地黄苷D的应用以及抗肿瘤转移药物

bb-94）。
11.图3显示了transwell小室法检测地黄苷d对乳腺癌细胞纵向迁移的影响，其中，c：空白组；l：低剂量组（1.25μmol/l地黄苷d）；m：中剂量组（2.5μmol/l地黄苷d）；h：高剂量组（5μmol/l 地黄苷d）；p：阳性药组：（10μmol/l bb-94）。
12.图4显示了transwell小室法检测地黄苷d对乳腺癌细胞纵向迁移数目的影响（），其中，与空白组相比较，*p《0.05,**p《0.01。c：空白组；l：低剂量组（1.25μmol/l 地黄苷d）；m：中剂量组（2.5μmol/l 地黄苷d）；h:高剂量组（5μmol/l 地黄苷d）；p：阳性药组（10μmol/l bb-94）。
13.图5显示了transwell小室法检测地黄苷d对乳腺癌细胞纵向侵袭的影响，其中，c：空白组；l：低剂量组（1.25μmol/l地黄苷d）；m：中剂量组（2.5μmol/l地黄苷d）；h：高剂量组（5μmol/l地黄苷d ）；p：阳性药组：（10μmol/l bb-94）。
14.图6显示了transwell小室法检测地黄苷d对乳腺癌细胞纵向侵袭数目的影响（），其中，与空白组相比较，*p《0.05,**p《0.01。c：空白组；l：低剂量组（1.25μmol/l 地黄苷d）；m：中剂量组（2.5μmol/l 地黄苷d）；h:高剂量组（5μmol/l 地黄苷d）；p：阳性药组（10μmol/l bb-94）。
15.图7显示了oris
tm
法检测地黄苷d对乳腺癌细胞横向迁移的影响，其中，c：空白组；l：低剂量组（1.25μmol/l地黄苷d）；m：中剂量组（2.5μmol/l地黄苷d）；h：高剂量组（5μmol/l 地黄苷d）；p：阳性药组：（10μmol/l bb-94）。
16.图8显示了oris
tm
法检测地黄苷d对乳腺癌细胞横向迁移率的影响（），其中，与空白组相比较，*p《0.05,**p《0.01。c：空白组；l：低剂量组（1.25μmol/l 地黄苷d）；m：中剂量组（2.5μmol/l 地黄苷d）；h:高剂量组（5μmol/l 地黄苷d）；p：阳性药组（10μmol/l bb-94）。
17.图9显示了oris
tm
法检测地黄苷d对乳腺癌细胞横向侵袭的影响，其中，c：空白组；l：低剂量组（1.25μmol/l地黄苷d）；m：中剂量组（2.5μmol/l地黄苷d）；h：高剂量组（5μmol/l 地黄苷d）；p：阳性药组：（10μmol/l bb-94）。
18.图10显示了oris
tm
法检测地黄苷d对乳腺癌细胞横向侵袭率的影响（），其中，与空白组相比较，*p《0.05,**p《0.01。c：空白组；l：低剂量组（1.25μmol/l 地黄苷d）；m：中剂量组（2.5μmol/l 地黄苷d）；h:高剂量组（5μmol/l 地黄苷d）；p：阳性药组（10μmol/l bb-94）。
19.图11显示了细胞粘附试剂盒(细胞外基质蛋白阵列）检测地黄苷d对乳腺癌细胞粘附的影响（），其中，与空白组相比较，*p《0.05,**p《0.01。ctrl：空白对照组；bb-94：阳性对照组；fn：纤维连接蛋白；col i：i型胶原蛋白；col iv：iv型胶原蛋白；ln：层黏连蛋白；fg：纤维蛋白原；bsa：牛血清白蛋白。
具体实施方式
20.下面通过实施例对本发明进行详细描述，但并不意味着对本发明任何不利限制。本文已经详细地描述了本发明，其中也公开了其具体实施例方式，对本领域的技术人员而
