一种含胎盘间充质干细胞外泌体微针贴剂及其制备方法与流程

1.本发明属于医用配制品技术领域，涉及一种含胎盘间充质干细胞外泌体微针贴剂及其制备方法。


背景技术：

2.颈肩腰腿痛常见于30-50岁的成年人。然而，近年有往年轻化的放向发展，青少年颈腰椎疾病发病率为12％。由于青少年生长发育提前、学习负担加重、长期低头学习等不良习惯，青少年自由活动和户外锻炼的机会较少。不良习惯下的姿势或体位使他们的肌肉持续收缩以维持姿势，导致肌肉供血减少，继发肌肉痉挛，并使韧带、肌筋膜易发生损伤。青少年当下面临着繁重的脑力劳动，易引起神经肌肉紧张，使韧带和关节囊松弛，脊柱生理曲度改变或发生错位等生物力学异常，应力失衡。这种过度的身体肌肉、韧带消耗，造成慢性损伤，而且持续时间长，就会造成颈肩腰腿痛的发生，甚至脊柱畸形。在广大基层，由于条件和基础知识的局限.对常见颈肩腰腿痛多缺乏有效的精准治疗，常导致不可逆转的后果。
3.间充质干细胞(mesenchymal stromal cell，msc)在组织损伤后大量分泌各种因子改变微环境。这些因子影响细胞迁移、增殖、分化和基质合成等再生过程。越来越多的证据表明msc来源的外泌体(msc-exo)在组织再生过程中可作为生物活性治疗因子。msc-exos是直径50-200nm的双层小泡，含有多种蛋白、脂质及调控核酸，外泌体的双层膜质外壳可以防止其内容物的降解。msc-exos免疫原低，不会引起固有的不良反应或免疫排斥反应。一系列研究表明，msc-exos可能是再生医学中潜在的替代治疗方法。胎盘间充质干细胞来源的外泌体(plmsc-exo)可以逆转椎间盘退变、减轻局部炎症反应、缓解腰部疼痛及纠正姿势和步态异常。mscs来源于骨髓、胎盘等多种间充质组织。与bmscs相比，plmscs具有更大的分化潜能、治疗作用和更低的免疫原性。因此，plmscex0可能是治疗颈肩腰腿痛的一种有前途的选择。
4.现有研究中，主要通过直接将plmsc-exo注射到病灶部位，操作复杂、患者耐受性差，需要专人操作，价格品贵，且会造成二次伤害，一般患者难以接受。cn109793758a提供了间充质干细胞外泌体微针贴剂及其制备和应用，但其在皮肤应用中表现较差，存在释放低效、容易引起皮肤红肿、患者耐受性差等问题。因此，如何开发出一种适合皮肤的给药系统，使得plmsc-exo能在患病部位迅速释放，使用方便，且对皮肤无不刺激，对避免青少年脊椎畸形的发生与发展有着重要的意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于开发出一种含胎盘间充质干细胞外泌体微针贴剂，提高plmsc-exo的使用便捷性，实现plmsc-exo能在患病部位迅速释放，并提高plmsc-exo的使用效果。
6.基于上述目的，本发明提供了一种含胎盘间充质干细胞外泌体微针贴剂及其制备方法来满足本领域的这种需要。
7.一方面，本发明涉及一种含胎盘间充质干细胞外泌体微针贴剂，其包括：防水层、
背衬层、微针表层和微针内核；所述微针内核包括胎盘间充质干细胞外泌体和纳米氧化铈，所述微针表层包括卡波姆、维生素a、维生素c和维生素e。
8.另一方面，本发明涉及含胎盘间充质干细胞外泌体微针贴剂的制备方法，其包括：将胎盘间充质干细胞外泌体和纳米氧化铈均匀分散在pbs中制得所述微针内核的混合液；将卡波姆、维生素a、维生素c和维生素e溶于水中，搅拌溶胀后，将ph调至6-7，加入plga溶解，加入peg倒入多孔微针板模板经冷却解压脱模，制得多孔微针板模具；将所述微针内核的混合液灌注至所述多孔微针板模具中，真空干燥24-36h，然后置于无水乙醇中超声清洗2-3次。
9.进一步地，本发明提供的含胎盘间充质干细胞外泌体微针贴剂的制备方法中，每1l所述pbs分散10-1000μg所述胎盘间充质干细胞外泌体和5-20mg所述纳米氧化铈；优选地，每1l所述pbs分散800μg所述胎盘间充质干细胞外泌体和10mg所述纳米氧化铈。
