虫胶共折叠大豆分离蛋白冷凝胶的制备方法

1.本发明属于大豆分离蛋白冷凝胶的制备技术领域，涉及一种虫胶改性大豆分离蛋白凝胶的制备方法。


背景技术：

2.基于大豆分离蛋白的凝胶性能，大豆分离蛋白在食品工业中广泛起到增加蛋白含量并形成具有容纳水、脂肪、香料、食品其他成分的基质。聚集是蛋白形成凝胶的关键步骤，大豆分离蛋白凝胶可通过热诱导基于共价键和系列非共价键形成凝胶网络结构，但不适宜热敏性生物活性成分的荷载或包埋。另一类蛋白凝胶常通过蛋白质等电点(酸诱导)凝胶或盐离子诱导，如氯化钙及氯化钠，二价铁离子和镁离子也可用于制备具有更高营养价值和功能的蛋白冷凝胶。蛋白冷凝胶的主要优点在于其基于蛋白质分子内的不同官能团发生变性暴露，与此同时可与其他生物活性物质或多肽链间发生相互作用，如氢键、静电和疏水相互作用，这些相互作用力的发生可用于设计靶向递送系统。此外，冷凝胶可以更好的控制所形成凝胶的形状、结构和质地。
3.ph偏移技术是改变蛋白质空间结构及功能的一种简单、便捷、低成本的方法。在极端碱性环境中使蛋白质充分展开，导致球状蛋白质的构象发生变化，产生“熔球”状结构，而后调节ph为中性使蛋白质重新折叠。蛋白重折叠后除可以改善蛋白质自身的功能性质外，在此过程中与另一种成分共折叠可以用于开发具有新结构或功能的食用材料。
4.虫胶是一种天然聚合物，由木桐酸和环状萜酸组成，通过酯键链接，分别作为疏水部分与亲水部分；分子结构中羧基不参与环状萜酸酯化反应，从而赋予虫胶弱酸性，因此虫胶可溶于碱性溶液而不溶于酸性溶液中，具有ph响应性。虫胶可以基于非共价相互作用与亲水性聚合物相互作用。由于其独特的化学性质，虫胶在新型食品中的开发中受到越来越多的关注，包括食品递送体系的构建、食品起泡剂或油凝胶剂、乳化剂。
5.目前，多利用虫胶与蛋白共折叠制备具有荷载活性成分作用的纳米粒子或蛋白膜，以赋予产物具有虫胶肠相相容性或阻湿性，但尚无利用虫胶与蛋白间的共折叠反应诱导形成蛋白冷凝胶的发明。


技术实现要素：

6.本发明要解决的技术问题是提供一种基于共折叠原理制备大豆分离蛋白冷凝胶的方法。
7.为解决上述技术问题，本发明提供一种虫胶共折叠大豆分离蛋白冷凝胶的制备方法(即，利用虫胶共折叠大豆蛋白构建大豆蛋白冷凝胶的方法)，包括以下步骤：
8.1)、配制质量浓度为11～13％(w/w)大豆分离蛋白水溶液；
9.2)、配制质量浓度为11～13％(w/w)、且ph为8
±
0.5的虫胶水溶液；
10.3)、按照大豆分离蛋白：虫胶＝1.3～2.5：1的质量比，
11.将步骤1)所得的大豆分离蛋白水溶液与步骤2)所得的虫胶水溶液混合，先调节所
得混合液的ph为12
±
0.5，再持续搅拌反应2
±
0.5h；
12.反应结束后(设定反应时间到达后)，先调节所得反应液(回调反应后溶液)的ph为8.5～9，再离心以脱除气体(4800g离心处理15min)，得到凝胶预溶液；
13.说明：部分预溶液于3kda超滤离心管中透析，冻干后得到的共折叠物用于蛋白性质的表征；
14.4)、将凝胶预溶液置于4
±
1℃保存12～15h，得到虫胶共折叠大豆分离蛋白冷凝胶(即，共折叠大豆分离蛋白冷凝胶)。
15.作为本发明的虫胶共折叠大豆分离蛋白冷凝胶的制备方法的改进：