言，在不脱离本发明精神和范围的情况下针对本发明具体实施方式进行各种变化和改进将是显而易见的。
21.本发明提供了地黄苷d（rehmannioside d）的新应用。
22.具体地，本发明提供了地黄苷d或其药学上可接受的盐在制备预防肿瘤药物、治疗肿瘤药物或抗肿瘤转移药物中的应用。
23.也就是说，本发明提供了地黄苷d在制备预防肿瘤药物中的应用、地黄苷d在制备治疗肿瘤药物中的应用、地黄苷d在制备抗肿瘤转移药物中的应用、地黄苷d的药学上可接受的盐在制备预防肿瘤药物中的应用、地黄苷d的药学上可接受的盐在制备治疗肿瘤药物中的应用或地黄苷d的药学上可接受的盐在制备抗肿瘤转移药物中的应用。
24.所述地黄苷d的结构式如下：所述地黄苷d是一种环烯醚萜苷类化合物，可以从地黄药材中提取得到。
25.在一些实施例中，所述肿瘤为乳腺癌。
26.本发明还提供了一种预防肿瘤、治疗肿瘤或抗肿瘤转移的药物，所述药物包括：所述地黄苷d或其药学上可接受的盐；以及药学上可接受的载体或辅料。
27.在一些实施例中，所述药物的剂型为口服制剂或注射制剂。
28.本领域技术人员可以将所述地黄苷d或其药学上可接受的盐直接或间接地加入制备不同剂型时所需的药学上可接受的各种常用辅料，如填充剂、崩解剂、润滑剂、粘合剂，以常规药物制剂方法，制成常用口服制剂或注射制剂。
29.在一些实施例中，所述口服制剂为片剂、胶囊剂、颗粒剂、脂肪乳剂、微囊、滴丸。
30.在一些实施例中，所述注射制剂为注射液或粉针剂。
31.为了验证地黄苷d的抗肿瘤转移效果，进行以下实验。
32.（一）实验材料1、实验药品配制：（1）地黄苷d的配制：用天平称取2.75mg 的地黄苷d，用100μl 的dmso溶解，母液浓度为40mmol/l，涡旋混匀；因为地黄苷d 在低温dmso 中溶解性较差，所以将母液放置在37
technologies 公司，procmacc1）；（4）oris
tm pro cell invasion assay 细胞横向侵袭试剂盒（购于美国platypus technologies 公司，proia1）；（5）钙黄绿素-am（购于sigma 公司，17783）；（6）1n 氢氧化钠溶液（购于sigma 公司，s2770）；（7）无菌去离子水（购于索莱宝公司，f0020）。
38.7、细胞粘附实验材料及试剂：（1）1
×
磷酸盐缓冲液（pbs，购于索莱宝公司，p1020-500）；（2）胰蛋白酶（trypsin-edta，含酚红，购于mrc 公司，t200407）；（3）cytoselect
tm
48-well cell adhesion(ecm array)细胞粘附试剂盒(购于美国cell biolabs 公司）。
39.（二）实验方法1、细胞的培养及传代1.1 细胞培养：本实验使用的是人乳腺癌细胞系mda-mb-231和mda-mb-468两种细胞，与其他人乳腺癌细胞相比较，这两种细胞具有高转移特性，故选择这两种细胞进行实验。两种细胞均使用含10% fbs的高糖dmem培养基且使用透气培养瓶进行培养，将细胞放置在适宜的温度、二氧化碳且无菌的环境中进行培养，2天换液一次。
