一种包含微生物发酵溶菌酶和青霉来源葡萄糖氧化酶的饲用复合酶的组合及应用的制作方法

1.本发明涉及一种饲料添加剂制备与应用，具体涉及一种包含微生物发酵溶菌酶和青霉来源的葡萄糖氧化酶的饲用复合酶的组合及应用。
技术背景
2.集约化高密度的养殖条件下，高强度的饲喂，动物的快速生长造成消化负担加重，肠道问题严重，这使得动物更易遭受疾病以及条件致病菌的侵害，导致动物肠道受损，引起肠道炎症问题。并且自2020年7月1日开始，饲用抗生素全面禁用，这就要求具有高效抑菌作用的安全、绿色添加剂产品急需开发，在能够抑制病原微生物的同时来改善动物肠道健康。因此，绿色添加剂产品成为了动物养殖领域的一大热点，例如cn 110839779 a公开了一种降低肉鸡料肉比的添加剂产品，其组分包含葡萄糖氧化酶5-35份、蛋白酶1-7份、脂肪酶1.5-7.4份、三丁酸甘油酯15-71份、甜菜碱13-50份、生物素1-5份、菊糖1-4份、乙氧基喹啉1-4份。该葡萄糖氧化酶复合产品能对肉鸡料肉比的降低提供显著的效果，降低水便的出现率，降低了成本，提升了经济效益。但是该发明中仅对动物生产性能具有部分改善，并未有效的能针对动物肠道健康及发育，对于动物易感染的病原微生物不具有直接抑制或杀灭的效果，在饲用抗生素禁用的当下生产中不能很好的为动物健康养殖提供安全保障。


技术实现要素：

3.本发明的目的是提供一种针对肉鸡肠道健康，降低炎症反应，增强肠道免疫，维持肠道组织完整性，提高肉鸡生长性能的饲料添加剂。本发明是包含微生物发酵溶菌酶和青霉来源葡萄糖氧化酶的饲用复合酶。
4.本发明的目的通过以下技术方案实现，一种包含微生物发酵溶菌酶和青霉来源葡萄糖氧化酶的饲用复合酶，包含以下份数的原料组成，其成分包含：0.5-2份溶菌酶，0.5-3份葡萄糖氧化酶，5-6份纤维素酶，5-10份β-葡聚糖酶，3-6份木聚糖酶，2-4份果胶酶，1-3份甘露聚糖酶，4-8份淀粉酶，2-4份酸性蛋白酶，1-3份中性蛋白酶，1-2份碱性蛋白酶。
5.进一步，由以下重量份数的原料组成，0.5份微生物溶菌酶，1份青霉来源葡萄糖氧化酶，5份纤维素酶，5份β-葡聚糖酶，3份木聚糖酶，2份果胶酶，1份甘露聚糖酶，4份淀粉酶，2份酸性蛋白酶，1份中性蛋白酶，1份碱性蛋白酶。
6.进一步，由以下重量份数的原料组成，1份微生物溶菌酶，1.5份青霉来源葡萄糖氧化酶，6份纤维素酶，8份β-葡聚糖酶，5份木聚糖酶，3份果胶酶，2份甘露聚糖酶，6份淀粉酶，3份酸性蛋白酶，2份中性蛋白酶，2份碱性蛋白酶。
7.进一步，由以下重量份数的原料组成，2份微生物溶菌酶，2份青霉来源葡萄糖氧化酶，6份纤维素酶，10份β-葡聚糖酶，6份木聚糖酶，4份果胶酶，3份甘露聚糖酶，8份淀粉酶，4份酸性蛋白酶，3份中性蛋白酶，2份碱性蛋白酶。
8.进一步，所述复合酶的制备方法，浅黄色至黄褐色粉末，水分≤8％，细度(0.40mm)
≥80％。
9.进一步，所述原料酶活为：微生物发酵溶菌酶酶活300万u/g，青霉来源葡萄糖氧化酶酶活1万u/g，纤维素酶酶活1万u/g，β-葡聚糖酶酶活20万u/g，木聚糖酶酶活20万u/g，果胶酶酶活3万u/g，甘露聚糖酶酶活15万u/g，淀粉酶酶活5000u/g，酸性蛋白酶酶活6万u/g，中性蛋白酶酶活6万u/g，碱性蛋白酶酶活20万u/g。