16.步骤1)为：
17.向11～13g大豆分离蛋白加水(纯化水)至100g，于磁力搅拌器搅拌1.5～2.5h后，于0～4℃存放12～15h(以使得大豆分离蛋白完全水合)，形成质量浓度为11～13％大豆分离蛋白水溶液；
18.步骤2)为：
19.向11～13g虫胶加水(纯化水)至100g，并调节ph为8
±
0.5，于45～55℃持续磁力搅拌至虫胶完全溶解，得到质量浓度为11～13％、且ph为8
±
0.5的虫胶水溶液。
20.作为本发明的虫胶共折叠大豆分离蛋白冷凝胶的制备方法的进一步改进，步骤3)中：
21.用质量浓度2％的naoh调节混合液的ph为12
±
0.5；
22.用1m的hcl溶液调节所得反应液的ph为8.5～9。
23.作为本发明的虫胶共折叠大豆分离蛋白冷凝胶的制备方法的进一步改进：
24.步骤1)为：
25.向12g大豆分离蛋白加水至100g，于磁力搅拌器搅拌2h后，于0～4℃存放12～15h，形成质量浓度为12％大豆分离蛋白水溶液；
26.步骤2)为：
27.向12g虫胶加水至100g，并调节ph为8，于50℃持续磁力搅拌至虫胶完全溶解，得到质量浓度为12％、且ph为8的虫胶水溶液；
28.步骤3)为：
29.按照大豆蛋白：虫胶＝2.1：1的质量比，将大豆蛋白水溶液及虫胶溶液混合，调节共混液ph值为12，于25℃持续搅拌反应2h；而后先调节所得反应液(反应后溶液)的ph为9，再离心，得到凝胶预溶液；
30.步骤4)为：
31.将凝胶预溶液置于4℃静置保存15h，得到虫胶共折叠大豆分离蛋白冷凝胶(大豆蛋白虫胶共折叠冷凝胶)。
32.本发明以碱性环境下大豆分离蛋白与虫胶共展开而后调节ph环境诱发共折叠为原理，成功制备具有降低大豆分离蛋白体外水解率的蛋白冷凝胶。通过对结合后蛋白质一级结构、空间构象的变化及热稳定性的改变进行表征，并对形成的蛋白冷凝胶的硬度及流变性等凝胶特性进行评价，通过扫描电镜观察冷凝胶的微观结构。
33.即，本发明利用虫胶在极端碱性环境与蛋白共同展开，而后调节溶液ph，发生的共折叠反应制备蛋白冷凝胶，其冷凝胶机械性能较好，显著降低大豆分离蛋白的体外消化特
性，使其有益于作为活性成分的递送体系的构建。冷凝胶可搭载热敏性营养素或功能性活性物质，扩宽了蛋白凝胶的应用。
34.综上，本发明利用虫胶与大豆分离蛋白常温下进行共折叠制备大豆分离蛋白冷凝胶，制备过程温和，反应在室温下进行，未添加有机试剂，绿色环保。
35.采用本发明方法制备而得的虫胶共折叠大豆分离蛋白冷凝胶，具有良好的质构特性(硬度23.57g)及持水性(＞90％)可作为递送体系包埋活性成分，同时研究表明其有效降低了大豆分离蛋白的体外消化程度(肠消化水解度dh比大豆分离蛋白低15％)，适宜于敏感活性成分的递送。
附图说明
36.下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
37.图1为大豆分离蛋白/虫胶质量比为1，1.3，1.5，1.7，2.1，2.5及空白对比例-control的共折叠物电泳图：
38.(a)还原电泳-电泳样品加入了β-巯基乙醇；
39.(b)非还原电泳-电泳样品中未加入β-巯基乙醇；
