一种可用于修复神经环路的可降解人工韧带及其制备方法与流程

1.本发明涉及医学材料技术领域，具体地说，是一种可用于修复神经环路的可降解人工韧带及其制备方法。


背景技术：

2.前交叉韧带(anterior cruciate ligament,acl)断裂后机械稳定性下降，本体感觉传入功能障碍
1.，中枢神经系统功能重塑(central nervous system plasticity,cnsp)
2.，步态和运动姿势异常
[3-6]
，早期发生膝骨性关节炎
[7]
，所引起的病痛严重影响患者的运动和心理健康，大大降低生活质量。虽然目前常规acl重建手术(自体或同种异体肌腱重建、人工韧带重建)可以增加膝关节的机械稳定性
[8]
，但是难以根本恢复acl的本体感觉传入功能，继而难以避免cnsp。这种cnsp不仅作为一种结果，还作为一种导致acl损伤的原因，形成恶性循环
[9,10]
。因此，cnsp对于acl损伤的康复至关重要
[11]
。
[0003]
cnsp源于acl损伤后本体感受器的数量减少、形态和功能异常以及本体感觉上传障碍，继而导致中枢神经系统对于下行运动控制系统的控制障碍。acl修复再生为恢复acl本体感觉的根本办法。acl组织再生越好，就越能在宏观上恢复机械力学稳定性、在微观上恢复信号通路和本体感觉。acl保残重建手术是acl修复再生的根本。干细胞和富含血小板血浆等组织工程技术也在一定程度上起到了促进acl组织修复再生
[12]
。在此基础上，美国波士顿儿童医院murray医生提出的acl生物桥接增强修复的手术方式已经在动物研究和初期临床研究中取得一定效果
[13]
。但是，这些促进acl残端自身修复的方法未专门关注acl中感受器等神经组织的再生这一重要议题。
[0004]
材料科学的发展为神经修复再生打开了一扇大门。一方面：各种生物型和非生物型神经导管在周围神经再生有关基础和临床研究中取得了可喜的成果，其中壳聚糖因其具有良好的吸附性、通透性、可塑性、生物相容性和生物可降解性而成为构建人工神经移植物的理想材料
[14-16]
。另一方面：组织再生需要时间，在等待组织成功再生的时间内acl的本体感受器数量减少、形态异常、功能降低、继而导致的中枢神经系统重塑难以避免。在这段时间，需要新型材料可以随着关节运动收集机械能，将其转化为电能，满足感知膝关节运动时的形变，并且产生电冲动上传，模拟替代acl本体感觉，恢复神经环路的要求
[17]
。因此，前交叉韧带本体感受器功能的模拟替代为再生修复所需时间段的过渡性方法。
[0005]
材料科学领域的驻极体和压电驻极体可以满足该要求。
①
驻极体(也称为永电体)指能够“长期”保持极化状态的电介质，即能够长期存储过剩“真实”电荷或/和保持“取向”电偶极子的电介质(即相对介电常数大于1)
[18]
。壳聚糖就可以经过极化而成为“取向”电偶极子驻极体。
②
压电驻极体(也称为铁电驻极体)指具有压电效应的含有取向“宏观电偶极子”的微孔结构驻极体
[19]
。它除了兼具传统压电陶瓷的强压电效应和铁电聚合物的高柔韧性外，还具有轻薄、低声阻抗、超宽响应频带、低相对介电常数、低成本、环境友好等突出的特点，是制备各类柔性轻量化力传感器的理想敏感材料。聚-3-羟丁酸酯-3-羟戊酸酯(poly-3-hydroxybutyrate-3-hydroxyvalerate，phbv)具有生物可降解性、生物相容性和
movement as a neural graft.cellular experiments showed a better cell adhesion and growth inside the crosslinked nanofi brous scaff olds compared with un-crosslinked ones.this neural conduit appears to have the right organization for testing in vivo nerve tissue engineering studies(本研究的目的是制备一种壳聚糖交联纳米纤维生物可降解聚(3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯)(phbv)神经导管。用静电纺丝法制备了人工支架，并用化学方法与壳聚糖交联。对支架进行了评价显微、物理和力学分析，以及雪旺细胞的细胞培养分析。分析结果显示神经移植具有良好的弹性和顺应性。细胞实验表明，与未交联的纳米材料相比，交联纳米材料具有更好的细胞粘附和生长能力。这种神经导管似乎有合适的组织来进行活体神经组织工程研究。)但是该文献中公开的制备方法是通过在原有的phbv导管的基础上通过化学固定法交联壳聚糖，而本发明的方法是一体成型，能够确保壳聚糖和phbv的内外方向，降低了化学溶液的额外干扰和化学固定纤维方向的不可控性。关于本发明一种可用于修复神经环路的可降解人工韧带及其制备方法目前还未见报道。