40.1.2 细胞传代：当细胞在透气培养瓶内的数量相对密集（80%）且处于比较健康的生长状态时（细胞形态饱满，死细胞较少），可进行传代，步骤为：弃旧培养基，用2ml pbs将细胞清洗2遍去除死细胞，后加入1ml含有edta的胰酶，轻轻晃动培养瓶，待胰酶充分接触瓶底的每个角落后放进培养箱，消化大概3分钟或者当细胞由梭形变成圆球形时，加入2ml dmem血清培养基，再用移液枪用适当的力气进行吹打，将细胞悬液吹打均匀直至细胞在显微镜观察下观察到成单个细胞后，按实验需要将细胞悬液进行处理，之后加入新的完全培养基进行培养。
41.1.3细胞计数：用75%的医用酒精清洗存放在无菌工作台内的细胞计数板以及盖玻片，使用无菌医用纱布片将多余的酒精彻底擦拭干净后置于酒精灯上方轻轻过火，使得计数板和盖玻片完全烘干。将盖玻片水平放置于细胞计数板上方正中间处，混匀需要计数的细胞悬液后用移液枪吸取20μl，手持移液枪在水平方向倾斜15度左右，小心从盖玻片左右两侧各打进细胞悬液约10μl，静置数分钟以后将玻璃计数板平稳放置在倒置显微镜下进行观察，若细胞在计数板的大方格内分布均匀，即可进行细胞计数。
42.2、srb实验筛选地黄苷d抗乳腺癌细胞增殖的浓度（1）细胞铺板：待两株乳腺癌细胞（mda-mb-231、mda-mb-468）长至对数生长期（即长满占瓶底面积80%左右），即可用上述细胞传代步骤（pbs清洗、胰蛋白酶消化、离心）制成细胞悬液。取无菌96孔培养板，边缘孔加入100μlpbs，实验孔（6个复孔）加入100μl（终浓度为2
×
105个/ml）细胞悬液。
43.（2）实验分组：设置给药组地黄苷d（终浓度分别为2.5μmol/l、5μmol/l、10μmol/l、20μmol/l、40μmol/l）和空白组，各组设6个复孔。
44.（3）细胞给药：培养至细胞占孔底面积80%左右即可给药。预先配制好地黄苷d、各浓度的含药培养基。取培养板用1ml注射器吸出旧培养基，pbs清洗后，空白组加入新的完全
培养基（100μl/孔）、给药组加入含有不同浓度的地黄苷d的完全培养基（100μl/孔）。
45.（4）24h后取出培养板，吸弃孔内旧培养基，加入10% tca固定液（100μl/孔），随后将96孔板放置冰箱内进行低温固定（4℃，1 h），随后直接倒掉固定液，再用装有双蒸水的冲洗瓶将板内的孔冲洗5遍，风干。加入用1%乙酸配制的0.4% srb染色液（100μl/孔），静置染色25 min之后用装有1%乙酸的冲洗瓶冲洗5遍，风干（可用吹风机）。最后每孔加入ph值为10.5的tris-base碱液（150μl/孔），手动快速摇晃或摇床上振荡10-15min，使srb 与tris-base碱液彻底混合均匀，即可用酶标仪测定其吸光度后计算存活率。
46.（5）细胞存活率计算公式：细胞存活率（%）=（加药组细胞吸光度/空白组细胞吸光度）
×
100%3、细胞划痕横向迁移实验（1）细胞铺板：预先用记号笔在无菌6孔板底部划3-5条均匀的横线，按细胞传代步骤将制备好的对数生长期的mda-mb-231及mda-mb-468乳腺癌细胞悬液（终浓度为5x105个/ml）分别均匀接种于6 孔板内（2ml/孔）。（2）实验分组：设置给药组地黄苷d低、中、高三组（终浓度分别为1.25μmol/l、2.5μmol/l、5μmol/l）、空白组、阳性药组（10μmol/l），各组设3个复孔。
47.（3）细胞给药：待6孔培养板内乳腺癌细胞生长至百分百融合后（生长时间约24h），用200μl的枪头垂直于培养板底部的横线在孔内划3条痕，弃旧培养基，用pbs或者空白培养基洗涤细胞3次，加入含0.1% fbs培养基及不同质量浓度的地黄苷d（2ml/孔）。