40.对比例1(ss1)、对比例2(ss1.3)，对比例3(ss1.5)、实施例2(ss1.7)、实施例1(ss2.1)、实施例3(ss2.5)、空白对比例(control)；
41.(c)不同共折叠ph值得到的共折叠物电泳图(泳道1-4依次为对比例6、对比例7、对比例4、对比例5的还原电泳，泳道5-8为非还原电泳)；
42.图2大豆分离蛋白/虫胶共折叠物红外光谱；
43.(a)空白对比例共折叠物(control)、大豆分离蛋白(spi)、对比例8共折叠物(csmix)、实施例1共折叠物(ss2.1)、实施例3共折叠物(ss2.5)及虫胶(shellac)的红外光谱；
44.(b)不同大豆分离蛋白/虫胶质量比的共折叠物
‑‑‑‑
对比例8(csmix)、对比例2(ss1.3)，对比例3(ss1.5)，实施例2(ss1.7)，实施例1(ss2.1)，实施例3(ss2.5)以及虫胶(shellac)的红外光谱；
45.(c)不同共折叠ph
‑‑‑‑
空白对比例(control)、实施例1(ss2.1-9)、对比例4(ss2.1-7)、对比例5(ss2.1-8)、实施例2(ss1.7-9)、对比例6(ss1.7-7)、对比例7(ss1.7-8)；
46.图3为各案例所得的共折叠物的荧光光谱；
47.(a)为不同大豆分离蛋白/虫胶质量比的共折叠物
‑‑‑
对比例2(ss1.3)、对比例3(ss1.5)、实施例2(ss1.7)、实施例1(ss2.1)、实施例3(ss2.5)、空白对比例(control)以及大豆分离蛋白(spi)。
48.(b)不同共折叠ph值的共折叠物
‑‑‑
对比例6(ss1.7-7)、对比例7(ss1.7-8)、实施例2(ss1.7-9)、对比例4(ss2.1-7)、对比例5(ss2.1-8)及实施例1(ss2.1-9)；
49.图4为ph 9共折叠大豆分离蛋白/虫胶的不同质量比
‑‑‑‑
对比例2(ss1.3)、对比例3(ss1.5)、实施例2(ss1.7)、实施例1(ss2.1)、实施例3(ss2.5)，对冷凝胶质构特性(a)、持水性及溶胀率(b)的影响；
50.图5为ph 9共折叠大豆分离蛋白/虫胶的不同质量比
‑‑‑
对比例2(ss1.3)、对比例3
(ss1.5)、实施例2(ss1.7)、实施例1(ss2.1)、实施例3(ss2.5)，对冷凝胶在应变变化下冷凝胶的损耗模量g”及储存模量g’的影响；
51.图6为ph 9共折叠不同大豆分离蛋白/虫胶质量比冷凝胶的电镜扫描图；
52.图6中：a-f为500μm下质量比分别为1.3(对比例2)，1.5(对比例3)，1.7(实施例2)，2.1(实施例1)，2.5(实施例3)，空白对比例(control)的凝胶微观结构；a-f为相应的100μm下微观结构；
53.图7体外模拟消化ph 9共折叠的大豆分离蛋白/虫胶冷凝胶
‑‑‑‑
空白对比例(conrol)、对比例2(ss1.3)、对比例3(ss1.5)、实施例2(ss1.7)、实施例1(ss2.1)、实施例3(ss2.5)，水解度的变化。
具体实施方式
54.下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
