通路活性，从而显著下调小胶质细胞释放炎症因子，如il6的能力。本发明的中药组合物(gcny)在抗氧化、抗炎方面的特殊效果为今后临床上有效治疗神经退行性疾病开辟了新的途径。
附图说明
24.图1是构建的体外氧化应激细胞模型的测试结果图；其中图1中a为不同浓度过氧化氢处理的hmc3细胞胞内ros水平；b为不同浓度过氧化氢处理的hmc3细胞的胞内nrf2基因的mrna表达水平；c为不同浓度过氧化氢处理的hmc3细胞的胞内nrf2基因的蛋白表达水平。
25.图2是本发明提供的含有人参、甘草和玉竹的中药组合物(gcny)药物血清对氧化应激效应下细胞活性氧水平及对内源性抗氧化基因表达水平影响的结果图；其中图2中a为nc、nc h2o2和gcny不同处理组细胞中活性氧水平的变化；b为nc、nc h2o2和gcny不同处理组细胞中nrf2基因蛋白表达水平的变化；c为nc、nc h2o2和gcny不同处理组细胞中内源性抗氧化基因mrna表达水平的变化，注：c中每组数据自左至右分别为nc、nc h2o2和gcny的3个柱状图。
26.图3是本发明提供的含有人参、甘草和玉竹的中药组合物(gcny)药物血清在氧化应激效应下对小胶质细胞增殖影响的结果图；
27.图4是本发明提供的含有人参、甘草和玉竹的中药组合物药物(gcny)血清在氧化
应激效应下对小胶质细胞炎症通路活性及炎症因子表达水平影响的结果图；其中图4中a为nc、nc h2o2和gcny不同处理组细胞中总nf-κb蛋白和磷酸化nf-κb蛋白的表达变化；b为nc、nc h2o2和gcny不同处理组细胞中细胞因子il6的表达变化。
28.图5为h2o2建模和gcny处理的rna测序数据分析总体变化；其中，(a&b)箱线图和堆积柱形图代表被检查样品的表达均匀性；(c)nc与nc h2o2组细胞的差异表达基因；(d)nc h2o2与gcny组细胞的差异表达基因；(e&f)通过h2o2模型下调，但通过gcny处理上调。
29.图6为通过rna序列筛选出的代表性差异表达基因；其中，(a)gcny处理产生的58个差异基因热图，在nc、nc h2o2和gcny组细胞中表达的影响；(b)nc、nc h2o2和gcny组细胞中的代表性差异表达基因对神经退行性疾病和衰老的影响；(c)代谢和发育的影响；(d)以及免疫系统的影响。*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001；****p《0.0001。
30.图7为所涉及的差异表达基因的kegg通路；其中，(a)由h2o2建模产生278个差异表达基因的kegg通路，(b)由nc h2o2与gcny组细胞产生的58个个差异表达基因富集的kegg通路。
具体实施方式
31.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
32.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
33.下述实施例中，含有人参、甘草和玉竹的中药组合物(gcny)大鼠血清制备：
34.健康6周龄sd雌性大鼠20只，spf级，体重180-220g，购自南方医科大学动物实验中心，生产许可证号：scxk(粤)2016-0041。将大鼠随机分为2组，即生理盐(normal saline,ns)水对照组和甘草人参(gc)实验组，每组10只。gcny组采用甘草5份；人参2.5份；干姜2.5份；玉竹2份；罗汉果4份；玉竹3份；大枣2份。加蒸馏水进行煎煮，2小时。后获得中药煎煮的浓缩液对大鼠进行灌胃，按照原中药饮片量技术，每次0.95g/100g，每日两次(相当于60kg成人用量6.3倍)；连续灌胃7天。nc组采用等量生理盐水灌胃。
