一种治疗癌症的细菌组合物

1.本发明涉及包括一种或几种特定厌氧菌种的细菌组合物，其用于治疗或预防特定癌症类型的复发。


背景技术：

2.检查点抑制剂抗体可以导致对癌症的持久保护性免疫应答，尽管如此，大多数患者不能对免疫疗法治疗方案作出应答。例如，抗pd1、抗pdl1和/或抗ctla4单克隆抗体仅在至多一半的黑素瘤患者中有效，仅在约4
–
5％的转移性结肠直肠癌(crc)患者中有效。此外，这些药物可诱导严重的、偶尔威胁生命的副作用。
3.肠道微生物群近期已通过激活抗肿瘤反应而作为免疫治疗和化疗剂的调节剂出现。以梭菌目细菌(包括产丁酸的种)减少为特征的生物失调的肠道微生物群已经与crc和其他疾病的发病率增加相关。然而，目前几乎没有方法可以改善不平衡的肠道微生物组的有害影响。已经使用干预手段如抗生素、益生元、益生菌和粪便移植物来解决这个问题，但是每种干预手段都有特定的限制和可能的副作用。
4.基于上述现有技术，本发明的目的是提供用于癌症治疗的改进的方法和组合物。该目的通过本说明书的独立权利要求的主题来实现。
5.本文所述的研究表明，递送在健康肠而非crc患者中富集的梭菌目细菌菌群足以引发抗肿瘤免疫应答，代表了用于治疗实体瘤的潜在治疗方法。口服施用定义的丁酸产生细菌的菌群或单一菌株可以通过诱导肿瘤特异性浸润和cd8 t细胞的活化而在体内预防和治疗癌症。在直接比较中，在结肠直肠癌和黑素瘤的鼠模型中，细菌、或细菌和抗pd-1的组合优于抗pd1，并因此可以构成使用细菌作为独立疗法或与检查点调节剂或其它癌症免疫疗法形式组合治疗实体瘤的新治疗方法。


技术实现要素：

6.在一方面，本发明提供了一种分离的细菌组合物，其包括选自厌氧棒杆菌属(anaerostipes)和/或罗斯拜瑞氏菌属(roseburia)的一或更多个属的细菌，或由其组成，用作癌症的治疗或预防。
7.根据本发明的用于治疗或预防癌症复发的细菌组合物在治疗上皮细胞衍生的肿瘤中特别有用，特别是选自肺、乳腺、脑、前列腺、脾、胰腺、胆道、宫颈、卵巢、头和颈、食管、胃、肝、皮肤、肾、骨、睾丸、小肠、结肠或直肠癌(crc)或膀胱癌、黑素瘤或非黑素瘤皮肤癌或肉瘤的癌症。
8.另一方面，本发明涉及用于治疗或预防癌症复发的组合药物，其包括如本文所述的细菌组合物和抗肿瘤治疗，特别是包括细菌组合物和癌症化疗药物，或如本文提供的细菌组合物和癌症免疫治疗药物的组合药物。
4)、匹地利珠单抗(cas号1036730-42-3)、阿替利珠单抗(roche ag；cas号1380723-44-3)、阿维鲁单抗(avluka；cas号1537032-82-8)、度伐利尤单抗(astra zenaca，cas号1428935-60-7)、和/或西米普利单抗(sanofi aventis；cas号1801342-60-8)。
20.在本说明书的上下文中，术语检查点激动剂或检查点激动剂抗体意在进一步涵盖癌症免疫治疗剂，特别是但不限于能够增强免疫细胞活化信号传导级联的抗体(或抗体样分子)。术语检查点激动剂还涵盖细胞因子、重组免疫刺激蛋白、疫苗、佐剂和促进免疫活化的激动剂抗体。已知刺激免疫细胞活化的细胞因子的非限制性实例包括il-12、il-2、il-15、il-21和干扰素-α。术语检查点激动剂或检查点激动剂抗体包括但不限于针对cd122(uniprot p14784)和cd137(4-1bb；uniprot q07011)、icos(uniprot q9y6w8)、ox40(gp34，uniprot p43489)、和/或cd40(uniprot p25942)的抗体。
21.在某些实施方案中，术语癌症免疫疗法意在涵盖免疫细胞转移癌症治疗，其中患者的免疫细胞在输注回患者体内以抑制肿瘤性疾病之前，在体外活化或扩增、和/或例如通过添加嵌合抗原受体进行遗传修饰。免疫细胞转移疗法的非限制性实例包括嵌合抗原受体t淋巴细胞和自体活化的t细胞或树突细胞。
22.如本文所用，术语细菌组合物，与分离的细菌组合物同义，是指细菌的制剂，任选地与药学上可接受的载体一起。细菌组合物可以通过例如在细菌发酵罐中生长的方法来制造，并且细菌组合物的制造方法可以包括洗涤、浓缩、过滤、封装、冻干、干燥、乳化步骤或其它工艺。制造工艺中所用的产品，例如培养物或洗涤介质，或痕量的此类产品，可形成细菌组合物的一部分。所述组合物可以是各种形式，包括但不限于颗粒、粉末、乳剂、悬浮液、溶液、凝胶、皮肤吸收系统、胶囊或片剂。细菌组合物可以包含在食品中，其可以任选地包含其他营养物或益生元，例如膳食纤维。
23.如本文所用，术语药学上可接受的载体包括任何溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗真菌剂、或抗菌剂，条件是选择抗菌剂或以防止抑制组成细菌的生长、植入或活力的方式与细菌制剂组合，或抗菌剂不存在于需要不存在此类试剂的本发明的实施方案中)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物稳定剂、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料等及其组合，如本领域技术人员已知的(参见，例如，remington:the science and practice of pharmacy,isbn 0857110624)。