55.本发明中，搅拌的转速为500
±
50rpm。
56.实施例1、一种共折叠制备大豆分离蛋白/虫胶冷凝胶(即，虫胶共折叠大豆分离蛋白冷凝胶)的方法，依次进行以下步骤：
57.1)、向12g大豆分离蛋白中加入88g纯化水，磁力搅拌器搅拌2h后，于温度为4℃的冰箱中静置保存12～15h，水合以使得大豆分离蛋白完全水解，得到质量浓度为12％的大豆分离蛋白水溶液；
58.2)、向12g虫胶中加入88g纯化水，并调节ph值为8(采用浓度为2％的naoh溶液进行调节)，于50℃的保温条件下持续磁力搅拌至虫胶溶解(搅拌时间约为4h)，得到质量浓度12％、且ph为8的虫胶水溶液。
59.3)、按照大豆分离蛋白：虫胶＝2.1的质量比(即，大豆分离蛋白：虫胶＝2.1：1的质量比)，将大豆分离蛋白水溶液及虫胶水溶液混合，调节共混液ph值为12(采用浓度为2％的naoh溶液进行调节)，在室温下持续电动搅拌反应2h，以实现大豆分离蛋白质与虫胶的完全展开；反应结束后(设定反应时间到达后)，先利用1m的hcl溶液调节(回调)反应后溶液的ph为9，再4800g离心处理15min(离心的目的为了脱气)，得到凝胶预溶液；
60.4)、将凝胶预溶液置于温度为4℃的冰箱中静置保存15h，得到大豆分离蛋白虫胶共折叠冷凝胶。
61.将步骤3)得到的凝胶预溶液超滤离心(利用分子量截断为3kda的超滤离心管重复离心2次，转速为4000
×
g离心15分钟)除去未反应虫胶或盐离子，收集离心后超滤离心管内管溶液，冻干后得到的共折叠物用于改性蛋白性质的测定。
62.大豆分离蛋白虫胶共折叠物及共折叠凝胶性质的测定方法如下：
63.下述一～三针对共折叠物进行测定：
64.一、十二烷基硫酸钠-聚丙烯凝胶电泳：
65.按照中国药典附录v中sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行实验，还原电泳与非还原电泳为添加0.15mlβ-巯基乙醇与不添加加β-巯基乙醇：
66.浓缩胶和分离胶的浓度分别为5％与10％，选择分子量分布为14.4～250kda范围的marker进行sds-page电泳试验，其中共折叠物样品中添加β-巯基乙醇用于进行还原型电
泳试验，未添加β-巯基乙醇用于进行非还原型电泳试验。
67.二、共折叠物傅里叶红外光谱的测定
68.使用傅里叶红外光谱仪对共折叠物红外光谱分析。扫描参数如下：波长范围600-3500cm-1
，分辨率为4cm-1
，每个样品进行32次扫描。
69.三、共折叠物荧光光谱的测定
70.利用磷酸盐缓冲溶液(0.1mol/l，ph为7)配置浓度为1mg/ml的共折叠物溶液。以蛋白分子内色氨酸等发色基团为探针，在激发波长为295nm，发射波长为300-450nm，激发和发射狭缝宽分别为2.5nm。
71.四、大豆分离蛋白/虫胶共折叠冷凝胶质构特性的测定
72.使用rapid ta,tengba质构分析仪，p/50探针的测定共折叠ph 9时形成凝胶(即，步骤4)所得的大豆分离蛋白虫胶共折叠冷凝胶)的凝胶强度。在高度和内径分别为55mm和35mm的玻璃烧杯中形成凝胶。测定最大穿透力，定义为使凝胶破裂所需的力，表示为凝胶硬度。测试速度为0.5mm/s.