48.（4）0h 拍照：将已加好药的6孔板进行封口之后用显微镜拍照，拍照位置为培养板底部横线与孔内划痕的交点上方或者下方，选择固定的拍照位置。
49.（5）24h 拍照：24小时后，取6孔板，显微镜拍照，拍照位置与0h一致。收集完所有的0h与24h的细胞划痕图片后，使用image j fiji 软件分析。
50.（6）计算划痕愈合率：划痕愈合率（%）＝(0h 划痕面积－24h 划痕面积)/0h 划痕面积
×
100%4、 transwell 小室细胞纵向迁移侵袭实验4.1 transwell 小室细胞纵向迁移实验（1）取出无菌transwell小室，底部向上置于超净台台面，将提前配制好的趋化剂fn（纤维连接蛋白，浓度为0.5ug/ml）用枪头均匀涂布于小室底部，每个小室5μl，风干备用。
51.（2）分别取处于健康生长状态且为对数生长期的两种乳腺癌细胞（mda-mb-231、mda-mb-468 细胞），按照细胞传代步骤（pbs清洗，胰蛋白酶消化，离心），再用基础培养基清洗离心管内的细胞两遍，基础培养基重悬，并将细胞悬液稀释至终浓度为2
×
105个/ml备用。
52.（3）实验分组：设置给药组地黄苷d低、中、高三组（终浓度分别为1.25μmol/l、2.5μmol/l、5μmol/l）、空白组、阳性药组（10μmol/l），各组设3个复孔。
53.（4）细胞给药：取无菌24孔培养板，每孔加入500μl细胞培养基（10% fbs），轻轻晃动培养板使培养基在孔内均匀分布，将已经风干的无菌小室开口向上置于24孔板中间，避免小室外壁与孔壁相触碰，手持移液枪以垂直方向向每个小室的中间缓缓加入空白细胞悬液以及不同质量浓度的含药细胞悬液（200μl/小室），确保小室内细胞均匀分布，小心放入培养箱中培养24h。
54.（5）另取一块24孔板，孔内加入4%多聚甲醛100μl。取出小室，将小室放入多聚甲醛中固定15min，用pbs或者蒸馏水洗一遍。再另取一块24孔板，孔内加入400μl的0.5%结晶紫染液，将小室开口向上放入结晶紫中，使小室底部与结晶紫染液充分接触，避免气泡产生，染色20min，pbs或者双蒸水洗涤三次。
55.（6）用无菌棉签将小室内的细胞及水分轻轻擦去，注意避免触碰小室外底部结晶紫，重新将擦拭好小室开口向上放在24孔板内用荧光倒置显微镜进行拍照。
56.4.2 transwell 小室细胞纵向侵袭实验（1）取出无菌transwell小室，底部向上置于超净台台面，将提前配制好的趋化剂fn（纤维连接蛋白，浓度为0.5ug/ml）用枪头均匀涂布于小室底部，每个小室5μl，风干备用。
57.（2）铺matrigel胶：将matrigel胶与基础培养基按一定比例混合均匀（matrigel胶：基础培养基=1:8）。将已经风干的无菌小室开口向上置于24孔板中间，避免小室外壁与孔壁相触碰，手持移液枪以垂直方向向每个小室的中间缓缓加入提前稀释好的matrigel胶（50μl/小室），用枪头将matrigel胶涂布均匀，随后立放入培养箱中孵育（时间约1h），1h后matrigel胶凝固，可吸出少量水化液体，备用。全程冰上操作。
58.（3）分别取处于健康生长状态且为对数生长期的两种乳腺癌细胞（mda-mb-231、mda-mb-468 细胞），按照细胞传代步骤（pbs清洗，胰蛋白酶消化，离心），再用基础培养基清洗离心管内的细胞两遍，基础培养基重悬，并将细胞悬液稀释至终浓度为2
×
105个/ml备用。