24.如本文所用，术语治疗或治疗任何疾病或病症(例如癌症)在一个实施方案中是指改善疾病或病症(例如减缓或阻止或减少疾病或其至少一种临床症状的发展)。在另一个实施方案中，“治疗”或“治疗”是指减轻或改善至少一种身体参数，包括患者可能无法辨别的那些。在另一个实施方案中，“治疗”或“治疗”是指在身体上(例如，可辨别症状的稳定化)、在生理上(例如，身体参数的稳定化)、或在两者上调节疾病或病症。除非下文具体描述，否则评估疾病的治疗和/或预防的方法通常是本领域已知的。
25.本发明的一个方面涉及用于治疗癌症或用于预防癌症复发的细菌组合物。本发明的组合物包括一或更多种细菌厌氧棒杆菌属和/或罗斯拜瑞氏菌属，或在某些实施方案中由其组成。
26.在某些特定实施方案中，用于治疗或预防癌症复发的细菌组合物由仅属于厌氧棒杆菌属和/或罗斯拜瑞氏菌属的细菌组成。术语“由
……
组成”在此上下文中仅关于细菌类型是排他性的，其涉及细菌的存在，换句话说，不存在可检测量的不属于任一属的细菌。然
而，组合物可以含有赋形剂、当其被施用于结肠时细菌在其上生长或用作细菌底物的物质或其它成分。
27.在某些特定实施方案中，用于治疗或预防癌症复发的细菌组合物仅包括厌氧棒杆菌属的细菌，换句话说，就细菌含量而言，组合物由厌氧棒杆菌属的细菌组成。
28.实施例中的数据显示，与先前显示在结肠直肠癌患者中减少的不同丁酸产生细菌的混合物相比，单独厌氧棒杆菌属的制剂可以提供相等或更好的针对癌症进展的保护。
29.在某些特定实施方案中，用于治疗或预防癌症复发的细菌组合物仅包括罗斯拜瑞氏菌属的细菌，换句话说，就细菌含量而言，组合物由罗斯拜瑞氏菌属的细菌组成。
30.实施例中的数据显示，与先前显示在结肠直肠癌患者中减少的不同丁酸产生细菌的混合物相比，单独罗斯拜瑞氏菌属的制剂可以提供相等或更好的针对癌症进展的保护。
31.在某些特定实施方案中，用于治疗或预防癌症复发的细菌组合物仅包括厌氧棒杆菌属、和罗斯拜瑞氏菌属的细菌。
32.在某些特定实施方案中，用于治疗或预防癌症复发的细菌组合物包括，选自肠道罗斯拜瑞氏菌、人罗斯拜瑞氏菌、粪便罗斯拜瑞氏菌、食葡糖罗斯拜瑞氏菌、盲肠罗斯拜瑞氏菌、粪厌氧棒杆菌、丁酸厌氧棒杆菌、鼠李糖厌氧棒杆菌和/或庞大厌氧棒杆菌的一或更多种细菌种，或在某些实施方案中由其组成。
33.在某些特定实施方案中，用于治疗或预防癌症复发的细菌组合物包括，选自肠道罗斯拜瑞氏菌、人罗斯拜瑞氏菌、粪便罗斯拜瑞氏菌、食葡糖罗斯拜瑞氏菌、盲肠罗斯拜瑞氏菌、粪厌氧棒杆菌、丁酸厌氧棒杆菌、鼠李糖厌氧棒杆菌和/或庞大厌氧棒杆菌的一或二种细菌种，或在某些实施方案中由其组成。
34.在某些特定实施方案中，用于治疗或预防癌症复发的细菌组合物包括，或在某些实施方案中由其组成：
35.–
肠道罗斯拜瑞氏菌、人罗斯拜瑞氏菌、粪便罗斯拜瑞氏菌、食葡糖罗斯拜瑞氏菌、和/或盲肠罗斯拜瑞氏菌菌种的细菌，
36.以及
37.–
粪厌氧棒杆菌、丁酸厌氧棒杆菌、鼠李糖厌氧棒杆菌和/或庞大厌氧棒杆菌菌种的细菌。
38.实施例中的数据显示，与护理标准的化疗和免疫疗法抗肿瘤剂相比，包括肠道罗斯拜瑞氏菌和粪厌氧棒杆菌的混合物可以提供相等或更好的针对由一系列组织引起的癌症的保护。
39.包括细菌种庞大厌氧棒杆菌、丁酸厌氧棒杆菌、鼠李糖厌氧棒杆菌的制剂预期提供与粪厌氧棒杆菌相似的保护，因为它们是具有相似生态位、表型和系统发生特征的厌氧棒杆菌属的种。
40.包括细菌种人罗斯拜瑞氏菌、粪便罗斯拜瑞氏菌、食葡糖罗斯拜瑞氏菌、和/或盲肠罗斯拜瑞氏菌的制剂预期提供与肠道罗斯拜瑞氏菌相似的保护，因为它们是具有相似生态位、表型和系统发生特征的罗斯拜瑞氏菌属的种。
41.在某些特定实施方案中，用于治疗或预防癌症复发的细菌组合物仅包括粪厌氧棒杆菌种的细菌，换言之，就细菌含量而言，组合物由粪厌氧棒杆菌种的细菌组成。
42.实施例中的数据显示，与先前显示在结肠直肠癌患者中减少的不同丁酸产生细菌
的混合物相比，单独粪厌氧棒杆菌的制剂可以提供相等或更好的针对癌症进展的保护。由细菌种庞大厌氧棒杆菌、丁酸厌氧棒杆菌、或鼠李糖厌氧棒杆菌单独组成的制剂预期提供与粪厌氧棒杆菌相似的保护，因为它们是具有相似生态位、表型和系统发生特征的厌氧棒杆菌属的种。
43.在另一个可能的实施方案中，用于治疗或预防癌症复发的细菌组合物仅包括肠道罗斯拜瑞氏菌种的细菌，换言之，就细菌含量而言，组合物由肠道罗斯拜瑞氏菌种的细菌组成。
44.实施例中的数据显示，与先前显示在结肠直肠癌患者中减少的不同丁酸产生细菌的混合物相比，单独肠道罗斯拜瑞氏菌的制剂可以提供相等或更好的针对癌症进展的保护。由人罗斯拜瑞氏菌、粪便罗斯拜瑞氏菌、食葡糖罗斯拜瑞氏菌、和/或盲肠罗斯拜瑞氏菌的细菌种之一组成的制剂预期提供与肠道罗斯拜瑞氏菌相似的保护，因为它们是具有相似生态位、表型和系统发生特征的罗斯拜瑞氏菌属的种。
45.在某些特定实施方案中，用于治疗或预防癌症复发的细菌组合物包括肠道罗斯拜瑞氏菌dsm14610t和/或粪厌氧棒杆菌dsm14662t菌株，或在某些实施方案中由其组成。
46.实施例中的数据表明，与护理标准的化疗和免疫治疗抗肿瘤剂相比，包括菌株粪厌氧棒杆菌菌株dsm14662t或有时由其组成的制剂可提供相等或更好的针对由一系列组织引起的癌症的保护。包括选自丁酸厌氧棒杆菌dsm22094、鼠李糖厌氧棒杆菌dsm26241、庞大厌氧棒杆菌dsm108065、和/或dsm3319的细菌菌株或由其组成的制剂预期提供相似的保护，因为它们是具有与粪厌氧棒杆菌dsm14662t相似的生态位、表型和系统发生特征的来自厌氧棒杆菌属的菌株。