10.本发明进一步的目的通过以下技术方案实现，一种包含微生物发酵溶菌酶和青霉来源葡萄糖氧化酶的饲用复合酶在改善肉鸡肠道健康，提高生产性能中的应用。肉鸡自由采食包含所述复合酶的饲料，供应充足的清洁饮水，其他按照正常饲养管理进行为期42天的饲喂。
11.本发明中微生物发酵溶菌酶是具有抗菌作用，它通过水解肽聚糖中n-乙酰葡萄糖胺和n-乙酰胞壁酸之间的β-1，4糖苷键，以此使细菌细胞壁破裂，细胞膜丧失完整性，导致细胞坏死。能够减少外来抗原的刺激，调整免疫激活程度，降低急性炎性反应，减少细胞免疫和体液免疫，达到抗炎作用。与蛋清来源溶菌酶相比，微生物发酵溶菌酶对动物病原微生物的抑制效果更优。
12.本发明中青霉来源葡萄糖氧化酶是一种氧化还原酶，在分子氧的存在下，专一地氧化β-d-葡萄糖生成d-葡萄糖酸，同时消耗氧，生成过氧化氢。青霉来源的葡萄糖氧化酶较市场上用的黑曲霉来源葡萄糖氧化酶与底物更好的结合，反应效率更高。
13.本发明的优点在于微生物发酵溶菌酶与青霉来源的葡萄糖氧化酶的合理搭配，能够改善肉鸡肠道上皮细胞的紧密型，维持肠道的完整性，同时刺激肠道分泌免疫球蛋白，抑制肠道病原微生物繁殖，有效改善肉鸡肠道健康，提高肉鸡生产性能。
附图说明
14.图1是对照组蛋清溶菌酶对大肠杆菌的抑制效果图示，图中：-为阴性对照(生理盐水)； 为阳性对照(氨苄青霉素)；1为20％的浓度；2为10％的浓度；3为5％的浓度；4为1％的浓度。
15.图2分是对照组蛋清溶菌酶对沙门氏菌的抑制效果图示，图中：-为阴性对照(生理盐水)； 为阳性对照(氨苄青霉素)；1为20％的浓度；2为10％的浓度；3为5％的浓度；4为1％的浓度。
16.图3是实施例2微生物发酵溶菌酶对大肠杆菌的抑制效果图示，图中：-为阴性对照(生理盐水)； 为阳性对照(氨苄青霉素)；1为20％的浓度；2为10％的浓度；3为5％的浓度；4为1％的浓度。
17.图4是实施例2微生物发酵溶菌酶对沙门氏菌的抑制效果。图中：-为阴性对照(生理盐水)； 为阳性对照(氨苄青霉素)；1为20％的浓度；2为10％的浓度；3为5％的浓度；4为1％的浓度。
18.图5是饲喂不同组添加剂对肉鸡空肠跨膜电阻(ter)的影响。
19.图6是饲喂不同组添加剂对肉鸡十二指肠分泌型免疫球蛋白a(siga)的影响。
具体实施方式
20.下面将参照更详细地描述本公开的示例性实施为方式。虽然显示了本公开的示例
性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
21.实施例1
22.作用机理：葡萄糖氧化酶是一种氧化还原酶，在分子氧的存在下，专一地氧化β-d-葡萄糖生成d-葡萄糖酸内酯，同时消耗氧，生成过氧化氢；过氧化氢在过氧化氢酶作用下，分解生成水和1/2氧，而后水又与葡萄糖酸内酯结合产生葡萄糖酸。在此过程中，葡萄糖氧化酶的特点是能够消耗氧气，催化葡萄糖氧化，最终产物是葡萄糖酸。
23.材料：对照组：黑曲霉来源葡萄糖氧化酶，实施例1：青霉来源葡萄糖氧化酶；d-葡萄糖；配制缓冲溶液ph5.5
24.仪器耗材：粉碎机、水浴锅、分光光度计、离心机、三角瓶、移液管、漏斗、滤纸等。
25.操作步骤：
26.表1 实验步骤及样品配置
[0027][0028]
37℃水浴，分别于0min、30min、1h、3h、5h测定溶液ph值。
[0029]
试验结果：
[0030]
表2 不同来源葡萄糖氧化酶与底物葡萄糖反应后的ph情况
[0031][0032]