10.进一步地，本发明提供的含胎盘间充质干细胞外泌体微针贴剂的制备方法中，每10ml所述水溶解0.8-1.3g所述卡波姆、0.01-0.1g维生素a、0.01-0.1g维生素c和0.01-0.1g维生素e；优选地，每10ml所述水溶解1.1g所述卡波姆、0.08g维生素a、0.05g维生素c和0.05g维生素e。
11.进一步地，本发明提供的含胎盘间充质干细胞外泌体微针贴剂的制备方法中，还包括：取甲基丙烯酸明胶或乙酰透明质酸覆于所述多孔微针板模具远离所述微针的一面；取聚二甲基硅氧烷(pdms)单体和固化剂，以质量比计，以10:1混匀，真空脱气30min制得所述背衬层，覆于所述甲基丙烯酸明胶或乙酰透明质酸的一面。
12.本发明实现了将胎盘间充质干细胞外泌体等制备成医用配制品类型的微针贴剂，其在缓解椎间盘退变模型小鼠步态异常，缓解小鼠椎间盘退变，腰腿痛患者临床试验中表现出优异的效果。由此本发明请一步请求保护所述的含胎盘间充质干细胞外泌体微针贴剂的制备方法在微针贴剂制备中的应用；所述的含胎盘间充质干细胞外泌体微针贴剂的制备方法在外泌体微针贴剂制备中的应用；所述的含胎盘间充质干细胞外泌体微针贴剂的制备方法在微针贴剂中的应用。
13.本发明与现有技术相比具有以下有益效果或者优点：
14.本发明提供了一种含胎盘间充质干细胞外泌体微针贴剂，其在缓解椎间盘退变模型小鼠步态异常，缓解小鼠椎间盘退变，腰腿痛患者临床试验中表现出优异的效果。本发明提供了一种含胎盘间充质干细胞外泌体微针贴剂的制备方法，通过多种药物的复合，实现了胎盘间充质干细胞外泌体能在患病部位迅速释放，并提高了胎盘间充质干细胞外泌体的使用效果。
附图说明
15.图1为本发明的原理表示、形成过程及功能演示图。
16.图2为15cm/s下idd模型小鼠摆动时间(swing)的变化。
17.图3为15cm/s下idd模型小鼠制动时间(brake)的变化。
18.图4为15cm/s下idd模型小鼠脚掌面积(paw area)的变化。
19.图5为15cm/s下idd模型小鼠步幅频率(stride frequency)的变化。
具体实施方式
20.下面，结合实施例对本发明的技术方案进行说明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
21.实施例1
22.本实施例提供了一种含胎盘间充质干细胞外泌体微针贴剂的制备。
23.将人胎盘间充质干细胞(plmsc)以1
×
106/cm2的密度接种于培养瓶中，待细胞长至瓶底60％面积时，加入无血清培养液，48h后合并收集上清液。通过300xg离心10min去除细胞沉淀。将上清液以2000xg离心10min去除沉淀，1000xg离心30min去除沉淀。100000xg离心70min收集外泌体，重悬于20mlpbs中，100000xg离心70min，将外泌体洗涤两次。plmsc-exo呈典型的杯状，大小不均，目测直径范围为30-100nm。plmsc-exo的粒径主要在50-150nm。plmsc-exo观察到了阳性cd9和cd63表达，且富集程度高于plmsc。
24.将胎盘间充质干细胞外泌体和纳米氧化铈均匀分散在pbs中制得微针内核的混合液；将卡波姆、维生素a、维生素c和维生素e溶于水中，搅拌溶胀后，将ph调至6，加入plga溶解，加入15％质量的plga，置于50℃下溶解，制成胶状，然后向其中加入plga质量5％的脱模剂peg(分子量4000g/mol)，混合均匀，并迅速倒入多孔微针模板中，减压至-70kpa，0℃环境下冷却，制得多孔微针板模具；将微针内核的混合液灌注至多孔微针板模具中，真空干燥24h，然后置于无水乙醇中超声清洗2次。