47.实施例中的数据显示，与护理标准的化疗和免疫治疗抗肿瘤剂相比，包括肠道罗斯拜瑞氏菌菌株dsm14610t或有时由其组成的制剂可提供相等或更好的针对由一系列组织引起的癌症的保护。包括选自人罗斯拜瑞氏菌dsm16839、粪便罗斯拜瑞氏菌dsm16840、食葡糖罗斯拜瑞氏菌dsm108070、和/或盲肠罗斯拜瑞氏菌atcc33874的细菌菌株或由其组成的制剂预期提供相似的保护，因为它们是具有与肠道罗斯拜瑞氏菌dsm14610t相似的生态位、表型和系统发生特征的来自罗斯拜瑞氏菌属的菌株。
48.某些实施方案涉及根据本发明的组合物，其包括一或更多种如上所述的厌氧棒杆菌属和/或罗斯拜瑞氏菌属的细菌属、种或菌株，或在某些实施方案中由其组成，其已从人粪便样品中分离。另一个实施方案涉及从环境样品中获得的本发明的细菌属、种或菌株。
49.分离株可以通过本领域已知的分子生物学技术，例如，评估存在于16s rrna或rpob/基因的一或更多个拷贝中的序列多态性，而被鉴定为厌氧棒杆菌属和/或罗斯拜瑞氏菌属、种或菌株。例如，如果分离物的16s rrna基因序列被确定为分别与已知厌氧棒杆菌属或罗斯拜瑞氏菌属的16s rrna基因序列具有》97％的相似性，或与已知厌氧棒杆菌属或罗斯拜瑞氏菌属菌株16s rrna基因序列具有》99％的相似性(johnson j.s.2010 nat comm.10:5029)，则细菌分离物可以被分类为厌氧棒杆菌属或罗斯拜瑞氏菌属的种、或菌株，如本发明的实施方案中所述。
50.在某些实施方案中，根据本文公开的本发明的任何方面或实施方案的细菌组合物用于治疗癌症，特别是上皮细胞衍生的癌症。可受益于细菌治疗的上皮细胞癌的非排他性列表包括肺、乳腺、脑、前列腺、脾、胰腺、胆道、宫颈、卵巢、头和颈、食管、胃、肝、皮肤、肾、
骨、睾丸、小肠、膀胱、结肠或直肠癌(crc)、皮肤癌、黑素瘤或肉瘤。在一些实施方案中，所述crc具有cpg岛甲基化表型(cimp)。在一些实施方案中，crc是锯齿状瘤。
51.虽然本发明人已经证明了上述细菌组合物在结肠癌、黑素瘤、乳腺癌和肺癌的临床前小鼠模型中的预防和治疗功效，但是本领域技术人员将认识到，该方法可以应用于许多其它上皮细胞衍生的癌症类型。
52.在本发明的一些实施方案中，根据本文公开的本发明的任何方面或实施方案的细菌组合物用于治疗被诊断为或先前已经被诊断为患有实体癌的患者。在一个替代实施方案中，患者被认为处于发展癌症的风险中。
53.在实施方案中，根据本文公开的本发明的任何方面或实施方案的细菌组合物用于治疗被诊断为患有结肠直肠癌(crc)、或非发育异常的锯齿状息肉、或锯齿状隐窝病灶的患者。
54.在某些实施方案中，所述细菌组合物用于治疗源自不是胃肠道的一部分的器官的癌症，特别是所述细菌组合物用于治疗选自肺癌、乳腺癌、或黑素瘤的癌症。
55.在某些实施方案中，将细菌组合物递送至健康受试者以预防癌症。在某些特定实施方案中，将细菌组合物递送至由于遗传或环境风险因素而被认为具有癌症易感性的受试者。在进一步的实施方案中，将细菌组合物施用于先前已被诊断为患有癌症的患者，以便预防疾病的复发。在一些实施方案中，在其它医学干预之后的癌症缓解期内，将细菌组合物施用给患者，所述医学干预包括但不限于化疗、手术或放射治疗。根据本发明的癌症缓解期可以包括一段时间的疾病迹象或症状，例如肿瘤生长减少或肿瘤完全消失。
56.实施例中的数据显示，当在癌症发作之前或之后施用细菌时，包括限定的梭菌目细菌的菌群或单一菌株的制剂可限制不同类型的肿瘤生长。
57.在某些实施方案中，用于治疗或预防癌症复发的细菌组合物由分离的活细菌组成。本文中的“分离的”是指不是粪便移植物的一部分，但通过从天然来源分离或离析细菌(和任选地，培养它们)而产生的细菌。
58.可以设想，在具体实施方案中，包含在组合物中的细菌菌株是活的，或当它们到达受试者的肠时呈活孢子的形式。所述组合物可以包括冻干细菌的混合物，或冻干单一菌株，其与药学上可接受的载体组合。应理解，细菌组合物也可含有活细菌和一定百分比的死细菌或非活孢子的混合物。
59.实施例中的数据证明了以活培养物或冻干细菌形式施用的梭菌目菌株肠道罗斯拜瑞氏菌和粪厌氧棒杆菌在癌症模型中用作抑制肿瘤生长的治疗功效。
60.在一个替代实施方案中，用于治疗或预防癌症复发的细菌组合物由热杀死细菌、或衍生自本发明所述细菌的细胞组分或代谢物组成。
61.在一个具体实施方案中，用于治疗或预防癌症复发的细菌组合物不含粪便物。换句话说，所述组合物含有在工业环境中生产的分离的细菌菌株，而不是从人粪便样品中分离或培养的细菌菌株。
62.在一些实施方案中，受试者在准备施用用于治疗或预防癌症复发的细菌组合物时或之前在医学相关窗口内(例如，在治疗之前的一个月内)不接受任何抗菌剂。或者，在其它实施方案中，在施用细菌组合物的制备中和之前，用抗菌剂治疗受试者。
63.在本领域已知的粪便微生物群移植的临床试验中，抗菌预治疗通常用于从肠中除
去某些细菌种，为治疗性细菌提供定植生态位、抑制免疫抑制个体中的感染、或治疗感染性疾病。可用于这些目的被施用的抗生素的实例包括但不限于卡那霉素、庆大霉素、粘菌素、甲硝唑、万古霉素、克林霉素、非达霉素、和/或头孢哌酮。应理解，抗菌剂也可以与细菌组合物同时递送。