59.（4）实验分组：设置给药组地黄苷d低、中、高三组（终浓度分别为1.25μmol/l、2.5μmol/l、5μmol/l）、空白组、阳性药组（10μmol/l）。各组设3个复孔。
60.（5）细胞给药：取无菌24孔培养板，每孔加入500μl细胞培养基（10% fbs），轻轻晃动培养板使培养基在孔内均匀分布，将之前用matrigel胶制备好的无菌小室开口向上置于24孔板中间，避免小室外壁与孔壁相触碰，手持移液枪以垂直方向向每个小室的中间缓缓加入空白细胞悬液以及不同质量浓度的含药细胞悬液（200μl/小室），确保小室内细胞均匀分布，小心放入培养箱中培养24h。
61.（6）另取一块24孔板，孔内加入4%多聚甲醛l00μl。取出小室，将小室放入多聚甲醛中固定15min，用pbs 或者蒸馏水洗一遍。再另取一块24孔板，孔内加入400μl的0.5%结晶紫染液，将小室开口向上放入结晶紫中，使小室底部与结晶紫染液充分接触，避免气泡产生，染色20min，pbs或者双蒸水洗涤三次。
62.（7）用无菌棉签将小室内的细胞及水分轻轻擦去，注意避免触碰小室外底部结晶紫，重新将擦拭好小室开口向上放在24 孔板内用荧光倒置显微镜进行拍照。
63.5、oris
tm
细胞横向迁移侵袭实验5.1 oris
tm
细胞横向迁移实验（1）细胞铺板：分别取对数生长期（密度约80%-90%）、生长状态较为健康的mda-mb-231和mda-mb-468 细胞,按照细胞传代步骤（pbs清洗，胰蛋白酶消化，离心）收集细胞，制备最佳播种浓度的细胞悬液（终浓度为3x105个/ml）。取collagen i包被的oris
tm pro培养板，将100μl的细胞悬液移入试验孔中（试验孔分0h细胞迁移前参考孔和72h细胞迁移孔），随后平稳的将培养板放入培养箱中孵育至细胞贴壁（时间约2h）。
64.（2）实验分组：设置给药组地黄苷d 低、中、高三组（终浓度分别为1.25μmol/l、2.5
μmol/l、5μmol/l）、空白组、阳性药组（10μmol/l）。各组设3个复孔。
65.（3）细胞给药及0h拍照：待2小时oris
™ꢀ
pro 培养板孔内生物相容性凝胶溶解后，取出培养板，0h 细胞迁移前参考孔弃培养基，用100μl的无血清培养基（或无菌pbs）轻轻冲洗一遍，加入50μl的钙黄绿素染液（pbs 稀释至2μm）；72h细胞迁移孔弃培养基，用100μl 的无血清培养基（或无菌pbs）轻轻冲洗一遍，分别加入100μl 的新鲜完全培养基以及不同质量浓度的含药培养基，平稳放入培养箱中，30min 后将培养板封口并包好锡箔纸，用荧光倒置显微镜4 倍镜拍照记录0h细胞迁移前参考孔的状态，全程保持闭光。
66.（4）72h 拍照：药物作用72h 后取出oris
™ꢀ
pro培养板，弃培养基，加入50μl的钙黄绿素染液（2μm），平稳放入培养箱中，30min后将培养板封口并包好锡箔纸，荧光倒置显微镜拍照记录72h细胞迁移孔的状态，全程保持闭光。
67.5.2 oris
tm
细胞横向侵袭实验（1）细胞铺板：分别取处于健康生长状态且为对数生长期的mda-mb-231和mda-mb-468细胞（密度约80%-90%），按照细胞传代步骤（pbs清洗，胰蛋白酶消化，离心）收集细胞，制备最佳播种浓度的细胞悬液（终浓度为3
×
105个/ml）。取collagen i包被的oris