25.纳米氧化铈的平均粒径为100nm。每1l pbs分散10μg胎盘间充质干细胞外泌体和5mg纳米氧化铈。每10ml水溶解0.8g卡波姆、0.01g维生素a、0.01g维生素c和0.01g维生素e。
26.防水层选用甲基丙烯酸明胶，取甲基丙烯酸明胶覆于多孔微针板模具远离微针的一面；取聚二甲基硅氧烷(pdms)单体和固化剂，以质量比计，以10:1混匀，真空脱气30min制得背衬层，覆于甲基丙烯酸明胶的一面。
27.以质量比计，防水层、背衬层、微针表层、微针内核的配比为2:1:8:2。
28.微针贴剂中的微针的针长为100微米，针宽为10微米，微针贴剂针尖的形状从上至下为斜尖、锥尖、斜尖。斜尖和锥尖分布面积相同。
29.实施例2
30.本实施例提供了一种含胎盘间充质干细胞外泌体微针贴剂的制备。
31.将胎盘间充质干细胞外泌体和纳米氧化铈均匀分散在pbs中制得微针内核的混合液；将卡波姆、维生素a、维生素c和维生素e溶于水中，搅拌溶胀后，将ph调至6.5，加入15％质量的plga，置于50℃下溶解，制成胶状，然后向其中加入plga质量5％的脱模剂peg(分子量4000g/mol)，混合均匀，并迅速倒入多孔微针模板中，减压至-70kpa，0℃环境下冷却，制得多孔微针板模具；将微针内核的混合液灌注至多孔微针板模具中，真空干燥24h，然后置于无水乙醇中超声清洗2次。
32.纳米氧化铈的平均粒径为100nm。每1lpbs分散800μg胎盘间充质干细胞外泌体和10mg纳米氧化铈。每10ml水溶解1.1g卡波姆、0.08g维生素a、0.05g维生素c和0.05g维生素e。
33.防水层选用甲基丙烯酸明胶，取甲基丙烯酸明胶覆于多孔微针板模具远离微针的一面；取聚二甲基硅氧烷(pdms)单体和固化剂，以质量比计，以10:1混匀，真空脱气30min制得背衬层，覆于甲基丙烯酸明胶的一面。
34.以质量比计，防水层、背衬层、微针表层、微针内核的配比为2:1:8:2。
35.微针贴剂中的微针的针长为100微米，针宽为10微米，微针贴剂针尖的形状从上至下为斜尖、锥尖、斜尖。斜尖和锥尖分布面积相同。
36.实施例3
37.本实施例提供了一种含胎盘间充质干细胞外泌体微针贴剂的制备。
38.将胎盘间充质干细胞外泌体和纳米氧化铈均匀分散在pbs中制得微针内核的混合液；将卡波姆、维生素a、维生素c和维生素e溶于水中，搅拌溶胀后，将ph调至7，加入15％质量的plga，置于50℃下溶解，制成胶状，然后向其中加入plga质量5％的脱模剂peg(分子量4000g/mol)，混合均匀，并迅速倒入多孔微针模板中，减压至-70kpa，0℃环境下冷却，制得多孔微针板模具；将微针内核的混合液灌注至多孔微针板模具中，真空干燥36h，然后置于无水乙醇中超声清洗3次。
39.纳米氧化铈的平均粒径为100nm。每1lpbs分散1000μg胎盘间充质干细胞外泌体和20mg纳米氧化铈。每10ml水溶解1.3g卡波姆、0.1g维生素a、0.1g维生素c和0.1g维生素e。
40.防水层选用乙酰透明质酸，取乙酰透明质酸覆于多孔微针板模具远离微针的一面；取聚二甲基硅氧烷(pdms)单体和固化剂，以质量比计，以10:1混匀，真空脱气30min制得背衬层，覆于乙酰透明质酸的一面。
41.以质量比计，防水层、背衬层、微针表层、微针内核的配比为2:1:8:2。
42.微针贴剂中的微针的针长为100微米，针宽为10微米，微针贴剂针尖的形状从上至下为斜尖、锥尖、斜尖。斜尖和锥尖分布面积相同。
43.实施例4
44.本实施例提供了一种含胎盘间充质干细胞外泌体微针贴剂的缓解椎间盘退变模型小鼠步态异常，缓解小鼠椎间盘退变的试验。