64.实施例中的数据显示，在用或不用抗菌剂预先治疗的情况下，根据本发明的细菌组合物在crc模型中抑制肿瘤生长至相似的程度。
65.另一个实施方案涉及根据本发明的细菌制剂的用途，用于在施用检查点抑制剂抗体之前、同时或之后的医学相关窗口内的患者。在特定实施方案中，提供了根据本发明的这方面的细菌制剂的肠内施用，与检查点抑制剂抗体的胃肠外施用一起，用于已经被诊断为患有可能或显示对单独使用任一药物的治疗具有抗性的癌症的患者。在特定实施方案中，细菌施用予已接受、正在接受或不久将接受抗pd-1或抗pd-l1检查点抑制剂抗体的患者。
66.在一个这样的实施方案中，提供了根据本发明的细菌制剂和如上所述的检查点抑制剂抗体，用于被诊断为患有特征在于对检查点抑制剂抗体治疗具有抗性或缺乏响应的肿瘤的患者。具体实施方案涉及用于被诊断为患有转移性结肠癌的患者的根据本发明的细菌制剂和如上所述的检查点抑制剂抗体，因为该癌症的特征在于对检查点抑制剂抗体治疗的抗性。
67.在另一个这样的实施方案中，提供了根据本发明的细菌制剂和如上所述的检查点抑制剂抗体，用于被诊断为患有特征在于对如根据本发明第一方面所述的包括罗斯拜瑞氏菌属和/或厌氧棒杆菌属的细菌组合物具有抗性或缺乏响应的肿瘤的患者。
68.在本说明书的上下文中，术语“无反应”是指治疗后一或更多个临床参数没有改善，例如，肿瘤大小、生长速率、或扩散，没有降低。缺乏反应包括基于患者或受试者中先前治疗结果的观察，基于特定肿瘤类型的临床知识的一般分类，例如转移性结肠癌患者对免疫疗法的已知差(《5％)反应率，或如使用患者肿瘤细胞的体外测定所定义的缺乏反应。
69.实施例中的数据显示，用包括作为丁酸产生菌株混合物的一部分的肠道罗斯拜瑞氏菌和粪厌氧棒杆菌的细菌组合物口服治疗联合抗pd1抗体注射，可以提供比单独抗pd1抗体治疗更好的抗结肠癌保护。实施例的图8中的数据显示，包括抗pd1抗体和细菌两者一起的组合药物可在对任一种单独治疗均无响应的治疗抗性黑素瘤模型中提供出乎意料的治疗益处。
70.在一些实施方式中，提供细菌组合物用于患者，其肿瘤已被确定为特征在于浸润性免疫细胞(如自然杀伤(nk)细胞、nkt细胞、或t细胞，特别是细胞毒性cd8 t细胞)的缺乏。免疫浸润的缺乏或不存在可以通过本领域已知的方法鉴定，包括但不限于用免疫标志物如cd3或cd45的免疫组织化学染色，并且可以包括其中免疫浸润是肿瘤周围而不是肿瘤组织内的样品(hendry 2017 adv.anat.pathol.24(6):311)。低数量的免疫浸润可以定义为，例如，在肿瘤微阵列载玻片切片上计数到1000个以下或500个以下的cd3阳性细胞。在某些实施方案中，提供细菌组合物用于这样的受试者中以便增加或诱导对癌症的免疫应答。换句话说，提供细菌组合物用于其肿瘤已被确定为特征在于没有或有限的免疫细胞浸润的患者。这些免疫细胞被认为是对于杀死肿瘤细胞并因此抑制肿瘤生长和扩散最重要的那些。
71.实施例中的数据显示，包括细菌种肠道罗斯拜瑞氏菌和粪厌氧棒杆菌或由其组成
的细菌组合物可以增加免疫细胞的数目和/或活化状态。在肿瘤组织和淋巴器官(如脾)两者之中都观察到接受细菌组合物的癌症受试者中这种增加的免疫应答，并且大于施用护理标准抗肿瘤药氟尿嘧啶或免疫疗法后观察到的免疫应答。
72.在一个实施方案中，用于治疗或预防癌症复发的细菌组合物在没有预先、同时或随后施用抗肿瘤癌症治疗的情况下施用。换句话说，受试者接受细菌组合物，而没有任何其他额外的癌症预防性或治疗性治疗。在这个意义上，治疗性治疗被理解为包括检查点抑制剂，特别是检查点抑制剂抗体，以及抗肿瘤化疗剂。
73.实施例中的数据显示，与标准治疗的氟尿嘧啶治疗相比，用包括作为产生丁酸的菌株的混合物的一部分的肠道罗斯拜瑞氏菌和粪厌氧棒杆菌的细菌组合物治疗可以提供相等的癌症抑制，并且比免疫治疗抗肿瘤剂更好地保护免受癌症。
74.本发明的另一组实施方案涉及作为组合药物的一部分的细菌组合物，用于治疗或预防癌症的复发。可以设想，细菌组合物可以同时施用，或与另一种抗肿瘤治疗重叠施用。在一个具体实施方案中，细菌组合物可以作为包括细菌制剂和抗肿瘤剂或治疗的两者的组合药物的组分递送。
75.在一个实施方案中，所述组合药物包括本发明的细菌制剂和抗肿瘤剂，特别是选自5-氟尿嘧啶、卡培他滨、伊立替康、托泊替康、氟尿苷、奥沙利铂、卡铂、顺铂、吉西他滨、紫杉醇、多西他赛、环磷酰胺、异环磷酰胺、曲磷胺、苯丁酸氮芥、美法仑、白消安、卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、达卡巴嗪、丝裂霉素c、甲氨蝶呤、雷替曲塞、6-巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、克拉屈滨、氟达拉滨、长春新碱、长春地辛、博莱霉素、放线菌素d、多柔比星、柔红霉素、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌、依托泊苷、替尼泊苷、羟基脲、和/或丙卡巴肼的细胞毒性化疗。
76.在一个实施方案中，所述组合药物包括本发明的细菌制剂和激素靶向剂，特别是选自亮脯利特、戈舍瑞林、来曲唑、阿那曲唑、依西美坦、他莫昔芬、托瑞米芬、氟维司群、拉帕替尼、帕博西尼、雷洛昔芬、阿那拉唑、曲普瑞林、组氨瑞林、地加瑞克、氟他胺、恩杂鲁胺、阿帕鲁胺、比卡鲁胺、尼鲁米特、阿比特龙、乙酸盐、酮康唑、和/或氨鲁米特的激素靶向剂。