tm pro培养板，将100μl的细胞悬液移入试验孔中（试验孔分0h细胞迁移前参考孔和72h细胞迁移孔），随后平稳的将培养板放入培养箱中孵育至细胞贴壁（时间约2h）。
68.（2）待2小时oris
™ꢀ
pro培养板孔内生物相容性凝胶溶解后，取出培养板，弃培养基，用100μl 的无血清培养基（或无菌pbs）轻轻冲洗一遍，加入提前用10
×
pbs缓冲液、1n naoh、无菌去离子水、collagen i（5mg/ml）配制好的oris
tm pro collagen i overlay溶液（40μl/孔），将培养板放入培养箱中孵育1h使溶液聚合凝固。
69.（3）实验分组：设置给药组地黄苷d低、中、高三组（终浓度分别为1.25μmol/l、2.5μmol/l、5μmol/l）、空白组、阳性药组（10μmol/l）。各组设3 个复孔。
70.（4）细胞给药及0h拍照：待oris
tm pro collagen i覆盖层充分凝固后，取出培养板，0h细胞迁移前参考孔加入50μl的钙黄绿素染液（2μm），72h细胞迁移孔分别加入100μl的新鲜完全培养基以及不同质量浓度的含药培养基，平稳放入培养箱中，30min 后将培养板封口并包好锡箔纸，用荧光倒置显微镜4 倍镜拍照记录0h 细胞迁移前参考孔的状态，全程保持闭光。
71.（5）72h拍照：药物作用72h后取出oris
™ꢀ
pro培养板，弃培养基，加入50μl的钙黄绿素染液（2μm），平稳放入培养箱中，30min后将培养板封口并包好锡箔纸，荧光倒置显微镜拍照记录72h细胞迁移孔的状态，全程保持闭光。
72.6、细胞粘附实验（1）预先将细胞粘附试剂盒(细胞外基质蛋白阵列）中的48孔培养板放置在超净台内以恢复室温（时间约10min）。
73.（2）分别取对数生长期（密度约80%-90%）、生长状态相对较健康的mda-mb-231和mda-mb-468细胞，按照细胞传代步骤（pbs清洗，胰蛋白酶消化，离心）收集好细胞，用空白培养基清洗离心后的细胞4次并重悬，制备最佳播种浓度的细胞悬液（终浓度1
×
106个/m1）。
74.（3）实验分组：设置给药组地黄苷d低、中、高三组（终浓度分别为1.25μmol/l、2.5μmol/l、5μmol/l）、空白组、阳性药组（10μmol/l）。各组设3个复孔。
75.(4)向48 孔培养板加入空白细胞悬液以及不同质量浓度的含药细胞悬液（150μl/
孔），其中bsa包被的孔作为对照组，水平摇晃培养板使细胞均匀分散在孔底，随即放入培养箱中孵育90min。
76.（5）孵育结束后取出培养板，弃培养基，用移液枪将250μl的无菌pbs从孔壁缓慢的打入孔内，轻轻洗3遍，直至洗尽多余的未贴壁的细胞。
77.（6）吸尽pbs，加200μl细胞粘附试剂盒内配套的蓝色染料进行染色10min，弃染料，用双蒸水轻轻洗3遍，室温干燥。
78.（7）每孔加入200μl细胞粘附试剂盒内配套的萃取液，手动快速摇匀或摇床上振荡10min，使萃取液与孔内染料充分混匀后吸取150μl于96孔板内，用酶标仪进行吸光度的测定(560nm处)。
79.7、统计分析方法本实验中的所有数据结果均通过spss.25软件进行分析，分析方法为单因素方差分析，处理后结果均使用平均值
±
标准差（）表示。差异有无统计学意义用p值进行判定，即若p＜0.05表示差异具有显著性意义，若p＜0.01表示差异极具显著意义。
