基于表面增强拉曼光谱技术的血液中药物的检测方法与流程

1.本发明涉及血液中药物的检测方法，属于利用精密仪器生物检测技术领域。


背景技术：

2.药物的发明极大地促进了人类的医疗健康事业以及农牧业快速发展，对血液中某种药物的种类及其浓度的监测对患者的治疗非常重要。目前最常用的血液中药物浓度的检测方法有三大类：光谱法、色谱法、免疫法。光谱法血药浓度灵敏度高，检出限可以低至1ppb，但药品代谢物和结构相似的化合物对检测影响较大；色谱法具有优异的定性、定量作用，检测灵敏度可以达到1～10ppb，但色谱柱对样品前处理的要求非常高，检测费时；免疫法仪器昂贵、检测药物类型有限。
3.血液中药物的检测与人类健康息息相关，虽然现有的一些检测方法灵敏度高，但是在样品处理、检测周期、成本、操作复杂性方面仍有很大改进空间，目前还缺少快速、准确、操作简单且成本低廉血药浓度检测方法。
4.表面增强拉曼散射(sers)是一种灵敏度极高、且无损、快速的检测技术，已经应用于生命科学领域的诸多研究，但大部分被检测药物本身的拉曼信号较弱，所以需要具有高效的表面增强作用的基底与药物产生拉曼增强作用才能被检测到。基底的增强效果直接影响被测物质的检测结果。纳米银基底作为一种有效的增强基底，制备方法虽然较多，但存在纳米银基底制备过程复杂，样品前处理步骤繁琐，增强效果欠佳，甚至会对拉曼光谱产生干扰信号，影响最终检测结果的可靠性的问题，同时目前所用的表面增强银基底多为固态基底，制备耗时长、成本高，效果不佳。


技术实现要素：

5.本发明是要解决现有的表面增强拉曼光谱技术的基底制备过程复杂、样品前处理步骤繁琐、增强效果欠佳的技术问题，而提供一种基于表面增强拉曼光谱技术的血液中药物的检测方法，利用拉曼光谱表面增强技术，检测血液中药物种类和其浓度，本方法基底制备成本低，操作简单，准确率高，耗时短。用于人体血液中药物检测时，人体血液样品无需前处理，直接检测，可对人体血液中药物进行定性与定量检测，对于药物的临床研究具有重要的应用价值。
6.本发明的基于表面增强拉曼光谱技术的血液中药物的检测方法，按以下步骤进行：
7.一、纳米银溶胶的制备：
8.将硝酸银水溶液加入反应容器中，加热至40℃～42℃后，在搅拌条件下滴加温度为40℃～42℃的硼氢化钠水溶液，滴加过程中溶液会由无色先变成淡黄色再变为亮黄色，当溶液变为亮黄色时停止滴加还原剂，滴加完毕后继续缓慢搅拌10～30分钟，得到混合溶液；将混合溶液离心处理，弃去上清液，将固相物依次用丙酮、乙醇、水进行清洗，再分散在水中，得到纳米银溶胶，放在-4～-6℃的低温条件下密封保存；
9.二、检测：
10.将纳米银溶胶与待测含药物的血液样品按体积比为1：(0.1～10)混合均匀，然后取混合液进行拉曼光谱测试，测试条件为：激光波长为633nm，功率为0.8mw，积分时间为10s，得到待测血液样品的表面增强拉曼光谱图；同时将待测血液样品中的目标药物纯品配制成溶液，在相同的条件下进行检测，得到纯品的表面增强拉曼光谱图。
11.三、比较判断：
12.将待测血液样品的拉曼光谱图与纯品的拉曼光谱图比较，如果特征峰位置相对应，则判断待测血液样品中含有目标药物，完成血液中药物的检测。
13.更进一步地，步骤一中，硝酸银水溶液的浓度为0.04～0.16mol/l。
14.更进一步地，步骤一中，硼氢化钠水溶液的浓度为0.02～0.20mol/l。
15.更进一步地，步骤一中，搅拌时的转速为460～600rpm。
16.更进一步地，步骤一中，离心处理时的转速为3000～8000rpm，离心时间为10～50min。
17.更进一步地，步骤一中，离心后所得浓缩的银溶胶的体积为离心前的1/300～1/50。
18.更进一步地，步骤二中纳米银溶胶与待测含药物的血液样品混合是用涡旋混合器混合，混合时间为20～30s。