77.在另一个实施方案中，所述组合药物包括根据本发明的细菌制剂、以及检查点抑制剂抗体，特别是选自抗pd-1、抗pd-l1、抗pd-l2、或抗ctla-4的检查点抑制剂抗体。
78.在另一个实施方案中，所述组合药物包括本发明的细菌制剂，以及激活免疫细胞的佐剂、细胞因子、抗体或抗体样分子，特别是检查点激动剂。在更具体的实施方案中，免疫检查点激动剂选自临床上可用的抗体药物阿地白介素(novartis，cas号110942-02-4)、干扰素α-2b(merck，cas号215647-85-1)、咪喹莫特(apotex，cas号99011-02-6)、pf-8600(pfizer)、聚iclc(oncovir，cas号59789-29-6)、卡比利珠单抗(apexigen，1613144-80-1)或乌托鲁单抗(cas号1417318-27-4)。关于开发中的其他相关检查点激动剂的列表，参见sun h.and sun c.,front.immunol.(2019年10月)。
79.在一个实施方案中，组合药物包括根据本发明的细菌制剂、以及检查点激动剂抗体，特别是选自抗cd40、抗ox40、抗lag-3、抗tim3、抗icos、抗tigit或抗vista的检查点激动剂抗体。
80.在另一个实施方案中，所述组合药物包括本发明的细菌制剂、以及免疫细胞转移治疗，特别是选自嵌合抗原受体t细胞、活化的淋巴细胞、或活化的树突细胞的自体细胞转移。
81.实施例中的数据显示，用包括肠道罗斯拜瑞氏菌和粪厌氧棒杆菌一起或作为细菌菌株混合物的一部分的细菌组合物或单独的肠道罗斯拜瑞氏菌的治疗可以增强多方面的受试者对肿瘤的免疫应答。这包括cd8 t细胞和nk细胞浸润到肿瘤组织中，与肿瘤重量或体积的减少相关。为此，设想当与旨在增加受试者对癌症的免疫应答的疗法组合时，细菌组合物在临床结果方面将是最有利的。
82.在一个实施方案中，所述组合药物包括本发明的细菌制剂、以及外科手术。
83.在一个实施方案中，所述组合药物包括本发明的细菌制剂、以及营养补充剂或益生元，特别是选自膳食纤维菊粉、低聚果糖和/或寡糖的营养治疗剂。
84.本发明的另一替代方面涉及包括本发明的细菌制剂和放疗的组合药物。
85.类似地，本发明提供了具有基因治疗形式的细菌制剂的组合。用于核酸转移的基因的实例是肿瘤抑制基因、或激活前药的基因。在另一个实施方案中，制剂可以与设计用于杀死肿瘤细胞的基因工程化的溶瘤病毒一起递送。一个例子是药物t-vec(talimogene laherparepvec)，也称为imlygic(cas号1187560-31-1)。在一些实施方案中，可以使用表达肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的重组形式的细菌、或考虑将已知增强人免疫激活的分子作为基因治疗的类型。
86.本发明还涉及治疗癌症的方法，其中向有需要的患者施用有效量的如本文提供的细菌组合物或组合药物。
87.本发明还包括根据上述任一方面的细菌组合物用于制备治疗或预防癌症复发的药物，所述癌症特别是源自上皮细胞来源的实体瘤。
88.本发明还包括治疗被诊断为患有癌症的患者，特别是被诊断为患有实体上皮细胞来源的肿瘤的患者，或确定处于发展癌症的风险的受试者，例如已经确定具有癌症的遗传易感性的患者，或已经确定具有被认为产生癌症易感性的微生物群的患者的方法，包括向所述患者或受试者施用治疗有效量的根据本文提供的本发明的多方面的细菌组合物。
89.给药途径和剂量
90.根据本发明的细菌组合物的特定治疗有效剂量对于任何特定受试者的水平将取决于多种因素，包括癌症的存在或不存在、所治疗的癌症的类型、癌症的严重性、特定生物体或组合的组合物的活性或活力、施用途径、生物体或组合的组合物的定植或清除速率、治疗的持续时间、与生物体组合使用的药物(若有)、受试者的年龄、体重、性别、饮食、和一般健康状况，以及医学领域和科学中众所周知的类似因素。
91.实施例中的数据显示，当以108–
109个活细菌的剂量每周施用3次时，根据本发明的各种细菌组合物抑制鼠癌症模型中的肿瘤生长。治疗有效剂量水平可以由本领域技术人员通过疾病的动物模型、或参考通过类似的给药途径在人临床试验中递送的活细菌的剂量来确定。
92.在某些特定实施方案中，根据本发明的细菌组合物被配制用于肠内、或局部施用。术语“局部”应理解为是指局部施用，换句话说，直接施用于肿瘤组织。这可以是应用于易接近的肿瘤如皮肤癌形式的乳膏或凝胶形式，或者它也可以应用于使用注射将溶液中的细菌组合物直接递送到实体瘤中。
93.在一组实施方案中，细菌组合物被配制用于口服递送至受试者的小肠或大肠中，其中存在大部分的肠道微生物群。一个这样的实施方案涉及肠溶包衣，保护细菌组合物免
受胃中高ph的影响、并在到达肠时溶解。这种包衣的例子包括但不限于聚合物和共聚物，例如尤特奇(evonik)。
94.在类似的实施方案中，细菌组合物可以以缓冲小袋的形式、或以在肠的特定部分的特定ph范围内溶解的包衣，递送至肠的特定区域。例如，在6.8至7.5的ph范围内分解的制剂有利于递送至结肠(对于靶向递送至胃肠道区域的完整描述，参见villena etal.2015 intj.pharm.487(1
–
2):314