技术实现要素：

[0011]
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种可用于修复神经环路的可降解人工韧带及其制备方法。
[0012]
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
[0013]
第一方面，本发明提供了一种phbv-cs壳核结构纳米纤维支架材料，所述材料是由羟基丁酸-羟基戊酸共聚酯和壳聚糖制成，所述可降解人工韧带的制备方法包括如下步骤：
[0014]
(1)将质量百分浓度为8％-15％的羟基丁酸-羟基戊酸共聚酯溶解于三氯甲烷中完全溶解，配制备用；
[0015]
(2)将质量百分浓度为4％-8％、脱乙酰度≥95％的壳聚糖溶解于二氯甲烷-三氟乙酸混合溶剂中至完全溶解，配制备用；
[0016]
(3)将步骤(1)和步骤(2)得到的溶液分别注入注射器中，按照静电纺丝方法制得phbv-cs核壳纤维薄膜；
[0017]
(4)将步骤(3)得到的phbv-cs核壳纤维薄膜于室温下真空干燥1-3天除去溶剂，得到phbv-cs壳核结构纳米纤维支架材料；
[0018]
(5)采用栅控电晕极化法对phbv-cs壳核结构纳米纤维支架材料进行极化；
[0019]
(6)将极化后的phbv-cs壳核结构纳米纤维支架材料以壳聚糖层为内表面卷起，即得。
[0020]
优选地，步骤(1)中所述羟基丁酸-羟基戊酸共聚酯的质量百分浓度为15％。
[0021]
优选地，步骤(2)中所述壳聚糖的质量百分浓度为8％。
[0022]
优选地，步骤(3)中所述静电纺丝方法中的实验条件为：同轴纺丝喷头的内管内径为0.5mm，外管内径为1.2mm；喷头接正电压，接收板接负电压；纺丝条件为：注射器尺寸17mm，收集器转速1500rpm，外管流速0.04mm/min，内管流速0.02mm/min，注射器头距收集器14cm，正电压20kv，负电压2kv，温度25℃，相对湿度30～40％。
[0023]
优选地，步骤(5)中所述极化的实验条件为：电极间距为4cm，电晕电压-8kv，栅电压-1kv，极化温度为室温，极化湿度为0-40％，极化时间为5min。
[0024]
优选地，步骤(6)中的制备方法为：将步骤(5)极化后得到的材料剪成长方形，以纤维排列方向为宽，以金属棒为轴，沿长方形的宽将材料以壳聚糖层为内层卷起，即得。
[0025]
第二方面，本发明提供了一种phbv-cs壳核结构纳米纤维支架材料的制备方法，包括如下步骤：
[0026]
(1)将质量百分浓度为8％-15％的羟基丁酸-羟基戊酸共聚酯溶解于三氯甲烷中完全溶解，配制备用；
[0027]
(2)将质量百分浓度为4％-8％、脱乙酰度≥95％的壳聚糖溶解于二氯甲烷-三氟乙酸混合溶剂中至完全溶解，配制备用；
[0028]
(3)将步骤(1)和步骤(2)得到的溶液分别注入注射器中，按照静电纺丝方法制得phbv-cs核壳纤维薄膜；
[0029]
(4)将步骤(3)得到的phbv-cs核壳纤维薄膜于室温下真空干燥1-3天除去溶剂，得到phbv-cs壳核结构纳米纤维支架材料；
[0030]
(5)采用栅控电晕极化法对phbv-cs壳核结构纳米纤维支架材料进行极化；
[0031]
(6)将极化后的phbv-cs壳核结构纳米纤维支架材料以壳聚糖层为内表面卷起，即得。
[0032]
优选地，步骤(1)中所述羟基丁酸-羟基戊酸共聚酯的质量百分浓度为15％；步骤(2)中所述壳聚糖的质量百分浓度为8％。
[0033]
优选地，步骤(3)中所述静电纺丝方法中的实验条件为：同轴纺丝喷头的内管内径为0.5mm，外管内径为1.2mm；喷头接正电压，接收板接负电压；纺丝条件为：注射器尺寸17mm，收集器转速1500rpm，外管流速0.04mm/min，内管流速0.02mm/min，注射器头距收集器14cm，正电压20kv，负电压2kv，温度25℃，相对湿度30～40％；步骤(5)中所述极化的实验条件为：电极间距为4cm，电晕电压-8kv，栅电压-1kv，极化温度为室温，极化湿度为0-40％，极化时间为5min；步骤(6)中的制备方法具体为：将步骤(5)极化后得到的材料剪成长方形，以纤维排列方向为宽，以金属棒为轴，沿长方形的宽将材料以壳聚糖层为内层卷起，即得。
[0034]
第三方面，本发明提供了如上所述的phbv-cs壳核结构纳米纤维支架材料在作为可降解人工韧带中的应用。
[0035]
目前，phbv-cs可吸收纳米前交叉韧带如何作用于ruffini小体，使其感受牵张刺激，ruffini小体中的asic又如何产生本体感觉的深层分子机制不明。结合国内外文献报告和前国家自然科学基金项目的初步成果，本发明的研究团队提出phbv-cs可吸收纳米材料修复前交叉韧带产生本体感觉机制的假说(见图3)：phbv-cs可吸收纳米材料促进acl神经组织再生和维持acl张力，膝关节运动牵张acl，细胞外基质(extracellularmatrix,ecm)中存在抵抗压力、剪切力及张力的胶原蛋白和保持细胞坚固的蛋白聚糖等物质在维持细胞稳定的同时会将机械信号传递到细胞膜、与细胞外h