19.更进一步地，步骤二中所述的用于取样并可以在拉曼光谱仪上直接测定的毛细管的直径为0.5mm，长度为100mm。
20.更进一步地，步骤二中所述的放入样品池中的混合液的量为10μl～50μl；量少时易风干。
21.更进一步地，步骤二中所述的血液样品中所含药物为天然药物或化学合成类药物。
22.更进一步地，步骤二中所述的血液样品中所含药物为青霉素、盐酸环丙沙星或头孢克肟。
23.本发明通过控制硝酸银水溶液还原时还原剂加入量及反应温度，获得粒径分布在40～60nm的球形纳米银粒子，含球形纳米银粒子的银溶胶对血液中药物有很好的拉曼增强效果，且不会造成信号干扰，为表面增强拉曼光谱检测血液中药物及其浓度提供了可靠的保障。
24.本发明的作为表面增强拉曼光谱检测的球形纳米银基底制备速度快，银基底不需要修饰，待测样品无需处理，直接混合后，就可用于拉曼光谱检测，可大大提高检测速度，单个样品响应时长在10s以内，灵敏度高达1～20ppm，响应快、灵敏度高，可用于天然药物成分、包括抗生素在内的化学合成类药物成分的定性或定量的检测，由于检测速度快，还可以用于实时监测。
附图说明
25.图1为实施例1经步骤一制备的纳米银溶胶的透射电镜照片；
26.图2为实施例1经步骤一制备的纳米银溶胶的高倍率透射电镜照片；
27.图3为实施例1中青霉素纯品、血液和待测含青霉素的血液样品的表面增强拉曼光
谱图；
28.图4为实施例1中重复检验含青霉素的血液样品的表面增强拉曼光谱图；
29.图5为实施例1中含不同浓度青霉素的血液样品的表面增强拉曼光谱图；
30.图6为实施例1中含不同浓度青霉素的血液样品的拟合曲线；
31.图7为实施例1中血液样品中青霉素的含量为5ppm的样品的拉曼光谱图；
32.图8为实施例2经步骤一制备的纳米银溶胶的透射电镜照片；
33.图9为实施例2经步骤一制备的纳米银溶胶的高倍率透射电镜照片；
34.图10为实施例2中盐酸环丙沙星纯品、血液和待测含盐酸环丙沙星的血液样品的表面增强拉曼光谱图；
35.图11为实施例2中重复检验含盐酸环丙沙星的血液样品的表面增强拉曼光谱图；
36.图12为实施例2中含不同浓度盐酸环丙沙星的血液样品的表面增强拉曼光谱图；
37.图13为实施例2中含不同浓度盐酸环丙沙星的血液样品的拟合曲线；
38.图14为实施例2中血液样品中盐酸环丙沙星的含量为5ppm的样品的拉曼光谱图。
具体实施方式
39.用下面的实施例验证本发明的有益效果。
40.实施例1：本实施例的基于表面增强拉曼光谱技术的血液中药物的检测方法，按以下步骤进行：
41.一、纳米银溶胶的制备：
42.将500ml浓度为0.040mol/l硝酸银水溶液加入容积为2000ml的三口瓶中，将三口瓶放在磁力搅拌器上以460rpm转速搅拌的同时加热至40℃，然后保持460rpm的转速搅拌同时滴加温度为40℃、浓度为0.020mol/l的硼氢化钠水溶液，滴加速度为25ml/min；当滴加950ml硼氢化钠水溶液后，减慢滴加硼氢化钠水溶液的速度至15ml/min；当溶液开始变成淡黄色时以30滴/min的速度滴加硼氢化钠水溶液，直至溶液变为亮黄色，停止滴加还原剂；滴加完毕后继续缓慢搅拌10分钟，得到混合溶液；将混合溶液以转速为5000rpm的转速离心处理15min，弃去上清液，将固相物依次用丙酮、乙醇、水进行清洗，再分散在水中，得到1ml纳米银溶胶，放在-4～-6℃的低温条件下密封保存；
43.二、检测：
44.将纳米银溶胶与待测含青霉素的血液样品按体积比为1：2加入到涡旋混合器混合20s，其中血液样品中青霉素的含量为5ppm，然后用直径为0.5mm的毛细管取混合液，混合液的吸入量为20μl，然后将含有待测液的毛细管置于型号renishaw invia拉曼光谱仪检测样品台，在激光波长为633nm、激光功率为0.8mw、积分时间为10s条件下检测，得到待测血液样品的表面增强拉曼光谱；同时将青霉素纯品和血液在相同的条件下进行检测，得到青霉素纯品和血液的表面增强拉曼光谱，如图3所示；