–
9)。
95.在另一个类似的实施方案中，细菌组合物可以通过延时递送方法特异性地施用至肠，其考虑了其通过胃、小肠和结肠所花费的时间。延迟释放制剂包括水凝胶制剂，以及可生物降解的、水溶性的、可水解的或可酶降解的聚合物。适用于延迟释放制剂的包衣材料的实例包括但不限于纤维素基聚合物、丙烯酸聚合物、和乙烯基聚合物。
96.在另一个实施方案中，其中细菌组合物被配制用于递送至结肠，制剂包括涂层，其可以通过人肠中存在的酶例如碳水化合物还原酶除去。酶敏感涂层的实例包括直链淀粉、黄原胶和偶氮聚合物。
97.在某些实施方案中，细菌组合物可以通过管口插管、或通过外科手术靶向特定部位。
98.在涉及本发明化合物的局部用途的本发明实施方案中，以适于局部给药的方式配制药物组合物，例如水溶液、悬浮液、软膏、乳膏、凝胶或可喷雾制剂，例如用于通过气雾剂等递送，包括活性成分以及本领域技术人员已知的增溶剂、稳定剂、张力增强剂、缓冲剂和防腐剂中的一或更多种一起。
99.在涉及直肠给药的本发明实施方案中，细菌组合物可以配制成栓剂、灌肠剂或作为内窥镜或结肠镜检查程序的一部分递送。
100.在本文将单个可分离特征的替代物，例如细菌种或菌株、癌症类型或共同施用的癌症药物，作为“实施方案”列出的任何地方，都应理解，此类替代物可自由组合以形成本文所公开的本发明的离散实施方案。
101.通过以下实施例和附图进一步说明本发明，从这些实施例和附图中可以得到进一步的实施方案和优点。这些实施例用于说明本发明，而不是限制其范围。
附图说明
102.时程分析显示通过双因素方差分析(anova)分析的平均值
±
平均值的标准误差(sem)，其中dunnett’s检验后校正用于多重比较。柱状图显示两组比较的mann-whitney检验的、或多重比较的具有dunn’s校正的kruskal-wallis检验分析的，平均值
±
sem。*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.001。
103.图1显示在用或不用抗生素治疗的c57bl6小鼠模型中，用梭菌目细菌四混合的治疗诱导mc38结肠癌肿瘤缩小。(a)实验设置：在皮下注射mc-38细胞前，让c57bl6小鼠口服补充四混合3天，用或不用抗生素(abx)预治疗。在一周和两周后重复用细菌经口管饲，每次连续3天。(b)在实验过程中测量的口服灌胃盐水或四混合的c57bl6小鼠中皮下mc38肿瘤大小的定量。柱状图显示在第17天对照和bp治疗小鼠的(c)肿瘤和(d)脾重量。数据代表二或更多个独立实验。
104.图2显示用梭菌目细菌四混合治疗通过在c57bl6小鼠中诱导cd8 t细胞来诱导
mc38结肠癌肿瘤缩小。(a)cd8 t细胞耗竭实验的实验设计。在相对于皮下mc-38肿瘤细胞注射的第-3、0、7和14天腹膜内注射抗cd8抗体或同种型对照。(b)在指定的时间点测量皮下肿瘤大小。(c)mc38肿瘤细胞注射后第17天的最终肿瘤重量和(d)在mc-38肿瘤切片的免疫组织化学中cd8 t细胞的定量。数据代表二或更多个独立实验。
105.图3显示在mc38结肠癌模型中用梭菌目细菌四混合治疗比抗pd1治疗更有效。(a)在对照和四混合治疗的小鼠中进行抗pd1实验的实验设置，使用或不使用腹膜内抗pd-1注射。(b)显示在指定天数测量的mc-38皮下肿瘤体积的随时间推移。(c)柱状图显示在第16天测量的mc-38肿瘤体积和(d)重量。数据代表二或更多个独立实验。
106.图4显示用单一梭菌目细菌种四混合治疗诱导mc38结肠癌肿瘤缩小。(a)实验设置：在皮下注射mc-38细胞前，让c57bl6小鼠口服补充四混合3天。在一和两周后重复口服管饲，连续3天。(b)显示在指定天数测量的mc-38皮下肿瘤体积的随时间推移。(c)柱状图显示17天处死时测量的肿瘤体积和(d)肿瘤重量。数据代表二或更多个独立实验。
107.图5显示用四混合或单一梭菌目细菌种治疗在mc38结肠癌模型中展现治疗潜力。在皮下注射mc-38细胞后6天，让c57bl6小鼠中口服补充四混合或指定种3天。一周后重复口服管饲，连续3天。(a)显示在指定天数测量的mc-38皮下肿瘤体积的随时间推移，以及指示通过双因素anova与dunnett氏检验后分析的统计学比较的表。(b)柱状图显示在第15天处死时测量的肿瘤重量。数据代表二或更多个独立实验。
108.图6显示在mc38结肠癌模型中，用梭菌目细菌四混合或肠道罗斯拜瑞氏菌治疗的功效相当于氟尿嘧啶(5-fu)。c57bl6小鼠在皮下注射mc38肿瘤细胞后第6和12天口服管饲pbs、丁酸产生梭菌目细菌(bp)或肠道罗斯拜瑞氏菌的四混合3天。指定组也在第6、9、和12天接受腹膜内注射50mg/kg护理标准化疗5-fu的pbs溶液。(a)显示在指定天数测量的mc-38皮下肿瘤体积的随时间推移。(b)柱状图显示在第15天处死时测量的肿瘤重量。数据代表二或更多个独立实验。
109.图7显示与5-fu相比，在用梭菌目细菌种四混合进行组合治疗之后，脾中抗肿瘤免疫应答增强。在皮下注射mc-38细胞后6天，让c57bl6小鼠中口服补充四混合或指定种3天。如图9所示，一周后重复口服管饲，连续3天。指定组也在第6、9、和12天接受腹膜内注射20mg/kg护理标准化疗5-fu的pbs溶液。柱状图显示在肿瘤生长第15天时通过肿瘤浸润淋巴细胞的流式细胞术测量的对所示免疫激活标志物阳性的细胞的比例。数据代表二或更多个独立实验。
