一种病毒减毒制剂、其制备方法以及应用与流程

1.本发明属于生物医药领域，具体涉及一种病毒减毒制剂、其制备方法以及应用。


背景技术：

2.猪繁殖与呼吸综合征(prrs，porcine reproductive and respiratory syndrome)由猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv，porcine reproductive and respiratory syndrome virus)引起的一种高度接触性传染病，给世界养猪行业造成巨大的损失，以母猪流产、死胎、弱胎、木乃伊胎以及仔猪呼吸困难、败血症、高死亡率等为主要特征。
3.目前，猪繁殖与呼吸综合征暂无治疗性药物，临床主要以疫苗预防为主。所以，开发具有抑制prrs的生物制剂也是现今的研究热点之一，如在中国申请201210165822.6中，酵母双杂交筛选来寻找与prrsv n蛋白相互作用的宿主细胞蛋白，该方法虽然成功的抑制了prrsv病毒。但是，显然，其制备成本限制了其应用。


技术实现要素：

4.本发明的主要目的是提供一种病毒减毒制剂、其制备方法以及应用，旨在提供安全性好、制备成本低且能够可以有效降低猪繁殖与呼吸综合征病毒毒性的组合物。
5.为达到上述目的，本发明提供一种病毒减毒制剂，在所述病毒减毒制剂中含有0.1～0.5μmol/l的罗汉松酸、1～10μmol/l的他汀类药物以及5～50mg/ml羟基柠檬酸。
6.可选地，所述病毒减毒制剂还包括药学可接受载体。
7.可选地，所述病毒减毒制剂还含有溶剂和分散剂。
8.可选地，所述分散剂包括冰醋酸，且在所述病毒减毒制剂中，所述冰醋酸的含量为0.1～12.5mg/ml；和/或，
9.所述溶剂为水。
10.可选地，所述他汀类药物包括阿托伐他汀或瑞舒伐他汀钙。
11.此外，本发明还提供一种上述病毒减毒制剂的制备方法，所述病毒减毒制剂的制备方法包括以下步骤：
12.将所述罗汉松酸、所述他汀类药物以及羟基柠檬酸混合后得到所述病毒减毒制剂。
13.可选地，将罗汉松酸、他汀类药物以及羟基柠檬酸混合后得到所述病毒减毒制剂的步骤包括；
14.将罗汉松酸、他汀类药物、羟基柠檬酸与药学可接受载体混合后，得到所述病毒减毒制剂。
15.此外，本发明提供一种上述病毒减毒制剂在降低猪繁殖与呼吸综合征病毒的毒性上的用途。
16.可选地，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒包括nadc30毒株和高致病性猪繁殖与呼吸综合征(如prrsv gd株)。
17.此外，本发明还提供一种上述病毒减毒制剂在制备用于治疗猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的病症的制剂或制备用于制备用于引发生物体对于猪繁殖与呼吸综合征病毒免疫性应答的制剂上的用途。
18.此外，本发明提供一种免疫制剂，所述免疫制剂包括猪繁殖与呼吸综合征病毒以及上述病毒减毒制剂。
19.本发明中，通过采用罗汉松酸、他汀类药物、羟基柠檬酸的复配，在降低prrsv对于免疫系统破坏的同时，增强免疫系统对于prrsv的工作时间，以此，来达到在基体中降低prrsv毒性的目的，进而治疗因感染prrsv而致病的生物体。
具体实施方式
20.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
21.需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“a和/或b”为例，包括a方案、或b方案、或a和b同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
22.鉴于现有对于药物制剂对于prrsv毒性的抑制和治疗，难以兼顾安全、有效且制备成本低的技术缺陷，本发明提供一种病毒减毒制剂，在所述病毒减毒制剂中含有0.1～0.5μmol/l的罗汉松酸、1～10μmol/l的他汀类药物以及5～50mg/ml羟基柠檬酸。
23.本发明中，通过采用罗汉松酸、他汀类药物、羟基柠檬酸的复配，在降低prrsv对于免疫系统破坏的同时，增强免疫系统对于prrsv的工作时间，以此，来达到在基体中降低prrsv毒性的目的，进而治疗因感染prrsv而致病的生物体。
24.发明人团队在对于治疗猪感染prrsv的研究过程中发现，通过采用罗汉松酸、他汀类药物、羟基柠檬酸的复配能有效地降低prrsv毒性，在注射prrsv病毒和药物时，实验对象均未出现相应的感染状况。