45.三、比较判断：
46.将待测含青霉素的血液样品的表面增强拉曼光谱与青霉素纯品的表面增强拉曼光谱比较，发现待测含青霉素的血液样品的表面增强拉曼光谱图特征峰拉曼位移为1001.69cm-1
，与青霉素纯品拉曼光谱图特征峰(1001.69cm-1
)完全吻合，则可判断待测含青霉素的血液样品中含有目标药物青霉素，完成血液中药物的检测。
47.步骤一中得到的纳米银溶胶的透射电镜照片如图1和图2所示，从图1和图2中可以看出，纳米银为球形，球体直径为40～60nm，球体大小均匀，利于增强拉曼信号。
48.图3是本实施例中，青霉素纯品、血液和待测含青霉素的血液样品的表面增强拉曼光谱图，从图3可以看出，待测含青霉素的血液样品的表面增强拉曼光谱的特征峰拉曼位移为1001.69cm-1
，与青霉素纯品拉曼光谱图特征峰(1001.69cm-1
)完全吻合，且没有添加被检测物的血液的拉曼光谱图并未在拉曼位移为1001.69cm-1
的位置出现特征峰，可以认定，本方法可以有效对血液中的药物青霉素进行定性分析。
49.取5份实施例1步骤一中制备的纳米银溶胶，分别与含青霉素的血液样品按体积比为1：2混合均匀，其中血液样品中青霉素的含量为1ppm，然后用直径为0.5mm的毛细管取混合液，混合液的吸入量为20μl，再将含有待测液的毛细管置于型号renishaw invia拉曼光谱仪检测样品台，在激光波长为633nm、激光功率为0.8mw、积分时间为10s条件下检测，得到含青霉素的血液样品的表面增强拉曼光谱，如图4所示；从图4可以看出，五次重复检测结果均在拉曼位移为1001.69/cm-1
处出现特征峰，且峰高分别为258、216、225、264、210相对标准偏差为24.8，可以认定，本实施例1制备的纳米银溶胶用于拉曼光谱检测时具有良好的重现性。
50.取5份实施例1步骤一中制备的纳米银溶胶，分别与含青霉素的血液样品按体积比为1：2混合均匀，其中血液样品中青霉素的含量分别为1ppm、2ppm、5ppm、10ppm、20ppm，然后用直径为0.5mm的毛细管取混合液，混合液的吸入量为20μl，再将含有待测液的毛细管置于型号renishaw invia拉曼光谱仪检测样品台，在激光波长为633nm、激光功率为0.8mw、积分时间为10s条件下检测，得到含青霉素的血液样品的表面增强拉曼光谱；如图5所示；从图5可以看出，青霉素表面增强拉曼光谱特征峰(拉曼位移为1001.69cm-1
)峰高随着青霉素浓度减小而降低，其线性拟合谱图如图6所示，拟合的线性方程为y＝33.376x 260.54，r2＝0.9721，可以认定血液中不同浓度的青霉素(1～20ppm)与特征峰峰高具有一定线性关系，可以进行定量分析。其中血液样品中青霉素的含量为5ppm的样品的拉曼光谱图如图7所示，从图7可以看出，在拉曼位移为1001.69cm-1
处得到特征峰峰高为410.89，利用拟合的线性方程计算血液中青霉素浓度为4.35ppm，回收率为87.0％，可以判定本实施例1的方法可以在浓度为1～20ppm范围内对血液中青霉素浓度进行有效定量，同时具有灵敏度高(1ppm)，响应速度快(10s)的特点。
51.本实施例的制备的纳米银颗粒基底形状相对均匀，球体直径为40～60nm，粒径范围窄，且该纳米银溶胶中银颗粒的浓度、银颗粒粒径与青霉素的匹配度高，sers信号增强效果较好，重现性较好；该粒径的球体与血液中其它物质的作用小，可忽略，不影响青霉素的sers信号，借由拉曼光谱高效的反应原理，可有效监测血液中药物及其代谢物浓度，对患者的治疗效果进行实时反馈；由于该方法灵敏度高、响应速度快，可实时监测血液中药物含量等特点，可以为临床研究和疾病治疗过程中给药量给出指导性建议。
