文冠木提取物的抗老年痴呆活性和应用

1.本发明属于生物技术领域，涉及文冠木的生物活性及用途。


背景技术：

2.文冠木是无患子科植物文冠木(xanthocerassorbifolia bunge)的干燥茎干或枝条部位，为民族医学实践中惯用药材，其应用历史悠久。文冠木主要分布于我国东北、华北、西北等地，主产于内蒙古。现代研究表明,文冠木中含有黄酮类、三萜类等物质，主要具有抗炎、抗氧化、镇痛、活血、抑菌等作用。挖掘文冠木的新活性和新用途对文冠木产业发展和维护人们健康具有重要意义。
3.老年痴呆是一种以退行性认知障碍和记忆力损害为主要临床表现的中枢神经系统退行性疾病，是神经病学中最难攻克的疾病，目前的治疗方法仅可以减缓发展进程，却无法彻底地治愈。近些年来，科学界已经意识到这些困难，并重新考虑了老年痴呆药物开发的其他方向，由单一靶点转换到多靶点药物方向上，老年痴呆药物开发的范式从传统单靶点向多靶点的策略转换可以大大增加发现有效药物的机会。
4.本发明公开了文冠木甲醇提取物抗老年痴呆作用的新用途。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供文冠木的新用途和价值。
6.本发明采用下述技术方案：制备文冠木甲醇提取物：文冠木木屑用甲醇超声波萃取，过滤提取液，减压浓缩得文冠木甲醇提取物。
7.文冠木甲醇提取物的活性测定：将alcl3·
6h2o溶于蒸馏水配成10 μg/ml溶液。实验组分为空白组、alcl3·
6h2o模型组、alcl3·
6h2o ＋文冠木甲醇提取物组，与野生型ab品系斑马鱼仔鱼培养，用斑马鱼行为学系统daniovision x10进行斑马鱼运动时间、距离等参数的测量。
8.本发明的优点及新发现为：发现和公开了文冠木甲醇提取物具有显著的抗老年痴呆作用。
附图说明
9.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
10.图1为斑马鱼生存曲线示意图，其中a代表文冠木甲醇提取物组，b代表alcl3·
6h2o造模组；图2为斑马鱼老年痴呆造模情况直方图，其中a代表斑马鱼受明暗刺激的运动距离
图，b代表斑马鱼受明暗刺激的运动时间图；图3为药物干预后老年痴呆斑马鱼运动距离折线图；图4为药物干预后老年痴呆斑马鱼运动时间折线图；图5为药物干预后老年痴呆斑马鱼黑暗环境下运动时间柱状图（*代表p＜0.05，**代表p＜0.01）；
具体实施方式
11.下面对本发明的文冠木甲醇提取物和文冠木肠内菌代谢物的制备，抗老年痴呆活性作用进行进一步详细说明。
12.实施例1：文冠木甲醇提取物的制备及其主要成分将2019年8月采于内蒙古自治区赤峰市的文冠木干燥茎干用木工机床刨成约1 cm2的木花，称取1 g 用ar级甲醇（40 ml）超声波萃取3次，每次10分钟，通过13000 g离心沉降文冠木木花及碎屑，上清液滤纸过滤后减压浓缩至干得到文冠木甲醇提取物粉末。准确称取文冠木甲醇提取物粉末加入二甲基亚砜（dmso）溶解，配置成母液。用斑马鱼培养基稀释母液为250 μg/ml、125 μg/ml、62.5 μg/ml和31.25 μg/ml备用(每个梯度溶液中的dmso含量不超过0.1%)。
13.在负电离esi模式下，用uplc-ms对文冠木甲醇提取物进行定性，其中包含的主要成分如表1所示。
14.表1 文冠木甲醇提取物中的主要成分通过scifinder数据库和web of science数据库文献检索收集了潜在的文冠木体
内代谢物成分，如表2所示。
15.表2 文冠木体内代谢物中的主要成分实施例2：文冠木甲醇提取物的抗老年痴呆活性采用购自中国斑马鱼资源中心的ab品系野生型斑马鱼，野生型雄性和雌性斑马鱼
分开适应性饲养1周。斑马鱼饲养环境为：温度27
±
1℃，水体ph值7-8，水体硬度为100 mg/ml(caco3)，盐度为0.25