35.于第7日灌胃完成2h后，舒泰50肌肉注射进行麻醉，腹主动脉采血后，对大鼠进行过麻醉及安乐死。动物实验经深圳市人民医院伦理委员会批准(批准文号aup-220516-cy-0353)。获得血样存于4℃冰箱静置1h，2000g离心8min分离血清，56℃水浴30min灭活及过滤除菌后加入1％青霉素、链霉素双抗并分装入离心管，置于-20℃冰箱中保存备用。
36.下述实施例中hmc3细胞购于深圳市科普生物有限公司，产品目录号为zq0887。
37.实施例1、氧化应激细胞模型的构建
38.hmc3细胞系(crl-3304)为人胎脑源性原代小胶质细胞，不仅保留有小胶质细胞的特性，还被改造为永生化的细胞系，非常适合用于退行性疾病体外细胞模型的构建。
39.氧化应激细胞模型的构建方法具体如下：
40.将适量浓度的hmc3细胞接种于6cm细胞培养皿中，用含10％fbs和1mm丙酮酸纳的mem培养基培养，于37℃，5％co2的培养箱中过夜，待细胞汇合度达到90％后，分别用不同浓度的过氧化氢(0，50，100，200，400μm)处理hmc3细胞4h，诱导体外氧化应激细胞模型。0.25％胰酶消化、收集细胞。细胞重悬于含5μmdcfh-da(2,7-二氯荧光素二乙酸酯，一种ros特异性的荧光探针)的无血清mem培养基中，37℃孵育20分钟。500
×
g离心、pbs缓冲液洗涤细胞两次，最后在488nm激发光下检测荧光强度。
41.由图1所示，随着过氧化氢浓度升高，胞内ros水平逐渐升高(图1a)，细胞处于氧化应激状态，伴随内源性的抗氧化系统启动，检测到nrf2的mrna和蛋白水平，均上调(图1b、c)。图1a中的“auto-fluo”是hmc3细胞的自荧光强度值，可见相较于dcfh-da发光可忽略不计。由于过氧化氢自身的毒性作用，当其浓度超过400μm，镜下细胞已经开始大量死亡。
42.由此可见，对于hmc3细胞，200μm的过氧化氢处理浓度是比较合适的氧化应激造模浓度。
43.以下研究中，结合氧化应激细胞模型，采用正常大鼠血清及gcny药物血清的分组及干预措施如表1所示：
44.表1.细胞分组及其对应的干预措施
45.细胞分组h2o2正常血清gcny含药血清正常血清干预正常细胞(nc)- -正常血清干预模型细胞(nc h2o
2)
-药物血清干预模型细胞(gcny) -
46.实施例2、含有人参、甘草和玉竹等中药组合物(gcny)的血清降低小胶质细胞氧化应激水平
47.采用含有人参、甘草和玉竹等中药组合物(gcny)煎煮的汤剂给大鼠灌胃获取药物血清(gcny)，并用生理盐水处理血清(nc)作为实验对照。采用本发明实施例1中的hmc3细胞氧化应激模型，分组如下：1)正常组：培养于生理盐水血清组(nc)；2)药物处理组：培养于含有人参、甘草和玉竹等中药组合物(gcny)的药物血清组。以上两组，收集细胞前加入过氧化氢(200μm)处理4h。3)空白组：培养于生理盐水血清组(nc)，不加过氧化氢处理。按照本发明实施例1中的方法，检测以上三组处理的胞内ros水平和nrf2的表达情况。由图2可见，过氧化氢刺激hmc3细胞后，胞内ros水平明显上升，而当用药物血清(gcny)干预后，胞内ros水平显著降低(图2a)。这是否与细胞抗氧化能力的提升相关，用western blot检测nrf2蛋白水平，发现nrf2信号通路并没激活，相反被压制(图2b)，通过qrt-pcr检测它的一系列靶基因，发现其下游抗氧化靶基因的表达也是被压制的(图2c)。
48.由此可见，本发明提供的含有人参、甘草和玉竹的中药组合物能有效抵抗氧化应激，而且无需动员患者内源性的抗氧化能力，对病人氧化损伤后的快速恢复大有裨益。
49.实施例3、含有人参、甘草和玉竹等中药组合物(gcny)的血清对氧化应激下细胞增殖的影响