25.本发明术语所述的“罗汉松酸”(cas号：5947-49-9)是一种天然产物，为trpa1的激活剂。在之前的研究中作为前列腺癌等癌症的抑制剂，可以癌细胞的生长，具有独特的抗肿瘤作用。本技术扩大了它原有的应用，在对于降低prrsv的毒性，其可能的作用机制为通过使prrsv引起的巨噬细胞“胞葬”下降恢复到正常水平，降低了prrsv的免疫抑制的危害，也减少了炎症反应的发生。
26.本发明术语所述的“他汀类药物”即3-羟基-3甲基戊二酰辅酶a(hmg-coa)还原酶抑制药，常常作为降脂药被临床应用。不仅能强效地降低总胆固醇(tc)和低密度脂蛋白(ldl)，而且能一定程度上降低三酰甘油(tg)，还能升高高密度脂蛋白(hdl)。但是在临床使用中逐渐发现他汀的逃逸现象，用药后期不能很好的降低血脂。本技术扩大了它原有的应
用，在对于降低prrsv的毒性，其作用机制可能正是利用他汀的逃逸现象，可以有效促进pcsk9(前蛋白转化酶枯草溶菌素9)，溶解了prrsv的细胞识别受体cd163。降低prrsv对巨噬细胞的破坏，恢复巨噬细胞的免疫功能，而且阿托伐他汀可以增加prrsv抗原表位在免疫细胞内的作用时间，增强了机体的抗prrsv作用。
27.本发明术语所述的“羟基柠檬酸”(cas号:6205-14-7)是柠檬酸的一种竞争性异构体。柠檬酸是三羧酸循环中重要的中间产物，是三大物质代谢的联通中心。通过竞争以抑制柠檬酸裂解酶，从而改变物质代谢流向。通常被用于食品调味剂、保鲜剂和膨化食品添，在一些亚洲国家，还被用于治疗风湿病、水肿和肠内寄生虫等病症。还常用于减肥、降血脂、抗肿瘤等。本技术扩大了它的使用范围，在对于降低prrsv的毒性方面，其可能的机制是，用于减少prrsv对巨噬细胞、心血管系统的危害。
28.在一些实施例中，所述病毒减毒制剂还包括药学可接受载体。在本发明中，所述可接受载体用以将所述病毒减毒制剂制备成不同的剂型，如口服的丸剂、颗粒剂、口服液等等，具体地，可制备成注射剂，以提高制剂的利用率。
29.在具体制备成注射剂时，在一些实施例中，所述病毒减毒制剂还含有溶剂和分散剂。具体地，所述分散剂包括冰醋酸，且在所述病毒减毒制剂中，所述冰醋酸的含量为0.1～12.5mg/ml；所述溶剂为水。以此，通过冰醋酸，使罗汉松酸、他汀类药物、羟基柠檬酸分散于水中，形成分散性良好的可溶性制剂。
30.在一些实施例中，所述他汀类药物包括阿托伐他汀((3r,5r)-7-[2-(4-氟苯基)-3-苯基-4-(苯基氨基甲酰基)-5-异丙基-吡咯-1-基]-3,5-二羟基庚酸)或瑞舒伐他汀钙(cas号：147098-20-2)。发明人团队进一步研究发现，采用阿托伐他汀可进一步降低prrsv毒性。
[0031]
此外，本发明还提供一种上述病毒减毒制剂的制备方法，所述病毒减毒制剂的制备方法的制备方法包括以下步骤：
[0032]
步骤s10:将所述罗汉松酸、所述他汀类药物以及羟基柠檬酸混合后得到所述病毒减毒制剂。
[0033]
步骤s10包括：
[0034]
将罗汉松酸、他汀类药物、羟基柠檬酸与药学可接受载体混合后，得到所述病毒减毒制剂。
[0035]
此外，本发明提供一种上述病毒减毒制剂在降低猪繁殖与呼吸综合征病毒的毒性、在制备用于治疗猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的病症的制剂或制备用于制备用于引发生物体对于猪繁殖与呼吸综合征病毒免疫性应答的制剂上的用途。
[0036]
经实验验证，本发明对于降低prrsv毒性以及对于因prrsv病毒引起的病症的治疗均有良好的作用。具体地，在一些实施例中，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒包括nadc30毒株和高致病性猪繁殖与呼吸综合征(如prrsv gd株)。
[0037]
prrsv具有抑制宿主先天性免疫、挟持宿主体液免疫和其抗原易变异等特性，这给控制prrsv和研发有效的prrsv疫苗带来困难。目前市场上prrsv疫苗有减毒活疫苗和灭活疫苗。prrsv灭活疫苗虽然安全性好，但仅诱导极微弱的细胞免疫反应，其免疫保护效果不理想，减毒活疫苗免疫效果优于灭活苗。现今，采用连续传代或者其他基因改变的方式使野毒转化为安全性高的疫苗候选毒株，是减弱毒株毒性的主要方式，但是这种致弱方式需要
