一种复合骨缺损填补剂及其制备方法

1.本发明属于医药领域，涉及一种医疗器械，具体涉及一种复合骨缺损填补剂及其制备方法。


背景技术：

2.许多情况下，这些骨组织受损部位的形状并不规则，而对于大面积的损伤，骨组织很难自我修复。为了促进骨组织修复，需要对骨缺失部分进行填补。
3.在众多骨缺损填补剂中，自体骨无排异性，相容性最好，但是自体骨来源有限，因此，亟需使用易塑形的人工骨替代材料填充受损部位，达到骨组织修复的目的。最初用于临床的可塑形人工骨修复材料主要是聚甲基丙烯酸甲酯类骨水泥，虽然此类骨水泥易成型、粘结性好，但是这种材料与人体骨成份截然不同，不可降解，生物相容性差，而且聚合使用时，局部温度过高，会损伤周围正常组织，临床使用具有一定局限性。随后，磷酸钙骨水泥的使用，改善了材料的生物相容性，然而，其粘结性大、机械性能不足、降解缓慢等缺点还是限制了其的应用。目前，以羟基磷灰石及硅酸盐为主要成分的生物陶瓷和生物玻璃，由于具有骨传导活性，已经广泛应用于骨科临床。然而，单纯的生物陶瓷以及生物玻璃存在脆性大、易碎、抗疲劳能力差的缺陷，并且，在体内不易降解，这也使其应用受到了限制。
4.发明人在先的专利申请cn106512085a公开了一种用于填补骨缺损的复合膏剂，将无机组份加入到功能分子的水溶液中进行吸附，然后减压干燥除去水分得到吸附有功能分子的无机组份，将吸附有功能分子的无机组份加入到高分子基底中，搅拌混合均匀，得到用于填补骨缺损的复合膏剂。本发明通过微纳米级的羟基磷灰石、β-磷酸三钙等无机类组分吸附促进骨再生的功能分子，并与具有一定粘度的高分子类组分复合，所得复合膏剂粘度可调控，易塑形，且体内可吸收，具有良好的骨修复能力。实际应用中，依然存在一定的不足，有待进一步改进。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种复合骨缺损填补剂及其制备方法。
6.本发明所采取的技术方案是：本发明的第一个方面，提供：一种复合骨缺损填补剂，主要由脱细胞神经基质凝胶、功能分子、交联剂和固体成骨基质组成。
7.在一些复合骨缺损填补剂的实例中，脱细胞神经基质凝胶与交联剂的混合比为100 ml：(1～3)g。
8.在一些复合骨缺损填补剂的实例中，所述功能分子选自促进骨再生、神经再生和血管再生的细胞因子；和/或所述固体成骨基质选自脱细胞骨粉、纳米级或微米级的羟基磷灰石、β-磷酸三钙、
生物陶瓷中的至少一种；和/或所述交联剂为京尼平。
9.在一些复合骨缺损填补剂的实例中，所述功能分子选自骨形态发生蛋白-2、血管内皮生长因子中的至少一种。
10.在一些复合骨缺损填补剂的实例中，骨形态发生蛋白-2的浓度为0.1～1μg/ml；和/或血管内皮生长因子的浓度为0.1～1μg/ml。
11.在一些复合骨缺损填补剂的实例中，脱细胞神经基质凝胶的制备方法包括：s1) 取新鲜哺乳动物脊髓，剪去脊髓表面的脂肪组织和部分神经外膜，无菌漂洗干净；s2) 使用胰蛋白酶消化，之后加入trition-x100溶液、sds溶液，得脱细胞神经基质；s3) 将脱细胞神经基质冷冻干燥、粉碎，加入胃蛋白酶酶解完成得到。
12.在一些复合骨缺损填补剂的实例中，所述哺乳动物为猪、牛、羊。
13.在一些复合骨缺损填补剂的实例中，脱细胞神经基质凝胶的制备方法包括：s1) 取新鲜猪脊髓，剪去脊髓表面的脂肪组织和部分神经外膜，放置于无菌水中漂洗6小时；s2) 0.02% trypsin/0.05% edta浸泡1小时；使用3% trition-x100溶液震荡漂洗12小时；无菌水漂洗4次；4% sds溶液震荡24小时；蒸馏水漂洗1小时；4% sds溶液震荡24小时；蒸馏水漂洗1小时，制得脱细胞神经基质；s3) 将脱细胞神经基质进行冷冻干燥、粉碎，加入胃蛋白酶液、0.01 mol/l hcl，脱细胞基质：胃蛋白酶：hcl的体积比=10:1:1，在磁力搅拌器上搅拌48 h。