52.对比例1：本对比例与实施例1不同的是步骤一的纳米银溶胶的制备方法如下：将500ml浓度为0.040mol/l硝酸银水溶液加入容积为2000ml的三口瓶中，将三口瓶放在磁力搅拌器上以460rpm转速搅拌的同时加热至30℃，然后保持460rpm的转速搅拌同时滴加温度为30℃、浓度为0.020mol/l的硼氢化钠水溶液，滴加速度为25ml/min；当滴加950ml硼氢化钠水溶液后，减慢滴加硼氢化钠水溶液的速度至15ml/min；当溶液开始变成淡黄色时以30
滴/min的速度滴加硼氢化钠水溶液，直至溶液变为亮黄色，停止滴加还原剂，此时共滴加硼氢化钠水溶液1050ml；滴加完毕后继续缓慢搅拌10分钟，得到混合溶液；将混合溶液以转速为5000rpm的转速离心处理15min，弃去上清液，将固相物依次用丙酮、乙醇、水进行清洗，再分散在水中，得到纳米银溶胶，放在-4～-6℃的低温条件下密封保存；
53.其它步骤与参数与实施例1相同。
54.对比例1所制备的纳米银溶胶与实施例1所制备的纳米银溶胶透射电镜表征结果对比表明，30℃下制备的纳米银溶胶粒径大小不均，由于反应速度较慢，初期生成的粒径作为模板持续生长，造成反应初期生成的纳米银颗粒与末期生成的纳米银颗粒粒径不均，影响信号增强效果。
55.对比例2：本对比例与实施例1不同的是步骤一的纳米银溶胶的制备方法如下：
56.将500ml浓度为0.040mol/l硝酸银水溶液加入容积为2000ml的三口瓶中，将三口瓶放在磁力搅拌器上以460rpm转速搅拌的同时加热至50℃，然后保持460rpm的转速搅拌同时滴加温度为50℃、浓度为0.020mol/l的硼氢化钠水溶液，滴加速度为25ml/min；当滴加950ml硼氢化钠水溶液后，减慢滴加硼氢化钠水溶液的速度至15ml/min；当溶液开始变成淡黄色时以30滴/min的速度滴加硼氢化钠水溶液，直至溶液变为亮黄色，停止滴加还原剂，此时共滴加硼氢化钠水溶液1050ml；滴加完毕后继续缓慢搅拌10分钟，得到混合溶液；将混合溶液以转速为5000rpm的转速离心15min，弃去上清液，将固相物依次用丙酮、乙醇、水进行清洗，再分散在水中，得到纳米银溶胶，放在-4～-6℃的低温条件下密封保存；
57.其它步骤与参数与实施例1相同。
58.对比例2所制备的纳米银溶胶与实施例1所制备的纳米银溶胶透射电镜表征结果对比表明，50℃下制备的纳米银溶胶粒径过大，由于反应速度较快，初期生成的粒径大部分作为模板持续生长，所得纳米银的粒径大都在100nm以上，影响信号增强效果且容易沉降。
59.实施例2：本实施例的基于表面增强拉曼光谱技术的血液中药物的检测方法，按以下步骤进行：
60.一、纳米银溶胶的制备：
61.将500ml浓度为0.040mol/l硝酸银水溶液加入容积为2000ml的三口瓶中，将三口瓶放在磁力搅拌器上以500rpm转速搅拌的同时加热至42℃，然后保持500rpm的转速搅拌同时滴加温度为42℃、浓度为0.020mol/l的硼氢化钠水溶液，滴加速度为50ml/min；当滴加950ml硼氢化钠水溶液后，减慢滴加硼氢化钠水溶液的速度至40ml/min；当溶液开始变成淡黄色时以30滴/min的速度滴加硼氢化钠水溶液，直至溶液变为亮黄色，停止滴加还原剂；滴加完毕后继续缓慢搅拌30分钟，得到混合溶液；将混合溶液以转速为5000rpm的转速离心15min，弃去上清液，将固相物依次用丙酮、乙醇、水进行清洗，再分散在水中，得到1ml纳米银溶胶，放在-4～-6℃的低温条件下密封保存；
62.二、检测：