73.五、大豆分离蛋白/虫胶共折叠冷凝胶持水性及溶胀性的测定
74.持水性：将ph9共折叠凝胶(即，步骤4)所得的大豆分离蛋白虫胶共折叠冷凝胶)置于5ml离心管中，于14000
×
g离心20min。用注射器小心吸取游离出的水分，利用滤纸擦去残留水分，按下式计算持水性(whc)：
[0075][0076]
式中
‑‑
w1为离心前凝胶与离心管总重-g
[0077]
w2为离心后凝胶与离心管总重-g
[0078]
溶胀性：将3g ph 9共折叠凝胶浸于80ml纯化水中12h，而后取出小心擦干凝胶表明水分，称重，按下式计算溶胀性(sr)：
[0079][0080]
式中—m1为原始凝胶重量
[0081]
m2为溶胀后凝胶重量
[0082]
六、大豆分离蛋白/虫胶共折叠冷凝胶流变性的测定
[0083]
利用haake mars 3赛默飞流变仪测定ph9共折叠冷凝胶的流变性。选择间距为1mm，直径为40mm的平板，应变测试固定频率为1hz，温度为25℃。
[0084]
七、大豆分离蛋白/虫胶共折叠冷凝胶微观结构的观察
[0085]
ph9共折叠冷凝胶冷冻干燥后喷金于3kv加速电压下利用日立扫描电子显微镜观察。
[0086]
八、大豆分离蛋白/虫胶共折叠冷凝胶体外模拟消化中水解度的测定
[0087]
将所有ph9共折叠冷凝胶调整到相同的蛋白质浓度并切成3mm
×
3mm块状。然后将它们与等体积的模拟胃液溶液(2000u/ml胃蛋白酶)混合，调节胃相模拟液的ph值为3。将混合物在37℃、170rpm水浴中消化2h。肠消化阶段，将胃消化物ph值调节至7.0，与等体积的模拟肠液溶液(100u/ml胰酶)混合，相同条件继续消化2h。而后肠相食糜以10,000
×
g离心20min，用邻苯二甲醛法测定上清液，计算蛋白质水凝胶的水解度。
[0088]
实施例2：
[0089]
将实施例1步骤3)中大豆分离蛋白：虫胶的质量比改成1.7；其余等同于实施例1。
[0090]
实施例3：
[0091]
将实施例1步骤3)中大豆分离蛋白：虫胶的质量比改成2.5；其余等同于实施例1。
[0092]
对比例1：
[0093]
将实施例1步骤3)中大豆分离蛋白：虫胶的质量比改成1；其余等同于实施例1。
[0094]
对比例2：
[0095]
将实施例1步骤3)中大豆分离蛋白：虫胶的质量比改成1.3；其余等同于实施例1。
[0096]
对比例3：
[0097]
将实施例1步骤3)中大豆分离蛋白：虫胶的质量比改成1.5；其余等同于实施例1。
[0098]
空白对比例、取消虫胶的使用：
[0099]
取消步骤2)，且实施例1步骤3)中的“虫胶水溶液”不进行添加；其余等同于实施例1。
[0100]
对比例4：
[0101]
将实施例1步骤3)中的回调ph值由9改成7；其余等同于实施例1。
[0102]
对比例5：
[0103]
将实施例1步骤3)中的回调ph值由9改成8；其余等同于实施例1。
[0104]
对比例6：
[0105]
将实施例1步骤3)中大豆分离蛋白：虫胶的质量比改成1.7，且ph回调值改为7；其余等同于实施例1。
[0106]
对比例7：将实施例1步骤3)中大豆分离蛋白：虫胶的质量比改成1.7，且ph回调值改为8；其余等同于实施例1。
[0107]
对比例8：取消步骤3中ph值的回调。虫胶的用量保持不变；其余等同于实施例1。
[0108]
上述案例的实验结果如下：
[0109]
1、sds-page凝胶电泳
[0110]
将实施例1～实施例3、对比例1～对比例3、空白对比例所得的共折叠物，进行sds-page凝胶电泳，所得结果如图1(a)和图1(b)；
[0111]