和其他调节物质共同激活asic通道。对阳离子(主要是na

和较小程度的ca
2
)具有渗透性的asic产生内向电流，使细胞膜去极化，从而激活电压门控的ca
2
通道和na

通道，并可能通过释放电压依赖性mg
2
阻滞而可能促进nmda受体的激活。电压门控的ca
2
通道和na

通道都可促进树突棘和动作电位的产生，ca
2
/钙调蛋白依赖性蛋白激酶ii激活，并可能影响其他第二信使途径。这样，电流信号通过传入神经，经过背根神经节传导至脊髓形成薄束，传导至大脑。
[0036]
本发明优点在于：
[0037]
1、本发明使用的壳聚糖具有优秀的神经保护作用，能促进神经再生的良好支架，使用的phbv具有生物可降解性、生物相容性和较强的机械性能的压电生物聚合物，能够在压力变化中产生微电流，有更好的促进细胞增殖和分化的能力。发明人在研究的过程中发现壳聚糖因其结构机械强度较低，在生理环境下存在机械不稳定，phbv因其较高的表面疏水性降低了细胞的增殖和黏附，结晶度较高表现较高的脆性。但在制备人工材料时以phbv作基底，壳聚糖表面修饰则可以取长补短，同时满足前交叉韧带本体感受器修复和细胞黏附的作用和作为acl人工韧带的强度要求。
[0038]
2、本发明用同轴静电纺丝技术制备phbv-cs壳核结构定向纳米纤维支架,在纺织过程中采用定向纺丝，考虑了韧带特有的拉伸延展性、纤维轴向排列、多孔性等特性。本发明的制备方法一体成型，确保了壳聚糖和phbv的内外方向，降低了化学溶液的额外干扰，和化学固定法纤维方向的不可控性。
[0039]
3、本发明还对表面的壳聚糖部分进行了栅控电晕极化，使壳聚糖表面具备电荷，加强了人工韧带的电流刺激作用，从而更好促进韧带组织和神经再生。
[0040]
4、通过本发明的实验条件制备的材料机械性能以及生物学性能取得了预料不到的技术效果。
附图说明
[0041]
附图1是phbv-cs可吸收纳米前交叉韧带制备流程图。
[0042]
附图2是通过本发明的制备方法制得的可用于修复神经环路的可降解人工韧带。
[0043]
附图3是phbv-cs可吸收纳米前交叉韧带调控asic信号通路机制的假说示意图。
[0044]
附图4a是试样1的拉力试验结果。
[0045]
附图4b是试样2的拉力试验结果。
[0046]
附图4c是试样3的拉力试验结果。
[0047]
附图4d是试样4的拉力试验结果。
[0048]
附图4e是试样5的拉力试验结果。
[0049]
附图4f是试样6的拉力试验结果。
[0050]
附图4g是试样7的拉力试验结果。
具体实施方式
[0051]
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。
[0052]
实施例1
[0053]
1材料与仪器
[0054]
羟基丁酸-羟基戊酸共聚酯(phbv)，宁波天安生物材料有限公司。
[0055]
壳聚糖(cs)，脱乙酰度≥95％，mw≈100000，粉末，安徽酷尔生物工程有限公司。
[0056]
三氯甲烷、二氯甲烷、三氟乙酸分析纯，阿拉丁试剂上海有限公司。
[0057]
同轴静电纺丝设备，ss-2535h，北京永康乐业科技发展有限公司。
[0058]
2制备方法
[0059]
见图1，将质量百分浓度为15％的羟基丁酸-羟基戊酸共聚酯溶解于三氯甲烷中完全溶解，配制备用；将质量百分浓度为8％、脱乙酰度≥95％的壳聚糖溶解于二氯甲烷-三氟乙酸混合溶剂中至完全溶解，配制备用；将壳聚糖纺丝液和phbv纺丝液注入内层5ml的注射器里，选用同轴纺丝喷头(内管内径为0.5mm，外管内径为1.2mm)，喷头接正电压，接收板接负电压。纺丝条件为：注射器尺寸17mm，收集器转速1500rpm，外管流速0.04mm/min，内管流速0.02mm/min，注射器头距收集器14cm，正电压20kv，负电压2kv，温度25℃，相对湿度30～40％。