63.将纳米银溶胶与待测含盐酸环丙沙星的血液样品按体积比为1：2加入到涡旋混合器混合20s，其中人血液样品中盐酸环丙沙星的含量为5ppm，然后用毛细管取混合液，毛细管的直径为0.5mm，混合液的吸入量为20μl，然后将含有待测液的毛细管置于型号renishaw invia拉曼光谱仪检测样品台，在激光波长为633nm、激光功率为0.8mw、积分时间为10s条件下检测，得到待测血液样品的表面增强拉曼光谱；同时将盐酸环丙沙星纯品和血液在相同
的条件下进行检测，得到盐酸环丙沙星纯品和血液的表面增强拉曼光谱，如图10所示；
64.三、比较判断：
65.将待测含盐酸环丙沙星的血液样品的表面增强拉曼光谱与盐酸环丙沙星纯品的表面增强拉曼光谱比较，发现待测含盐酸环丙沙星的血液样品的表面增强拉曼光谱图特征峰拉曼位移为1384.69cm-1
，与盐酸环丙沙星纯品拉曼光谱图特征峰(1384.69cm-1
)完全吻合，且没有添加被检测物的血液的拉曼光谱图并未在拉曼位移为1384.69cm-1
的位置出现特征峰，则可判断待测含盐酸环丙沙星的血液样品中含有目标药物盐酸环丙沙星，完成血液中药物的定性检测。
66.本实施例2经步骤一中得到的纳米银溶胶的透射电镜照片如图8和图9所示，从图8和图9中可以看出，纳米银为球形，球体直径为40～60nm，球体大小均匀，有利于增强拉曼信号。
67.取5份实施例2步骤一中制备的纳米银溶胶，分别与含盐酸环丙沙星的血液样品按体积比为1：2混合均匀，其中血液样品中盐酸环丙沙星的含量为1ppm，然后用直径为0.5mm的毛细管取混合液，混合液的吸入量为20μl，置于型号为renishaw invia拉曼光谱仪样品台上，在激光波长为633nm、激光功率为0.8mw、积分时间为10s条件下检测，得到含盐酸环丙沙星的血液样品的表面增强拉曼光谱如图11所示；从图11可以看出，五次重复检测结果均在拉曼位移为1384.69/cm-1
处出现特征峰，且峰高分别为457、522、632、574、621，相对标准偏差为72.9，可以认定，本实施例2制备的纳米银溶胶用于拉曼光谱检测时具有良好的重现性。
68.取5份实施例2步骤一中制备的纳米银溶胶，分别与含盐酸环丙沙星的血液样品按体积比为1：2混合均匀，其中血液样品中盐酸环丙沙星的含量分别为1ppm、2ppm、5ppm、10ppm、20ppm，然后用直径为0.5mm的毛细管分别取混合液，混合液的吸入量为20μl，置于型号为renishaw invia拉曼光谱仪样品台上，在激光波长为633nm、激光功率为0.8mw、积分时间为10s条件下检测，得到含盐酸环丙沙星的血液样品的表面增强拉曼光谱；如图12所示；从图12可以看出，盐酸环丙沙星表面增强拉曼光谱特征峰(拉曼位移为1384.69/cm-1
)峰高随着盐酸环丙沙星浓度减小而降低，其线性拟合谱图如图13所示，拟合的线性方程为y＝40.638x 252.15，r2＝0.9448，可以认定血液中不同浓度的盐酸环丙沙星(1～20ppm)与特征峰峰高具有一定线性关系，可以进行定量分析。其中血液样品中盐酸环丙沙星的含量为5ppm的样品，其拉曼光谱图如图14所示，从图14可以看出，其拉曼位移为1384.69/cm-1
处得到特征峰峰高为481.5，利用拟合的线性方程计算血液中盐酸环丙沙星浓度为5.64ppm，回收率为112.9％，可以判定本实施例2的方法可以在浓度为1～20ppm范围内对血液中盐酸环丙沙星浓度进行有效定量，同时具有灵敏度高(1ppm)，响应速度快(10s)的特点。
69.本实施例2的制备的纳米银颗粒基底形状相对均匀，球体直径为40～60nm，粒径范围窄，且该纳米银溶胶中银颗粒的浓度、银颗粒粒径与盐酸环丙沙星的匹配度高，sers信号增强效果较好，重现性较好；该粒径的球体与血液中其它物质的作用小，可忽略，不影响盐酸环丙沙星的sers信号，借由拉曼光谱高效的反应原理，可有效鉴定血液中药物及其代谢物浓度，对患者的治疗效果进行实时反馈；由于该方法灵敏度高、响应速度快，可实时监测血液中药物含量等特点，可以为患者临床治疗给药量给出指导性建议。