根据表2实验结果表明，实施例1青霉来源葡萄糖氧化酶与底物葡萄糖反应速率更快，因此反应液ph下降程度要快于黑曲霉来源。
[0033]
实施例2
[0034]
材料：对照组：蛋清溶菌酶，实施例2：微生物溶菌酶
[0035]
实验设计：
[0036]
样本用生理盐水分别将待测溶菌酶样品配制成20％，10％，5％，1％的稀释液。指示菌：大肠杆菌、沙门氏菌
[0037]
阳性对照：氨苄青霉素
[0038]
阴性对照：生理盐水
[0039]
实验步骤：
[0040]
a.lb培养基：酵母粉5g/l，nacl 10g/l，蛋白胨10g/l，琼脂1％。
[0041]
b.指示菌：将指示菌于lb平板划线，37℃培养12h左右。从平板中挑单菌落到lb试管中37℃摇床培养12h左右即成指示菌种子液，放于冰箱待用。
[0042]
c.制作抑菌圈板：将素琼脂倒于平皿，使平皿底部平整。在琼脂表面均匀放置6～8个牛津杯，将指示菌种子液加入lb培养基，倒板。待培养基完全凝固后，用镊子将牛津杯取出，抑菌圈板即已做好。
[0043]
d.加样：样本用生理盐水稀释，磁力搅拌后，以3500r/min离心10min，处理成样液。在抑菌圈板上做好标记后，将样液、阳性对照、阴性对照分别加入对应的孔中，将加好样液
的平皿正放置于培养箱中37℃恒温培养，12h左右即可观察记录结果。
[0044]
实验结果：
[0045]
表3 不同来源溶菌酶对常见病原菌的抑制效果
[0046][0047]
图1和图2分别是对照组蛋清溶菌酶对大肠杆菌和沙门氏菌的抑制效果。由表3，图1和图2可以看出对照组蛋清来源溶菌酶对动物常见病原菌大肠杆菌和沙门氏菌未见明显抑制效果。
[0048]
图3和图4分别是实施例2微生物发酵溶菌酶对大肠杆菌和沙门氏菌的抑制效果。由表3及图3、图4，可以看出实施例2微生物发酵溶菌酶对动物病原微生物大肠杆菌和沙门氏菌具有较好的抑制效果。
[0049]
实施例3
[0050]
一种包含微生物发酵溶菌酶和青霉来源葡萄糖氧化酶的饲用复合酶，其成分包含：0.5份微生物溶菌酶，1份青霉来源葡萄糖氧化酶，5份纤维素酶，5份β-葡聚糖酶，3份木聚糖酶，2份果胶酶，1份甘露聚糖酶，4份淀粉酶，2份酸性蛋白酶，1份中性蛋白酶，1份碱性蛋白酶。
[0051]
实施例4
[0052]
一种包含微生物发酵溶菌酶和青霉来源葡萄糖氧化酶的饲用复合酶，其成分包含：1份微生物溶菌酶，1.5份青霉来源葡萄糖氧化酶，6份纤维素酶，8份β-葡聚糖酶，5份木聚糖酶，3份果胶酶，2份甘露聚糖酶，6份淀粉酶，3份酸性蛋白酶，2份中性蛋白酶，2份碱性蛋白酶。
[0053]
实施例5
[0054]
一种包含微生物发酵溶菌酶和青霉来源葡萄糖氧化酶的饲用复合酶，其成分包含：2份微生物溶菌酶，2份青霉来源葡萄糖氧化酶，6份纤维素酶，10份β-葡聚糖酶，6份木聚糖酶，4份果胶酶，3份甘露聚糖酶，8份淀粉酶，4份酸性蛋白酶，3份中性蛋白酶，2份碱性蛋白酶。
[0055]
对照例1
[0056]
本对照例为一种复合酶，该复合酶与实施例3的复合酶基本相同，区别仅在于不含有青霉来源葡萄糖氧化酶也不含有微生物发酵溶菌酶。
[0057]
对照例2
[0058]
本对照例为一种复合酶，该复合酶与在对照例1基础上仅补充青霉来源葡萄糖氧化酶。
[0059]
对照例3
[0060]
本对照例为一种复合酶，该复合酶与在对照例1基础上仅补充微生物发酵溶菌酶。
[0061]
对比试验