45.采用针刺方式制备小鼠椎间盘退变模型(idd)，从而诱发腰腿痛。从西安交通大学医学部实验动物中心获得15周龄的c57bl/6雄性小鼠，每组试验设有10只小鼠，并通过了西安交通大学卫生科学中心伦理委员会的审查和批准。将小鼠随机分为假手术组；idd 实施例1普通贴组，实施例1普通贴为plmsc-exo、纳米氧化铈、维生素a、维生素c和维生素e用量同实施例1，区别在于制备为普通无微针的贴剂；idd 实施例2通贴组，实施例2普通贴为plmsc-exo、纳米氧化铈、维生素a、维生素c和维生素e用量同实施例2，区别在于制备为普通无微针的贴剂；idd 实施例3普通贴组，实施例3普通贴为plmsc-exo、纳米氧化铈、维生素a、维生素c和维生素e用量同实施例3，区别在于制备为普通无微针的贴剂；idd 实施例1外泌体微针贴组；idd 实施例2外泌体微针贴组；idd 实施例3外泌体微针贴组。
46.将小鼠置于标准实验室条件下(温度控制在21
±
1℃)的房间中，以正常的12h光照/12h黑暗周期饲养。涉及动物程序的研究方案与rush机构动物护理和使用委员会(iacuc)以及西安交通大学iacuc卫生科学中心的指南一致。所有手术操作均在无菌条件下在显微镜下进行。将小鼠(15周龄)置于仰卧位，并用含有1.5％异氟烷的氧气以2l/min的速率通过面罩进行麻醉。剃毛并消毒皮肤后，用#15刀片手术刀切成长度约1.5cm的左腹部外侧纵向切口。使用骨盆边缘作为解剖学标志来识别l5/6和l6/s1椎间盘。为诱发idd，首先在聚乙烯塞子套筒的引导下，使用锋利的微型手术刀以0.7mm的深度在中线处刺穿椎间盘。通过相同的切口，使用另一个带有弯曲点的微型手术刀进行第二次穿刺，以进一步破坏髓核
组织。除了没有进行椎间盘穿刺，假手术组的小鼠接受了idd手术穿刺前的所有方面的操作。造模结束后用4-0静脉缝线缝合皮肤切口，术后第03天依照分组进行药物处理，每7天进行换药。通过digigait系统进行步态分析，在15cm/s速度下观察小鼠在药物处理后第07天、第14天和第42天步态的行为变化。
47.如图2所示，第07天结果显示，与假手术小鼠(假手术组)相比，其余6组具有idd模型的小鼠表现出摆动时间(swing)减少(p《0.05)，并且在其余6组之间没有观察到差异，与何种处理无关(p》0.05)；第14天结果显示，与第07天结果相比，idd 外泌体微针贴组(idd 实施例1外泌体微针贴组、idd 实施例2外泌体微针贴组、idd 实施例3外泌体微针贴组)的3组小鼠表现出摆动时间(swing)增加(p《0.05)，而idd 普通贴组(idd 实施例1普通贴组、idd 实施例2普通贴组、idd 实施例3普通贴组)的3组小鼠与第07天结果之间没有观察到差异(p》0.05)；第42天结果显示，与第14天结果相比，dd 普通贴组的3组小鼠表现出摆动时间(swing)增加(p《0.05)，但少于idd 外泌体微针贴组的3组小鼠表现出的摆动时间(swing)。
48.如图3所示，第07天结果显示，与假手术小鼠(假手术组)相比，其余6组具有idd模型的小鼠表现出制动时间(brake)减少(p《0.05)，并且在其余6组之间没有观察到差异，与何种处理无关(p》0.05)；第14天结果显示，与第07天结果相比，其余6组小鼠均表现出制动时间(brake)增加(p《0.05)，但idd 普通贴组增加幅度均低于idd 外泌体微针贴组(p《0.05)；第42天结果显示，与第14天结果相比，idd 普通贴组的3组小鼠表现出制动时间(brake)增加(p《0.05)，但少于idd 普通贴组组的3组小鼠表现出的制动时间(brake)。
49.如图4所示，第07天结果显示，与假手术小鼠(假手术组)相比，其余6组具有idd模型的小鼠表现出脚掌面积(paw area)减少(p《0.05)，并且在其余6组之间没有观察到差异，与何种处理无关(p》0.05)；第14天结果显示，与第07天结果相比，其余6组小鼠均表现出脚掌面积(paw area)增加(p《0.05)，但idd 普通贴组增加幅度均低于idd 外泌体微针贴组(p《0.05)；第42天结果显示，与第14天结果相比，idd 普通贴组的3组小鼠表现出脚掌面积(paw area)增加(p《0.05)，但少于idd 普通贴组组的3组小鼠表现出的脚掌面积(paw area)。