从图1(a)可以看出，在还原条件下(用β-巯基乙醇)，实施例1～实施例3、对比例1～对比例3的共折叠物在分离凝胶顶部有较大分子量的蛋白质积累，但空白对比例中并不存在。相反，从图1(b)可以看出，在非还原电泳时，空白对比例中存在大分子量的堆积。在还原及非还原条件下，空白对比例的差异表明在ph偏移处理期间蛋白质聚集体中形成了s-s键。共折叠物的高分子量聚集体同时显示在图1(a)和图1(b)中，说明虫胶参与了大豆分离蛋白的折叠，在ph为9的折叠条件下，虫胶与蛋白质发生交联，形成大分子蛋白质聚集体。
[0112]
将对比例4～对比例7所得的共折叠物，进行sds-page凝胶电泳，所得结果如图1(c):
[0113]
不同折叠ph值对共折叠物的交联影响显著，图1(c)中ph为7或8时，在还原条件下对比例4～7中均无蛋白大分子的累积，对应非还原电泳中形成大分子量的累积，说明低于ph9时形成的共聚物聚集体仅由蛋白质间二硫键参与构建，无共价键的形成。
[0114]
2.傅里叶红外光谱分析
[0115]
图2(a)显示：当共折叠物的折叠ph为9时，与大豆分离蛋白相比，空白对比例(control)中还包含一个983cm-1
处的特征峰，且其于1600-1700cm-1
处的吸光值增加，说明ph偏移对蛋白结构产生影响；与虫胶共折叠后(实施例1与3)，相同波长处吸光度显著下降。实施例1与对比例8相比，于1658cm-1
处特征峰，在对比例8中为1673cm-1
，说明大豆分离蛋白与虫胶间不是简单混合，而是在蛋白结构上的相互作用。
[0116]
图2(b)显示：空白对比例(control)在酰胺ⅰ处的吸光度较大豆分离蛋白有所增加；与虫胶共折叠后，实施例1-3(ss2.1、ss1.7、ss2.5)及对比例2、3中吸光度显着下降并且与空白对比例(control)相比，于1650cm-1
处的特征吸收峰红移至1658cm-1
，1538cm-1
特征峰从红移至1544-1552cm-1
(图2b)，表明共折叠物的二级结构发生了变化，大豆分离蛋白的酰胺基团-nh2与虫胶的羧酸酯基团发生相互作用。其中对比实施例中较高浓度的虫胶显着降低了β-折叠的含量。一般来说，β-折叠含量越高，凝胶性能越好。
[0117]
图2(c)显示：在对比例4(ss2.1-7)和对比例5(ss2.1-8)中，2927cm-1
、2858cm-1
、1654cm-1
处的吸收峰强度显着高于实施例1(ss2.1-9)，特征吸收峰从2858cm-1
蓝移到2856cm-1
，实施例1中的特征吸收峰强度显著低于实施例2(ss1.7-9)。实施例2中3290cm-1
处的吸光度高于对比例6(ss1.7-7)和对比例7(ss1.7-8)，表明氢键在共折叠物的形成。当ph值降低时，大豆分离蛋白和虫胶发生共折叠，红外光谱的变化表明ph值的变化显着影响蛋白质的展开，以及与虫胶的共折叠。
[0118]
3.荧光光谱分析
[0119]
图3a/b显示了不同质量比的大豆分离蛋白/虫胶及共折叠ph对共折叠物荧光光谱的影响。在ph从12变为9时大豆分离蛋白特征吸收峰的强度增加，并且大豆分离蛋白的最大发射波长显着红移，这表明在ph 12展开后蛋白质构象发生了变化，并且在ph 9下进行的共折叠导致蛋白质部分结构的改变，即暴露于极性溶剂中
‑‑
空白对比例(control)。此外，与空白对比例(control)相比，虫胶含量显着改变了大豆分离蛋白的三级结构和侧链氨基酸。实施例1、实施例2及实施例3的荧光强度显著降低，说明大豆分离蛋白与虫胶相互作用形成复合物，表现为明显的荧光猝灭。此外，实施例1、实施例2及实施例3的λ
max
从351nm(对比实施例5)逐渐红移到357nm，表明更多的侧链暴露在缓冲溶液中。与对比实施例3和4相比，实施例1中最大吸收峰发生红移以及荧光强度的降低，说明共折叠ph对蛋白三级结构的影响显著。
[0120]
图3b中实施例1中蛋白的荧光强度显著低于对比例4、对比例5，实施例2中蛋白的荧光强度显著低于对比例6、对比例7，表明共折叠ph对蛋白构象的变化影响显著，在ph 9的条件下共折叠导致复合物的形成，与侧链氨基酸结合后荧光强度降低。