‰
，光照周期为10月份呼和浩特自然昼夜循环，每日饲喂活体丰年虾两次，固体饲料两次。配鱼时，在前一天晚上将1：1的雄鱼和雌鱼放置到具有2/3的27
±
1℃饲养水的产缸中，关灯进入暗周期。第二天早晨光周期开始时雌雄鱼开始产卵交配。收集产缸下层的斑马鱼鱼卵，放置在90 mm的无菌培养皿中，密度为50颗/皿，静水培养，每天换水，除去未受精的死卵。受精后3-4天，鱼卵开始破壳，将破壳后的幼鱼和鱼卵分开培养。
16.在受精后72 h(72 hpf)的新生幼鱼群中挑选发育正常的幼鱼放置于12孔板内，每孔15条，每个组3孔。设置空白组、120 μg/ml甲醇提物组、60 μg/ml甲醇提物组、30 μg/ml甲醇提物组、15 μg/ml甲醇提物组，继续培养72 h，每12 h更换1/2的28 ℃新鲜药液，换液时除去死亡幼鱼。72 h后统计死亡率。
17.使用alcl3·
6h2o作为造模剂。在受精后72 h(72 hpf)的幼鱼群中挑选发育正常的幼鱼放置在12孔板内，每孔10条。alcl3·
6h2o粉末用蒸馏水溶解成母液，实验中造模剂设置成30 μg/ml、10 μg/ml、5 μg/ml、1 μg/ml等浓度，每个浓度设置3个重复。斑马鱼幼鱼在28 ℃环境下静水培养72 h，每12 h更换1/2的新鲜造模剂，同时除去死亡的幼鱼。72 h后统计死亡率，并弃去药液，将斑马鱼幼鱼按组别转移至48孔板，每孔一条，每孔加入0.5 ml蒸馏水。将48孔板放置进斑马鱼行为学系统daniovision x10中进行斑马鱼运动时间、距离等参数的测量。观测程序设置为暗适应10 min，明场5 min，暗场5 min，明暗交替重复3次。导出数据，根据斑马鱼幼鱼的对明暗刺激的运动情况选择最佳造模浓度。
18.将发育正常的72 hpf幼鱼放置在12孔板内，每孔15条。空白组0.1%dmso，模型组10 μg/ml alcl3·
6h2o溶液，文冠木甲醇提取物组(10 μg/ml alcl3·
6h2o 30、15、7.5 μg/ml文冠木甲醇提取物)。每个浓度设置3个重复孔。加药后28℃恒温静水培养72 h，每12 h更换1/2的新鲜药液，并移除死鱼。行为学观察同上述方法。
19.经过斑马鱼生存药物毒性实验发现，文冠木甲醇提取物对斑马鱼的安全最大剂量为30 μg/ml，造模药物alcl3·
6h2o对斑马鱼的安全最大剂量为10 μg/ml，两者作用下的斑马鱼生存曲线如图1所示。
20.在alcl3·
6h2o致斑马鱼老年痴呆模型实验中，将斑马鱼受明暗刺激的运动时间和运动距离绘制直方图如图2所示。正常情况下斑马鱼受到明暗刺激时，会自发性游动，表明神经系统可以接受刺激并做出应对性反应。当斑马鱼的大脑受到损伤时，其应对外界刺激信号反应迟缓，运动表现滞后、迟钝且强度降低。从图2中可以发现10 μg/ml alcl3·
6h2o组斑马鱼的运动时间和运动距离显著小于空白组，说明斑马鱼造模成功，即确定10 μg/ml alcl3·
6h2o作为造模药物浓度。
21.利用老年痴呆造模成功的斑马鱼探究文冠木甲醇提取物的抗老年痴呆活性。老年痴呆模型斑马鱼在施加药物干预后的运动距离和运动时间折线图如图3和图4所示，药物干预后老年痴呆斑马鱼黑暗环境下运动时间柱状图及显著性差异统计分析结果如图5所示。老年痴呆斑马鱼面对明暗周期的光刺激没有表现出行为应激性运动，其运动距离较短且波动性不明显。文冠木甲醇提取物组老年痴呆斑马鱼呈现出对明暗刺激的显著性应激运动，且呈现出浓度依赖性，高浓度的甲醇提物组呈现出与空白组十分接近的运动曲线。
22.综上，本发明公开了文冠木甲醇提取物的制备及其对老年痴呆斑马鱼明暗刺激运动行为的改善作用。
23.上述实例仅列举了本发明较佳的实施例，本发明的保护范围不应受到其限制，熟悉本领域技术人员在本发明的技术范围内，以简单替换或变化所得技术方案均落入本发明的保护范围。