50.如图5所示，第07天结果显示，与假手术小鼠(假手术组)相比，其余6组具有idd模型的小鼠表现出步幅频率(stride frequency)增加(p《0.05)，并且在其余6组之间没有观察到差异，与何种处理无关(p》0.05)；第14天结果显示，与第07天结果相比，其余6组小鼠均表现出步幅频率(stride frequency)减少(p《0.05)，但idd 普通贴组减少幅度均低于idd 外泌体微针贴组(p《0.05)；第42天结果显示，与第14天结果相比，idd 普通贴组的3组小鼠表现出步幅频率(stride frequency)减少p《0.05)，但高于idd 普通贴组组的3组小鼠表现出的步幅频率(stride frequency)(p《0.05)。
51.由图2-图5可得，本发明提供的含胎盘间充质干细胞外泌体微针贴剂能有效缓解小鼠椎间盘退变模型下的步态行为异常。试验结束后经过组织学评分番红固绿染色和椎间盘炎症测量可知，本发明提供的一种含胎盘间充质干细胞外泌体微针贴剂可逆转椎间盘退变并抑制退变椎间盘病灶炎症反应。
52.实施例5
53.本实施例提供了一种含胎盘间充质干细胞外泌体微针贴剂的缓解的临床试验。
54.实验分组：175例患者随机分为外泌体微针贴组、纯微针贴组、普通贴组、阳性对照
组、空白对照组。
55.其中外泌体微针贴组为实施例1微针贴剂组、实施例2微针贴剂组、实施例3微针贴剂组；纯微针贴组为不负载外泌体的微针贴剂；普通贴组为无微针的贴剂；阳性对照组为实施例2提供的微针贴剂，区别在于微针内核仅含胎盘间充质干细胞外泌体，所述微针表层仅含卡波姆；空白对照组为无贴剂组。每组患者25例，各组患者在性别、年龄、疾病持续时间、疼痛程度、及合并症等方面均无显著性差异(p》0.05)。为避免伦理问题，各组服用相同剂量的抗炎药塞来昔布，每日2次，治疗周期为7天。上述各组贴剂，每日1次；治疗7天后停药，停药后评价疗效。记录各组腰腿痛程度、腰腿部功能及生活质量评估。腰腿部疼痛采用视觉模拟评分法(vas)，腰腿部功能采用odi评分，生活质量采用sf-36评分表评价。以上量表随访周期为1周、1个月及6个月。
56.病人纳入标准：1)腰腿痛》3个月，年龄14-25周岁；2)mri或ct显示腰椎间盘突出症的症状及体征与影像表现相吻合者；3)影像学检查为椎间盘轻度膨出者；4)患者有强烈的治疗欲望。
57.病人排除标准：1)脊柱骨折、肿瘤及椎间盘感染者，有皮肤感染影响穿刺者；2)合并心理性疾病或认知功能障碍者；3)活动性肺结核或心、肺、肝、肾等重要器官严重疾患者；4)各种原因引起的出血或凝血功能异常者；5)月经期、哺乳期者；6)未签署知情同意书者。各量表评分结果如表1所示。
58.表1，青少年患者的vas、odi和sf-36评价情况比较
[0059][0060]
如表1所示，外泌体微针贴组较阳性对照组和空白对照组在vas评价结果上均有所下降，差异有统计学意义(p＜0.05)，外泌体微针贴组较阳性对照组和空白对照组在odi评价结果上均有所上升，差异有统计学意义(p＜0.05)，外泌体微针贴组较阳性对照组和空白对照组在sf-36评价结果上均有所上升，差异有统计学意义(p＜0.05)。由表1可知，外泌体微针贴组较阳性对照组，对疼痛患者的缓解效果更佳(p＜0.05)，并在腰腿部功能和生活质量改善方面表现出更为优秀的效果。
[0061]
如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。