110.图8显示用四混合或单一梭菌目细菌种治疗在b16黑素瘤模型中展现治疗潜力。(a)b16肿瘤在c57bl6小鼠中生长的随时间推移。在皮下注射b16黑素瘤细胞后第6、9和12天，将200mg抗pd-1或对照igg施用于所示组。(b)在皮下注射b16肿瘤细胞后第6和12天，在接受pbs、梭菌目细菌四混合或指定的梭菌目种的口服管饲3天的c57bl6小鼠中测量的肿瘤体积的随时间推移。表总结了b中所示的anova与dunnet’s检验后的结果。数据代表二或更多个独立实验。
111.图9显示用梭菌目菌群(cc)四混合治疗在4t1乳腺癌模型和llc1.1肺癌模型中展现治疗潜力。在皮下注射(a)4t1乳腺癌细胞或(b)llc2肺癌细胞后第6和12天，在接受pbs、或四混合的口服管饲的c57bl6小鼠中测量的肿瘤体积的随时间推移。数据代表二或更多个独立实验。
112.图10显示与pbs对照组相比，在c57bl6小鼠模型中，用二混合的重构冻干肠道罗斯拜瑞氏菌 粪厌氧棒杆菌治疗抑制mc38结肠癌。在皮下注射mc-38细胞后6天开始，每3天口服补充。显示在指定天数测量的mc-38皮下肿瘤体积的随时间推移。
113.实施例
114.方法
115.小鼠
116.wt c57bl/6jrj购自法国janvier labs。所有小鼠保持在无特定病原体的条件下。所有实验使用8
–
12周之间的同窝出生的雄性和雌性。
117.细菌培养和治疗
118.霍氏真杆菌：dsm3353t、普氏栖粪杆菌：dsm17677、肠道罗斯拜瑞氏菌：dsm14610t、粪厌氧棒杆菌：dsm14662t获自苏黎世pharmabiome ag。所有菌株在37℃下在酵母提取物、酪蛋白胨和脂肪酸(ycfa)培养基中培养(lopez etal.2012.appl.environ.microbiol.78,420
–
428)。使用hungate技术将菌株维持在缺氧co2环境下。使用各细菌菌株的等体积两天培养物制备产丁酸细菌的混合物。通过革兰氏染色显微镜检查法和使用高效液相色谱法分析其代谢产物的产生来证实细菌的纯度。使用碘化丙啶染色通过流式细胞术测量来确认细胞的活力。细菌通过口服管饲以108–
109活细菌/ml的浓度200微升体积给药。0.9％nacl用作安慰剂。
119.冻干细菌治疗
120.将冻干的肠道罗斯拜瑞氏菌(106细胞/g)和粪厌氧棒杆菌(109细胞/g)等量混合。在口服管饲补充到小鼠中之前，将1g细菌在1ml水中重构2
–
3分钟。每只小鼠接受200μl细菌混合物。对照小鼠通过口服管饲接受200μl水。
121.抗生素预治疗
122.在开始细菌治疗前一周，除了一周每天管饲抗生素加1g/l甲硝唑之外，小鼠接受补充有1g/l新霉素、0.5g/l万古霉素、1g/l氨苄青霉素、0.2％(w/v)阿斯巴甜的饮用水7天。在抗生素治疗之后和开始细菌治疗之前一天，小鼠接受饮用水中的10％聚乙二醇(peg)3000过夜。
123.肿瘤模型和治疗
124.肿瘤细胞系在37℃下在5％co2中维持在补充有100u/ml青霉素/链霉素和10％热灭活胎牛血清(fcs)的dulbecco’s改良eagle’s培养基中。对于皮下肿瘤模型，将mc38-gfp结肠直肠癌(3
×
105细胞，由苏黎世大学lubor borsig教授惠赠)、b16-gfp黑素瘤细胞(3
×
105细胞，由苏黎世大学医院onur boyman教授惠赠)或lewis肺癌细胞llc1.1(2
×
105细胞，atcc编号crl-1642)悬浮于与基质胶以1:1混合的dmem高葡萄糖细胞培养基中，并皮下注射至胁腹。每3天使用数字校准器测量肿瘤发育。使用椭圆体公式计算肿瘤体积：4/3
×
3.14
×
长度/2
×
(宽度/2)2，其中，较短的维度作为宽度和深度。当其体积达到1cm3或长度达到2cm时，对小鼠实施安乐死。对于细菌的治疗性给药，从第5天和第12天开始连续三天通过经口管饲法用细菌混合物治疗小鼠。在第21天处死小鼠。对于4t1乳腺癌模型，从第-2天开始用细菌混合物经口管饲治疗小鼠三天，在第三天(第0天)，将溶解在基质胶中的乳腺癌细胞4t1(100,000个细胞，atcc号crl-2539)注射到小鼠的乳腺脂肪垫中。从第5天和第12天开始连续三天通过管饲法用细菌混合物治疗小鼠。在第21天处死小鼠。
125.在皮下注射模型中使用抗cd8(lyt 3.2)抗体(bioxcell；克隆53-5.8)或igg同种型对照(bioxcell；克隆hrpn)进行cd8 t细胞耗竭。在第-3天腹膜内注射抗体200mg/小鼠，在第0、7和14天注射抗体100mg/小鼠。在皮下肿瘤细胞注射后第6、9和12天，通过腹膜内注射200mg/小鼠抗pd1(cd279)抗体(bioxcell；克隆29f.1a12)或igg同种型对照(bioxcell；克隆2a3)进行pd-1阻断。
126.流式细胞术
127.来自脾、肠系膜和皮肤引流淋巴结、结肠固有层淋巴细胞(lpl)、和肿瘤细胞的单细胞悬浮液用于流式细胞术分析。将盲肠和皮下肿瘤切成约0.5mm3的片，在37℃下在摇床(300rpm)上消化于含有0.5mg/ml iv型胶原酶(sigma aldrich)和0.05mg/ml dnase i(roche)溶液的6ml中10分钟。将细胞通过18g1.5注射器匀浆，并在4℃以1500rpm离心10分钟。如前所述将单细胞悬浮液染色并用10μg/ml布雷菲德菌素a(sigma)再刺激4小时(spalinger etal.2019,mucosal immunol.12,1336