[0121]
4.蛋白冷凝胶特性、溶胀性与持水性
[0122]
将对比例2(ss1.3)、对比例3(ss1.5)、实施例2(ss1.7)、实施例1(ss2.1)、实施例3(ss2.5)所得的冷凝胶进行检测。
[0123]
从而获得ph 9共折叠大豆分离蛋白/虫胶的不同质量比对冷凝胶质构特性(a)、持水性及溶胀率(b)的影响；如图4所述。
[0124]
实施例1中凝胶硬度高于实施例3，显著高于对比例2与3。说明大豆分离蛋白含量的增加对凝胶的硬度有积极影响。仅由大豆分离蛋白经ph值从12变化为9时，无法形成可用于测定硬度的冷凝胶，因此，大豆分离蛋白与虫胶的共折叠是诱导冷凝胶形成的主要原因。
实施例1中凝胶硬度最大，峰值为23.57
±
1.09g，这与大豆分离蛋白和虫胶在共折叠时，蛋白质构象、结构的变化有关。内聚性代表了凝胶内部结构的稳定性，表现为与硬度变化一致的趋势。
[0125]
持水性与凝胶的质地和结构有关，实施例1、2、3的凝胶持水性显著高于对比2与3，这是由于参与构建凝胶网络的蛋白质分子的增加。在凝胶的应用过程中，其溶胀稳定性越好，其机械性能可能会提高。对比例2、3的凝胶溶胀率显著高于实施例1、2、3，即，对比例2、3的凝胶溶胀稳定性显著低于实施例1、2、3，这与凝胶的内部结构有关，表明大豆分离蛋白和虫胶之间的交联导致溶胀显着减少。凝胶中形成稳定的网络，凝胶吸水能力降低。说明实施例1及实施例2中的大豆分离蛋白/虫胶质量比更适合制备冷凝胶。
[0126]
5.蛋白冷凝胶的流变性测定
[0127]
图4与图5表明实施例1-3及对比实施例2、3的冷凝胶硬度与流变性的变化成对应关系。由图5可知，随着应变的变化，储能模量(g')减小，损耗模量(g”)增加，而后交叉。当应变的变化超过交叉点后，凝胶的内部结构将被破坏，凝胶将呈现为液体。交叉点前的g’反映了凝胶的弹性和刚度，所有实施例1-3及对比例2、3的g'均高于g”(g'》g”)，但实施例1与3中g'和g”高于其他实施例，说明其凝胶性能更好。
[0128]
6.蛋白冷凝胶的微观结构
[0129]
通过扫描电子显微镜观察实施例方案得到的冷凝胶的微观结构如图6所示。冷凝胶具有三维多孔结构，凝胶中的小孔可能有助于生物活性成分的荷载。实施例1、2、3中冷凝胶表现为均匀、规则和紧凑的多孔结构，特别是实施例1中凝胶的孔径更小。但空白对比例(control)呈现不规则多孔的无序片状结构(图6f)，表明大豆分离蛋白和虫胶结构折叠促进了冷凝胶的形成。
[0130]
图中显示：对比例2、对比例3对于实施例1～3的缺陷是三维孔隙的完整程度不佳。
[0131]
7.体外消化后共折叠凝胶的水解度
[0132]
实施例1～3及对比例2～3得到的冷凝胶在体外模拟消化中的水解度变化如图7所示。实施例1、2、3在肠道消化过程中表现出显着高于对比空白对比例(control)的dh％，但在胃消化过程中不显着。这可能是因为虫胶的结合位点位于大豆分离蛋白中的疏水位置，这在空间上减少了消化酶的可接近位点，因此在消化过程中大豆分离蛋白的稳定性得到了增强。另一个可能的原因是通过与虫胶共折叠，引起大豆分离蛋白构象的变化，导致紧凑结构的产生，使其难以被消化酶水解。这表明实施例1得到的冷凝胶可以延迟体外消化过程中的蛋白质水解程度。
[0133]
综上，将本发明所得的虫胶共折叠大豆分离蛋白冷凝胶按照常规的凝胶质构测定及体外模拟胃肠消化法进行检测，所得结果为硬度为23.57g，持水性》90％，且其体外模拟胃肠消化水解度低于大豆分离蛋白，因此证明其具有适宜敏感活性成分递送的用途/功能。
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最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。