14.在一些复合骨缺损填补剂的实例中，所述脱细胞骨粉的制备方法包括：s1) 取新鲜健康的股骨，清水洗去除表面油脂；s2) 1%～3%双氧水浸泡一定时间后，无菌水冲洗干净；s3) 1%～2%十二烷基磺酸钠浸泡，无菌水冲洗干净；s4) 胃蛋白酶解液酶解，无菌水冲洗干净；s5) 冷冻干燥后破碎至粒径不大于180目。
15.在一些复合骨缺损填补剂的实例中，所述股骨来自猪或牛。
16.本发明的第二个方面，提供：本发明第一个方面所述复合骨缺损填补剂的制备方法，包括：将脱细胞基质、交联剂、功能分子混合均匀，得预交联基质；在预交联基质中加入固体成骨基质，进一步混匀、消毒密封得到复合骨缺损填补剂。
17.在一些制备方法的实例中，骨形态发生蛋白-2的浓度为0.1～1μg/ml，血管内皮生长因子的浓度为0.1～1μg/ml。
18.本发明的有益效果是：本发明一些实例的复合骨缺损填补剂，是具有一定交联度的水凝胶基质，有一定的强度，但是具有易塑性，可修复规则或不规则骨缺损。
19.本发明一些实例的复合骨缺损填补剂，含有促进骨再生、神经再生、血管再生的成分，有利于骨缺损修复。
20.本发明一些实例的复合骨缺损填补剂，通过控制交联度，可以方便控制水凝胶的降解时间及功能分子释放，具有更佳的骨缺损修复功能。
附图说明
21.图1是复合骨缺损填补剂中bmp-2、vegf的释放曲线。
22.图2是兔桡骨中段半缺损模型考察复合骨缺损填补剂的成骨效果，（a）脱细胞神经基质凝胶骨填补剂组；（b）脱细胞小肠粘膜下层基质凝胶骨填补剂组；（c）脱细胞角膜基质凝胶骨填补剂组；（d）空白对照组。
23.图3是样本的成骨面积统计结果。
具体实施方式
24.本发明的第一个方面，提供：一种复合骨缺损填补剂，主要由脱细胞神经基质凝胶、功能分子、交联剂和固体成骨基质组成。
25.在一些复合骨缺损填补剂的实例中，脱细胞神经基质凝胶与交联剂的混合比为100 ml：(1～3)g。通过控制交联剂的加入量，可以对脱细胞神经基质凝胶交联度进行相应的调整，交联度的变化导致填补剂的强度、功能分子的释放速率等发生相应的变化，满足不同的需要。
26.功能分子可以是各种已知的骨修复促进剂，包括但不限于骨再生促进因子、血管再生促进因子、神经再生促进因子。功能分子通过脱细胞神经基质凝胶的作用，可以达到平缓释放、长期释放，长期发挥作用。在一些复合骨缺损填补剂的实例中，所述功能分子选自促进骨再生、神经再生和血管再生的细胞因子。
27.在一些复合骨缺损填补剂的实例中，所述固体成骨基质选自脱细胞骨粉、纳米级或微米级的羟基磷灰石、β-磷酸三钙、生物陶瓷中的至少一种。
28.在一些复合骨缺损填补剂的实例中，所述交联剂为京尼平。京尼平无毒，是更佳的选择。
29.在一些复合骨缺损填补剂的实例中，所述功能分子选自骨形态发生蛋白-2、血管内皮生长因子中的至少一种。
30.在一些复合骨缺损填补剂的实例中，骨形态发生蛋白-2的浓度为0.1～1μg/ml。
31.在一些复合骨缺损填补剂的实例中，血管内皮生长因子的浓度为0.1～1μg/ml。
32.在一些复合骨缺损填补剂的实例中，脱细胞神经基质凝胶的制备方法包括：s1) 取新鲜哺乳动物脊髓，剪去脊髓表面的脂肪组织和部分神经外膜，无菌漂洗干净；s2) 使用胰蛋白酶消化，之后加入trition-x100溶液、sds溶液，得脱细胞神经基质；s3) 将脱细胞神经基质冷冻干燥、粉碎，加入胃蛋白酶酶解完成得到。
33.在一些复合骨缺损填补剂的实例中，所述哺乳动物为猪、牛、羊。
34.在一些复合骨缺损填补剂的实例中，脱细胞神经基质凝胶的制备方法包括：s1) 取新鲜猪脊髓，剪去脊髓表面的脂肪组织和部分神经外膜，放置于无菌水中漂洗6小时；s2) 0.02% trypsin/0.05% edta浸泡1小时；使用3% trition-x100溶液震荡漂洗12小时；无菌水漂洗4次；4% sds溶液震荡24小时；蒸馏水漂洗1小时；4% sds溶液震荡24小时；蒸馏水漂洗1小时，制得脱细胞神经基质；s3) 将脱细胞神经基质进行冷冻干燥、粉碎，加入胃蛋白酶液、0.01 mol/l hcl，脱细胞基质：胃蛋白酶：hcl的体积比=10:1:1，在磁力搅拌器上搅拌48 h。