–
1347)。
128.统计分析
129.当比较两组时，使用非参数双尾mann whitney检验。为了在三个或更多组之间进行比较，使用anova、或非参数双尾kruskal-wallis检验，并应用dunn’s事后比较检验。
130.实施例1：
131.口服施用梭菌目细菌四混合抑制结肠癌
132.对来自五个研究点的768名crc患者的粪便细菌组成(wirbel etal.nat.med.25(4):1,2019)作图并与健康对照的微生物标记相比较。跨越五个地理区域的群体各自表明了患者与健康对照之间的区别特征，但在地理上不同的患者群之间具有显著的相似性。粪便鸟枪法宏基因组研究鉴定，与整个组群中的crc患者相比，在健康对照中代表性显著更多的十个菌株中，八个来自梭菌目家族。基于该分析，选择了四种梭菌目菌株，即肠道罗斯拜瑞氏菌、霍氏真杆菌(霍式厌氧丁酸菌)、普氏栖粪杆菌、和粪厌氧棒杆菌(细菌的四混合)，用于在crc鼠模型中进行实验研究，以确定操作梭菌目是否可以预防肿瘤生长。四混合和肠道罗斯拜瑞氏菌和粪厌氧棒杆菌个别菌株在癌症治疗的预防性和治疗性模型两者中都显示出相当大的功效，如下所述。
133.c57bl6小鼠用四混合治疗并皮下注射mc-38小鼠crc细胞(图1a)。口服补充四混合导致肿瘤生长在肿瘤体积(图1b)和重量(图1c)方面的显著降低。经治疗的小鼠中的脾重量减少表明，梭菌目四混合方案没有诱导显著的全身性炎症或感染(图1d)。
134.梭菌目细菌四混合激活cd8 t细胞以抑制肿瘤生长
135.细胞毒性cd8 t细胞是抗肿瘤免疫的重要介质。抗体介导的cd8 t细胞耗竭完全消除了四混合的抗肿瘤作用(图2a
–
c)。另外，与对照相比，用四混合治疗的小鼠中cd8 t细胞的浸润显著更高(图2d)。总之，这些数据表明四混合通过增加cd8
t细胞的浸润和细胞毒性抗肿瘤cd8
t细胞应答发挥全身抗肿瘤作用。
136.口服梭菌目细菌比抗pd-1疗法更有效
137.crc中免疫检查点阻断免疫疗法的无效性通常是由于t细胞向肿瘤中的浸润差。由于四混合增加cd8
t细胞浸润到肿瘤组织中，测试了抗pd-1治疗与我们的四混合菌群组合的治疗方法的协同效应(图3a)。与大多数患有这种疾病的患者一样，在我们的模型系统crc模型中，抗pd-1疗法仅显示出微弱的抗肿瘤功效(图3b
–
d)。相反，与抗pd-1治疗的小鼠相
比，四混合治疗显著降低肿瘤生长，表明在该模型中用四混合治疗比抗pd-1免疫治疗更有效(图3b
–
d)。四混合和抗pd-1的组合没有显示出超过单独四混合的额外抗肿瘤益处(图3b
–
d)。
138.由于细菌菌群在临床应用的开发中构成制造和监管挑战，所以评价了我们细菌菌群的单一菌株与四混合相比的抗肿瘤功效(图4a)。逐一来说，单个菌株至少与菌群四混合一样有效，或表现出甚至更强的抗肿瘤作用，特别是对于肠道罗斯拜瑞氏菌和粪厌氧棒杆菌，对于肿瘤体积(图4b和c)和肿瘤重量(图4d)两者。
139.口服梭菌目细菌增强针对已建立的癌症的免疫应答
140.虽然因果关系难以在人类数据中证明，但是一旦肿瘤建立，鼠模型允许研究将有益细菌再引入肠中的可能的治疗效果。事实上，四混合以及肠道罗斯拜瑞氏菌和粪厌氧棒杆菌在crc肿瘤小鼠的治疗性治疗中是成功的(图5a和b)。为了提供进一步的临床背景，将口服四混合的效力与临床护理标准化疗剂5-氟尿嘧啶(5-fu)相比较。四混合治疗将肿瘤生长降低至与5-fu相似的程度(图6a)。四混合和5-fu的组合进一步增加了肿瘤组织中cd8
t细胞、和nk细胞内，ifn-γ、ki67、和t-bet的频数(图7)。这些结果证明，在我们的实验背景下，四混合与5-fu的临床标准护理化疗一样有效。
141.口服梭菌目细菌治疗抑制来自不同组织的肿瘤生长
142.为了确定口服梭菌目治疗是否具有普遍的抗肿瘤能力，在有或没有抗pd1抗体的免疫疗法抗性b16黑素瘤模型中测试四混合和单一菌株。四混合联合抗pd1给药降低了b16肿瘤的大小(图8a)。当测试单一菌株时，与对照小鼠相比，用肠道罗斯拜瑞氏菌和粪厌氧棒杆菌以及四混合一起治疗的小鼠显示出显著降低的b16肿瘤(图8b)。在4t1乳腺癌模型(图9a)和llc1.1肺癌模型(图9b)中的进一步测试发现四混合的抗肿瘤功效与在crc和黑素瘤模型中获得的结果相当。这些数据鉴定了口服细菌治疗的普遍抗肿瘤机制，在crc和广泛范围的实体瘤两者中，在预防性和治疗性背景两者中，表明它们可能是对免疫疗法治疗有抗性的癌症中有希望的疗法。最后，mc38模型用于证实梭菌目菌株肠道罗斯拜瑞氏菌和粪厌氧棒杆菌的重构冻干混合物能够抑制癌症模型中的肿瘤生长(图10)。
143.总结
144.使用上述菌株的口腔细菌治疗通过增加cd8
t细胞浸润到肿瘤组织中驱动增强的抗肿瘤免疫应答，其特征在于ifn-γ的产生和免疫检查点抑制剂的降低的表达。细菌是预防性有效的，其可能是针对crc的稳态保护的驱动者，并且可以证明适用于具有强遗传易感性或crc家族史的群体。它作为当肿瘤已经建立时的治疗方法也是有前景的。这些临床前发现证明了仅基于肠道微生物群补充的新型癌症疗法作为独立疗法的可行性。