50.采用含有人参、甘草和玉竹的中药组合物煎煮的汤剂给大鼠灌胃获取药物血清(gcny)可以有效降低氧化应激下小胶质细胞的ros水平，意味着胞内氧化张力下降，细胞的氧化损伤减少，细胞可以继续增殖。而小胶质细胞的过度增殖，往往不利于神经元的互作，从而影响生物体认知功能。由图3可见，通过bradford法检测本发明实施例2中的细胞蛋白总量，发现gcny组在能缓和氧化应激效应的情况下，并不会造成小胶质细胞的过度增殖，细胞蛋白量相较于nc过氧化氢刺激组不仅没有增加，反而比未经过氧化氢刺激的对照组还略低。
51.由此可见，本发明提供的含有人参、甘草和玉竹的中药组合物在有效抵抗氧化应激的同时，并不导致细胞的过度增殖，显示了治疗神经退行性疾病的应用前景。
52.实施例4、含有人参、甘草和玉竹等中药组合物(gcny)的血清抑制小胶质细胞炎症
效应
53.氧化应激作为神经退行性疾病的病因，除了对神经元的氧化损伤，还可激活小胶质细胞，导致促炎症因子的释放，从而通过神经炎症引起神经元的损伤和丢失。采用western blot技术检测本发明实施例2中nc和gcny两组hmc3细胞在氧化应激条件下nf-κb炎症信号通路的活性情况。由图4可见，相较于nc过氧化氢刺激组，经gcny处理的细胞，其nf-κb信号通路活性被明显抑制，表现为不仅总的nf-κb蛋白表达下调，有活性的磷酸化nf-κb(pnf-κb)蛋白水平也下调(图4a)。进一步检测炎症因子il6的表达，gcny组明显抑制il6的表达(图4b)。
54.由此可见，本发明采用含有人参、甘草和玉竹的中药组合物煎煮的汤剂给大鼠灌胃获取的药物血清能有效抑制炎症通路活性，遏制炎症因子的释放，表现出抗炎效果。
55.实施例5、
56.为了探索h2o2对hmc3细胞的影响以及gcny含药血清如何影响氧化应激状态下的细胞基因表达。h2o2建模细胞的转录组。采用本发明实施例1中的hmc3细胞氧化应激模型，对nc、nc h2o2和gcny组细胞进行了高通量mrna测序，并进行转录组分析。
57.1、质量控制
58.本发明转录组学研究使用dnbseq平台(深圳市华大基因检测公司)共测量9个样本(nc、nc h2o2和gcny组细胞每组3重复)，每个样本平均产生6.65g数据。样本比对基因组平均比对率为93.62％，比对基因组平均比对率为74.60％；共检测到16,686个基因。箱线图显示了每组所有样本的基因表达水平分布，可以观察到表达数据分布的分散程度。为了更直观地展示不同tpm区间内每个样本的基因数量，统计了三种tpm情况下的基因数量(tpm《＝1，tpm 1-10，tpm》＝10)。任何一种分布都表明检查样本的rna表达均匀性(图5a和b)。
59.2、h2o2建模和gcny处理观察差异表达基因
60.采用本发明实施例1中的hmc3细胞氧化应激模型。通过h2o2建模，89种mrna上调，189种下调(图5c)。与nc h2o2组(按照本发明实施例2中模型分组)细胞相比，gcny组(按照本发明实施例2中模型分组)使血清上调和下调相同数量的差异表达基因为29(图3d)。在差异表达基因中，6个mrna通过h2o2建模下调，但通过gcny组处理上调，它们是cenpf、cps1、acaca、mki67、prr11、top2a(图5e和f)。它们都与细胞周期、细胞增殖有关，属于生长基因的范畴。
61.干预措施同本发明实施例1中表1所示。
62.3、rna序列筛选出的代表性差异表达基因