最后将静电纺成的phbv-cs核壳纤维薄膜小心地从收集器中分离出来，在室温下真空干燥2天，以完全除去溶剂分子，得到外层为壳聚糖，内层为phbv的phbv-cs壳核结构纳米纤维支架材料。采用栅控电晕极化法对phbv-cs纳米纤维进行极化。将纤维膜置于电极上，间距为4cm。电晕电压-8kv，栅电压-1kv。极化温度为室温，极化湿度小于40％，极化时间为5min。极化使外层壳聚糖具备长期储存极化和空间电荷的能力，其表面携带负电荷，在磷酸盐缓冲液中静置9天，表面电位余52％以上。通过将极化的phbv-cs壳核结构纳米纤维支架裁剪成长方形，其中以纤维排列方向为宽，长方形的长度视韧带缺损的长度决定；以金属棒为轴，金属棒直径的选取根据手术对象的韧带直径而定，沿长方形的宽边将支架以壳聚糖层为内表面卷起，形成壳聚糖人工神经假体acl增强缆-1(见图2)。
[0060]
实施例2
[0061]
1检测方法
[0062]
1.1分组
[0063]
组一：壳聚糖质量分数4％，搅拌过程中2ml/2g冰醋酸；phbv质量分数8％，三氯甲烷：无水乙醇9：1溶解，纺丝厚度0.14mm；纺丝条件为：注射器尺寸17mm，收集器转速250rpm，内外管流速0.7ml/h，注射器头距收集器14cm，正电压18kv，负电压-6kv，温度25℃，相对湿度30～40％。
[0064]
组二：壳聚糖质量分数4％，搅拌过程中2ml/2g冰醋酸；phbv质量分数8％，三氯甲烷：无水乙醇9：1溶解，纺丝厚度0.05mm
[0065]
纺丝条件为：注射器尺寸17mm，收集器转速500rpm，内外管流速0.7ml/h，注射器头距收集器14cm，正电压18kv，负电压-6kv，温度25℃，相对湿度30～40％。
[0066]
组三：壳聚糖质量分数4％，搅拌过程中2ml/2g冰醋酸；phbv质量分数8％，三氯甲烷：无水乙醇9：1溶解，纺丝厚度0.3mm
[0067]
纺丝条件为：注射器尺寸17mm，收集器转速250rpm，内外管流速0.7ml/h，注射器头距收集器14cm，正电压18kv，负电压-6kv，温度25℃，相对湿度30～40％。
[0068]
组四：壳聚糖质量分数2％，搅拌过程中2ml/2g冰醋酸；phbv质量分数8％，三氯甲烷：无水乙醇9：1溶解，纺丝厚度0.14mm
[0069]
纺丝条件为：注射器尺寸17mm，收集器转速250rpm，内外管流速0.7ml/h，注射器头距收集器14cm，正电压18kv，负电压-6kv，温度25℃，相对湿度30～40％。
[0070]
1.2对各组材料进行拉力试验，检测方法统一是万能拉伸试验机。
[0071]
2结果
[0072]
各组结果分别为：
[0073]
组一：结果：最大值载荷16.42957n，拉伸应力在最大值载荷17.00784mpa，杨氏弹
性模量662.56768mpa。(见图4c-4d，即试样3和试样4)
[0074]
组二：结果：最大值载荷1.86248n，拉伸应力在最大值载荷2.12855mpa，杨氏弹性模量72.60026mpa。(见图4g，即试样7)
[0075]
组三：结果：最大值载荷3.12669n，拉伸应力在最大值载荷3.4741mpa，杨氏弹性模量111.8411mpa。(见图4e-f，即试样5和试样6)
[0076]
组四：结果：最大值载荷9.74288n，拉伸应力在最大值载荷10.08579mpa，杨氏弹性模量564.46442mpa。(见图4a-b，即试样1和试样2)
[0077]
表1
[0078][0079]
表2
[0080][0081][0082]
表3
[0083][0084]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
[0085]
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