35.在一些复合骨缺损填补剂的实例中，所述脱细胞骨粉的制备方法包括：s1) 取新鲜健康的股骨，清水洗去除表面油脂；s2) 1%～3%双氧水浸泡一定时间后，无菌水冲洗干净；s3) 1%～2%十二烷基磺酸钠浸泡，无菌水冲洗干净；s4) 胃蛋白酶解液酶解，无菌水冲洗干净；s5) 冷冻干燥后破碎至粒径不大于180目。
36.在一些复合骨缺损填补剂的实例中，所述股骨来自猪或牛。
37.本发明的第二个方面，提供：本发明第一个方面所述复合骨缺损填补剂的制备方法，包括：将脱细胞基质、交联剂、功能分子混合均匀，得预交联基质；在预交联基质中加入固体成骨基质，进一步混匀、消毒密封得到复合骨缺损填补剂。
38.在一些制备方法的实例中，骨形态发生蛋白-2的浓度为0.1～1μg/ml，血管内皮生长因子的浓度为0.1～1μg/ml。
39.下面结合实例，进一步说明本发明的技术方案。
40.脱细胞神经基质的制备取新鲜猪脊髓，剪去脊髓表面的脂肪组织和部分神经外膜，放置于无菌水中漂洗6小时；0.02% trypsin/0.05% edta浸泡1小时；使用3% trition-x100溶液震荡漂洗12小时；无菌水漂洗4次；4% sds溶液震荡24小时；蒸馏水漂洗1小时；4% sds溶液震荡24小时；蒸馏水漂洗1小时，制得脱细胞神经基质，进行冷冻干燥；脱细胞神经冷冻干燥后粉碎，加入胃蛋白酶、0.01 mol/l hcl（脱细胞基质：胃蛋白酶：hcl=10:1:1，先将胃蛋白酶和盐酸混合均匀后加入脊髓脱细胞基质粉末）在磁力搅拌器上搅拌48 h。
41.脱细胞骨粉的制备取新鲜股骨干（猪源或牛源），清水洗去除表面油脂。
42.1%～3%双氧水浸泡2小时；无菌水冲洗3次；1%～2%十二烷基磺酸钠浸泡4小时；无菌水冲洗3次；胃蛋白酶与0.01mol/l hcl（1:1～2:1）浸泡2小时；无菌水冲洗3次；重复上述步骤3次；冷冻干燥机-40℃条件下冷冻干燥48小时。
43.将脱细胞骨置于粉碎机钟粉碎，180目的筛网过筛得到骨粉。
44.复合骨缺损填补剂的制备在100ml的脱细胞基质（10%～15%，w/v）溶液中加入交联剂京尼平（1%～3%，w/v）、bmp-2（0.1～1μg/ml）、vegf（0.1～1μg/ml），搅拌10min后，加入脱细胞骨粉（10g～50g的纳
米级或微米级），机械搅拌30min，消毒密封。
45.实施例1配置100ml不同来源的脱细胞基质凝胶（15%，w/v）溶液，加入不同量的京尼平（2%，w/v）、bmp-2（1μg/ml）、vegf（0.5μg/ml），搅拌10min溶解后，加入20g脱细胞骨粉，机械搅拌30min，消毒密封，制得复合骨缺损填补剂。
46.复合骨缺损填补剂中bmp-2、vegf的释放如图1所示，可见，不同交联剂京尼平的用量下，在各时间点，累积释放量不同。
47.采用兔桡骨中段半缺损模型考察复合骨缺损填补剂的成骨效果。用牙科钻在桡骨中段制造10mm
×
3mm
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3mm缺损后，涂抹复合骨缺损填补剂。术后两个月，见明显新骨生成（图2）。图2中，（a）脱细胞神经基质凝胶骨填补剂组；（b）脱细胞小肠粘膜下层基质凝胶骨填补剂组；（c）脱细胞角膜基质凝胶骨填补剂组；（d）空白对照组。对比可知，脱细胞神经基质凝胶骨填补剂组的新生骨形成显著好于脱细胞小肠粘膜下层基质凝胶骨填补剂组和脱细胞角膜基质凝胶骨填补剂组。
48.分别于1个月、两个月取样本做成骨面积统计（图3），可见，相对于空白对照组，复合骨缺损填补剂具有明显的修复优势，脱细胞神经基质凝胶骨填补剂组具有最大的成骨面积。
49.以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。