80.（三）实验结果1、细胞划痕横向迁移实验结果肿瘤细胞的迁移运动是肿瘤发生转移的关键步骤之一，因此阻止癌细胞的迁移运动对抑制肿瘤转移具有重要意义。实验结果如图1所示，与空白组相比，地黄苷d作用24h后两种乳腺癌细胞往划痕中间迁移的细胞明显减少，且随着地黄苷d浓度的增高而减少。采用imagej fiji 软件将划痕结果图进行分析处理，根据划痕愈合率计算公式得出各组细胞的迁移率。如图2所示，地黄苷d 给药组迁移率的差异具有统计学意义（p《0.01），这提示了地黄苷d能显著抑制乳腺癌细胞的横向迁移。
81.2、transwell 小室细胞纵向迁移侵袭实验结果2.1 transwell 小室细胞纵向迁移实验结果图3结果表明，给药24h后，与空白组相比，随着地黄苷d作用浓度的增高，两种乳腺癌癌细胞迁移的数量逐渐减少，且高浓度组尤为明显。如图4所示，地黄苷d给药组细胞迁移率的差异具有统计学意义（p《0.01），这提示了地黄苷d能显著抑制乳腺癌细胞的纵向迁移能力。
82.2.2 transwell 小室细胞纵向侵袭实验结果恶性肿瘤具有侵袭性，同时侵袭是肿瘤发生转移的重要过程之一。图5、图6结果表明，给药24h后，与空白组相比，随着地黄苷d作用浓度的增高，两种乳腺癌细胞侵袭的数量逐渐减少，且高浓度组尤为明显。如图6所示，地黄苷d给药组细胞侵袭率的差异具有统计学意义（p《0.01）。
83.3、oris
tm
细胞横向迁移侵袭实验结果3.1 oris
tm
细胞横向迁移实验结果采用oris
tm pro cell migration assay 来检测地黄苷d对乳腺癌细胞横向迁移的影响。从图7结果图中可以看出，药物作用72h后，与空白组相比，三组不同浓度的地黄苷d处理后向中间空白圆心处迁移的细胞数量明显减少。如图8 所示，地黄苷d给药组细胞迁移率的差异具有统计学意义（p《0.01），这提示了地黄苷d能显著抑制乳腺癌细胞的横向迁移能力。
84.3.2 oris
tm
细胞横向侵袭实验结果采用oris
tm pro cell invasion assay 来检测地黄苷d对乳腺癌细胞横向侵袭的影响。从图9结果图中可以看出，药物作用72h 后，与空白组相比，三组不同浓度的地黄苷d向中间空白圆心处侵袭的细胞数量明显减少。如图10所示，地黄苷d 给药组细胞侵袭率的差异具有统计学意义（p《0.01），这提示了地黄苷d能显著抑制乳腺癌细胞的横向侵袭能力。
85.4、细胞粘附实验结果肿瘤转移过程中，细胞的粘附作用极其重要。结果如图11所示，吸光度（od值）越高表明癌细胞的粘附能力越强，因此与空白组相比，地黄苷d三个浓度给药组的吸光度明显降低，差异具有统计学意义（p《0.01），这提示了地黄苷d对乳腺癌细胞粘附产生了明显的抑制效果。
86.由此可知，细胞划痕实验结果显示，与空白组相比，不同浓度的地黄苷d能显著抑制乳腺癌细胞的体外迁移能力（p《0.01）。transwell细胞迁移及侵袭实验结果显示，与空白组相比，不同浓度的地黄苷d均能有效抑制乳腺癌细胞体外的纵向迁移能力和侵袭能力（p《0.01）。oris
tm 迁移和侵袭实验结果显示，与空白组相比，不同浓度的地黄苷d均能显著抑制乳腺癌细胞体外的横向迁移能力和侵袭能力（p《0.01）。建立细胞体外粘附模型的实验结果显示，与空白组相比，不同浓度的地黄苷d 均具有体外抗乳腺癌细胞粘附的作用（p《0.01）。
87.上述结果显示，地黄苷d可显著抑制肿瘤细胞的体外迁移、侵袭和粘附作用，且有效浓度低于5μmol/l，说明该化合物对于恶性肿瘤的转移作用具有很好的抑制作用，具有很好的开发前景。