63.使用soapnuke(v1.5.2)过滤测序数据，具体方法是(1)删除包含测序适配器的reads；(2)去除低质量碱基比例(碱基质量小于等于5)大于20％的reads；(3)去除未知碱基('n'碱基)比例大于5％的reads，得到的clean reads以fastq格式存储。使用hisat2(v2.0.4)将clean reads映射到参考基因组。应用bowtie2(v2.2.5)将clean reads与参考编码基因集对准，然后通过sem(v1.2.12)计算基因的表达水平。热图由pheatmap(v1.0.8)根据不同样本的基因表达情况绘制。差异表达分析是使用q值≤0.05的deseq2(v1.4.5)进行。为了深入了解表型的变化，phyper(https：//en.wikipedia.org/wiki/hypergeometric_distribution)基于超几何测试，采用go(http://www.geneontology.org/)和kegg(https://www.kegg.jp/)数据库对差异基因进行注释和
通路分析。使用bonferroni阈值(q值≤0.05)的q值对显着水平的通路进行校正。
64.由图6中结果可知，通过对gcny处理细胞产生的58个差异表达基因进行kegg富集，将它们分配到各种生物活性途径中，例如神经退行性疾病、心血管疾病、免疫系统代谢和衰老(图6a)。例如，在神经退行性疾病通路中富集的cox4i1和cox6b1是细胞色素c氧化酶的两个亚基，是哺乳动物细胞产生atp所需的线粒体机制不可或缺的一部分，并且发现在神经元细胞受损时会过度表达。在h2o2建模下，这两者都增加了，而在gcny处理下又恢复到正常化(图6b)。hspa1a和hspa8是热休克蛋白70家族的成员，它们有助于神经保护和通常在衰老过程中受损的蛋白质稳态均被gcny治疗上调(图6b)。
65.参与代谢和发育途径的差异表达基因，如cps1、ogt、acaca和nbpf14，在h2o2模型中不同程度地下调，而在gcny中上调(图6c)。acaca催化乙酰辅酶a的atp依赖性羧化，这是脂肪酸生物合成中的限速步骤。nbpf14在神经发育上亦有重要功能。
66.由cps1编码的线粒体酶催化氨和碳酸氢盐合成氨基甲酰磷酸，在从细胞中去除过量氨方面发挥重要作用，并且在基于蛋白质的研究中，cps1通过有效治疗小鼠胰岛素抵抗而上调。最近对ogt的研究进行了改造，并增强了对细胞氧化应激反应的酶活性。
67.nfkb2，作为转录因子复合物核因子-κb(nf-kb)的一个亚基，通常被氧化应激激活，在gcny处理的细胞中表达较低。结果与上述蛋白质水平的发现一致。同样，诱导先天免疫系统的ifitm2也被下调(图6d)。虽然myo10和hsp90aa1是炎症和细胞生长的促进剂，但它对大脑发育和认知维持至关重要被gcny治疗上调(图6d)。
68.4、所涉及的差异表达基因通路
69.h2o2建模得到的278个差异表达基因富集到了kegg通路，如细胞周期、孕酮介导的卵母细胞成熟、p53信号通路、细胞衰老、癌症通路等(图7a)。对于nc h2o2与gcny组产生的58个差异表达基因，细胞富集到kegg途径，包括抗原加工和呈递、军团菌病、长寿调节途径、氧化磷酸化和帕金森病等(图7b)。
70.以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
71.此外，本领域的技术人员能够理解，尽管在此的一些实施例包括其它实施例中所包括的某些特征而不是其它特征，但是不同实施例的特征的组合意味着处于本发明的范围之内并且形成不同的实施例。例如，在上面的权利要求书中，所要求保护的实施例的任意之一都可以以任意的组合方式来使用。公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在加深对本发明的总体背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域技术人员所公知的现有技术。