的时间较长、成本较高。而本发明制剂其减毒方式其减毒效应可以在培育prrsv毒性弱化的毒株有很好的应用性，因此，可以开发出相应的疫苗制剂。
[0038]
因此，本发明提供一种免疫制剂，所述免疫制剂包括猪繁殖与呼吸综合征病毒以及上述病毒减毒制剂，可用于引发生物体对于猪繁殖与呼吸综合征病毒的免疫性应答。
[0039]
以下结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0040]
本发明部分原料来源说明涉及如下：
[0041]
罗汉松酸：上海阿拉丁生化科技股份有限公司，纯度98.0％
[0042]
阿托伐他汀：武汉润泽伟业科技有限公司，固体粉末
[0043]
羟基柠檬酸：广东杨叶生物科技有限公司，粉末，纯度99％
[0044]
冰醋酸：国药集团化学试剂有限公司，分析纯
[0045]
瑞舒伐他汀钙：广州卡芬生物科技有限公司，白色粉末
[0046]
实施例1～3
[0047]
实施例1～3分别提供一种病毒减毒制剂，其成分与含量如表1所示。
[0048]
表1实施例1～3病毒减毒制剂成分含量表
[0049][0050]
实施例1～3还提供上述病毒减毒制剂的制备方法，其操作如下：
[0051]
按表1中的剂量将冰醋酸加入去离子水中，混匀后再依次加入罗汉松酸、阿托伐他汀，待完全溶解后，最后加入羟基柠檬酸搅拌使其完全溶解，得到的病毒减毒制剂(体积为2ml)。
[0052]
实施例4
[0053]
本实施例还提供一种病毒减毒制剂，在病毒减毒制剂中，含有0.5μm罗汉松酸，10μm的瑞舒伐他汀，5mg/ml的羟基柠檬酸和12.5mg/ml的冰醋酸，其余为水。
[0054]
本实施例还提供病毒减毒制剂的制备方法，其操作如下：
[0055]
将冰醋酸加入去离子水中，混匀后再依次加入罗汉松酸、瑞舒伐他汀，待完全溶解后，最后加入羟基柠檬酸搅拌使其完全溶解，得到的病毒减毒制剂(体积为2ml)。
[0056]
实施例5
[0057]
按照实施案例4中的成分，把瑞舒伐他汀更换为洛伐他汀(cas:75330-75-5)，含量5mg/ml，其他不变。配制方法同实施案例4。
[0058]
试验实施例
[0059]
对本发明实施例1～5提供的配方水溶液进行下述性能评价：
[0060]
1、对病毒的影响
[0061]
将上述5种水溶液分别稀释高致病性prrsv冻干粉(国药集团动物保健股份有限公司保存)和nadc30冻干粉(国药集团动物保健股份有限公司保存)。用pbs稀释相同批次的病
毒冻干粉作为对照，室温放置1小时后，用marc-145细胞测定病毒含量tcid
50
。
[0062]
实验结果：和相应对照组之间病毒含量没有明显差异。结果详见表2。说明该溶液不直接杀灭病毒。
[0063]
表2对病毒的影响统计表
[0064][0065]
2、安全性试验：
[0066]
随机选择健康的21～28日龄的断奶仔猪25头，平均分为5组，每组5头，分别给每组仔猪注射采用本发明实施例配制的溶液(10ml/头)(正常使用剂量为2ml/头)，注射后将各组仔猪置于相同的管理环境下进行饲养管理，每天定时测量仔猪的体温状况并记录，连续观察14天完成实验。
[0067]
实验结果：在受试期间，各组仔猪的体温和对照组没有明显差异，各组溶液安全性好。结果详见表3。
[0068]
表3安全性统计表
[0069]
组别38.5-40.0℃数量(头)＞40.0℃数量(头)组1-实施例150组2-实施例250组3-实施例350组4-实施例450组5-实施例550
[0070]
3、有效性试验：
[0071]
随机选择21～28日龄的健康仔猪35头，平均分为8组，每组各5头，按下表4进行试验。
[0072]
表4试验分组明细
[0073][0074]
接种后每日进行测温和临床观察，连续观察14天。至少连续3天体温在41℃以上，同时出现精神沉郁，采食下降等临床症状，判为发病，统计发病情况结果详见下表5。
[0075]
观察结束后，每组随机剖检3头试验猪的各个器官，剖检结果显示组6、组7有明显的肺部病，组1-组4，和空白对照组各器官均没有眼观变化。组5也有肉眼可见病变。
[0076]
表5有效性试验统计表
[0077][0078]
从上表可以看出，本发明试剂能降低猪繁殖与呼吸综合征病毒的毒性，并对感染降低猪繁殖与呼吸综合征病毒的猪有治疗效果。与此同时，本发明研究团队发现，阿托伐他汀和瑞舒伐他汀其降毒效果和治疗效果进一步提高。
[0079]
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。