[0062]
在肉鸡日粮中补充对照例1-3和实施例3-5配置的复合酶制剂，进行42天饲养试验，通过测定肉鸡肠道免疫效应分子，肠道电生理两个方向来探究本发明对动物肠道健康的改善作用。
[0063]
试验选取1日龄aa肉鸡540只，随机分成6组，每组6个重复，每个重复15只鸡。分别饲喂添加对照例1-3和实施例3-5配置的复合酶产品1公斤/吨的玉米-豆粕型日粮。试验期42天，分为前期1-21天后后期22-42天。所有试验鸡只自由饮水和采食，采用相同管理和免疫程序。分别于养殖试验21天和42天，每个重复选一只体重相近的鸡静脉放血致死，取出空肠组织3cm左右，置于缓冲液保存；取十二指肠中段黏膜组织置于液氮保存。
[0064]
试验结果：
[0065]
表4 日粮中添加实施例3-8复合酶制剂对肉鸡生产性能的影响
[0066][0067]
由表4肉鸡生长性能数据可知，与对照例1相比饲喂对照例2和3，实施例3、4、5肉鸡试验末重均有明显提高；实施例3、4、5肉鸡实验末重较对照例2和3明显提高；实施例3、4、5肉鸡试验末重无显著差异，对照例2和3肉鸡试验末重无显著差异。
[0068]
试验前期1-21天，与对照例1相比实施例3、4、5组肉鸡平均日增重明显增加，料重比有所下降；试验后期22-42天，与对照例1相比对照例2和3组肉鸡平均日增重和平均日采食量均有提高，料重比无明显差异；与对照例1相比实施例3、4、5组肉鸡评价日增重和平均日采食量均显著提高，且料重比较对照例1有明显降低；与对照例2和3相比实施例3、4、5组肉鸡评价日增重和平均日采食量均显著提高。
[0069]
由全期1-42天数据显示，实施例4复合酶组合方案肉鸡生产性能最优，在该方案下肉鸡可以获得最佳生产性能，实施例3效果次之，生产性能与实施例4接近。通过对照例1-3和实施例3-5在肉鸡饲养实验验证，本发明与对照例1传统复合酶方案及对照例2仅单独补
充葡萄糖氧化酶和对照例3仅单独补充微生物发酵溶菌酶相比饲喂效果得到了大幅度提升。
[0070]
图5为饲喂不同组添加剂对肉鸡空肠跨膜电阻(ter)的影响。肠道上皮细胞和细胞间的紧密连接构成而肠道机械屏障，起到阻止肠道病原菌和有害物质如新的作用。紧密连接的结构和通透性决定了上皮组织的致密性和完整性，ter值可以用来反应肠道上皮细胞的通透性。
[0071]
通过图5可以看出，与实施例3相比其他组实施例肉鸡空肠ter值均有提高，实施例7肉鸡空肠ter值最高，实施例6组次之。说明本发明复合酶组分可以改善肉鸡肠道的致密性和完整性，改善肉鸡肠道健康。
[0072]
图6为饲喂不同组添加剂对肉鸡十二指肠分泌型免疫球蛋白a(siga)的影响。siga是黏膜免疫应答过程中的主要效应因子，是维持肠道黏膜稳态的第一道防线，能够防御毒素和致病微生物在肠道黏膜定植。由于血清免疫球蛋白较难达到肠道，因此siga对肠道的直接保护作用更为有效。
[0073]
图6可以看出，与对照例1相比，对照例2和对照例3，实施例3、4、5十二指肠黏膜siga水平均有改善，以实施例4十二指肠黏膜siga含量最高，实施例3次之。对照例2和对照例3较对照例1均有改善，但较本发明实施例3、4、5组合还略有差距。说明本发明复合酶组分可以有效增强肉鸡肠道黏膜免疫，改善肉鸡肠道健康。
[0074]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。