甘草次酸单糖苷在制备预防和治疗肺纤维化药物中的应用的制作方法

1.本发明属于医药领域，尤其涉及甘草次酸单糖苷在制备预防和治疗肺纤维化药物中的应用。


背景技术：

2.特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，ipf)是一种致命的、进行性肺部纤维化间质性疾病，好发于中老年人群。其特征性病理改变类型为普通型间质性肺炎(usual interstitial pneumonitis，uip)，表现为轻中度炎症浸润、肺泡上皮细胞损伤和增生、细胞外基质(ecm)过度沉积、肺泡间隔增厚、瘢痕和成纤维细胞病灶的形成，以及肺结构的时间异质性纤维化重塑。随着肺纤维化进行性的改变，肺组织失去了气体交换能力，诊断后平均寿命仅为3年，患者5年内生存率低于30％，比大多数癌症的生存率都低，所以ipf又常被称作“不是癌症的癌症”。另一方面，特发性肺纤维化(ipf)病因不明，发病率和死亡率逐年上升，目前除了肺移植外，几乎没有治疗选择，也没有有效的治疗药物，fda仅批准了吡非尼酮和尼达尼布作为ipf的一线治疗药物)，然而由于多种副作用导致的患者依从性低，其临床应用受到限制。因此迫切需要寻找具有改善药物特性和降低药物副作用的新型抗ipf药物。


技术实现要素：

3.为了解决上述问题，本发明提供甘草次酸单糖苷在制备预防和治疗肺纤维化药物中的应用。
4.通过以下制备工艺来实现上述目的：
5.本发明提供甘草次酸单糖苷在制备预防和治疗肺纤维化药物中的应用。
6.作为本发明的进一步优化方案，将甘草次酸单糖苷加入药学上可接受的辅料制成临床可用的药物剂型。
7.作为本发明的进一步优化方案，所述药物剂型为片剂、胶囊剂、锭剂、注射剂、混悬剂、栓型、软膏剂中的一种或多种。
8.作为本发明的进一步优化方案，所述辅料为载体或赋形剂。
9.作为本发明的进一步优化方案，所述赋形剂为碳微晶纤维素、淀粉、乳糖、交联聚维酮、羟丙基纤维素中的一种或多种。
10.作为本发明的进一步优化方案，所述载体为稀释剂、崩解剂、粘合剂或润滑剂中的一种或多种。
11.作为本发明的进一步优化方案，所述药物中甘草次酸单糖苷的剂量为50-500mg/kg/d。
12.作为本发明的进一步优化方案，所述药物中甘草次酸单糖苷的剂量为200mg/kg/d。
13.本发明的原理为：
14.甘草是一种较为常见的补益中草药，甘草酸(gl)是甘草中主要的生物活性成分，具有良好的抗炎活性，且肺组织分布浓度高，能够改善肺纤维化的炎症、氧化应激、上皮间充质转变等，具有较好的抗炎作用肺纤维化伴随有炎症反应。甘草次酸单糖苷(18β-glycyrrhetinic acid 3-o-β-d-glu curonide，gamg)作为五环三萜苷元甘草次酸的葡萄糖醛酸衍生物，ga mg是gl在3位碳上脱去一分子葡萄糖醛酸的活性代谢产物，其路径如图9所示。
15.甘草次酸单糖苷(gamg)与甘草酸(gl)相比，具有显著优势：(1)gamg是gl的的活性代谢产物，安全性高；(2)药代动力学表明：大鼠口服gl的c
max
为346.03
±
145.13ng/ml，auc
0-t
为459.32
±
80.81mg/l*h；大鼠口服gamg的c
max
为2377.57
±
547.40ng/ml，为6625.54
±
1680.70mg/l*h；分别为gl的6.9倍和14.4倍，gamg的口服生物利用度显著高于gl；(3)gamg在肺、肾脏、肝脏等组织分布浓度高，用于肺纤维化的治疗更有效；(4)gamg比gl具有更强的抗炎、抗氧化等药理活性：(5)gamg的水溶性明显优于gl，成药性良好，不良反应小。gamg用于肺纤维化的预防和治疗尚未见报道，其抗肺纤维化的作用机制如图8所示。
16.本发明的有益效果在于：甘草次酸单糖苷是新研发的预防和治疗肺纤维化药物，本发明首次发现甘草次酸单糖苷通过抑制pi3k/akt/nf-κb信号通路的激活，能够减轻肺纤维化的炎症反应和胶原沉积的分子机制，基于此，本发明提供了化合物甘草次酸单糖苷在制备预防和治疗肺纤维化药物中的应用，或该化合物及药学上可以的辅料在制备肺纤维化药物中的新应用。
附图说明
17.图1为各组小鼠肺组织he(200
×
)效果对比图；
18.图2为各组小鼠肺组织masson(200
×
)效果对比图；
19.图3为各组小鼠肺组织sirius red染色(200
×
)效果对比图；
20.图4为各组小鼠肺组织ihc(200
×
)效果对比图；
21.图5为gamg降低小鼠炎症细胞因子的分泌图；
22.图6为gamg通过抑制pi3k/akt/p65nf-κb254信号通路改善纤维化症状：(a)用免疫印迹法检测肺组织中pi3k/akt/p65nf-κb蛋白的含量。(b)p-pi3k/pi3k、p-akt/akt和p-p65/p65相对蛋白表达水平(上图)；pi3k/β-actin,akt/β-actin和p65/β-actin在各组中的相对表达量(下图)；
23.图7为50-500mg/kg剂量的gamg组对炎症因子il-1β的抑制作用；
24.图8为化合物甘草次酸单糖苷抗肺纤维化的作用机制图；
25.图9为化合物甘草次酸单糖苷的获得路径。
具体实施方式
26.下面结合附图对本技术作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本技术进行进一步的说明，不能理解为对本技术保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本技术做出一些非本质的改进和调整。
27.一、具体实施例
28.本实施例所用制备方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，
比如，制备成片剂、胶囊剂、锭剂、注射剂、混悬剂、栓型、软膏剂等剂型的方法均为常规方法，所用的载体或赋形剂等材料，其中赋形剂为碳微晶纤维素、淀粉、乳糖、交联聚维酮、羟丙基纤维素；载体为稀释剂、崩解剂、粘合剂或润滑剂，如无特别说明，均为市售购买产品。
29.以下提供各含100mg活性成分甘草次酸单糖苷的片剂(1000片)的制备过程：
30.按照表1中各成分用量，将活性成分甘草次酸单糖苷与微晶纤维素、淀粉和乳糖混合，将该混合物用75％乙醇湿润并且过筛制粒。
31.干燥后，与交联聚维酮、硬脂酸镁混合均匀，压片，片重分别为350.0mg，活性成分含量100mg。
32.表1含有甘草次酸单糖苷的片剂各成分用量
[0033][0034]
二、试验
[0035]
1、材料
[0036]
7-8周龄雌性c57/bl小鼠，由安徽省第二人民医院实验动物中心提供，饲养于(25
±
2)℃净化通风动物房，自由进食及饮水。
[0037]
2、方法
[0038]
2.1制备实验动物模型
[0039]
选取7-8周龄雌性c57/bl小鼠120只，随机分为4组，每组30只，实验设置设置空白对照组给予生理盐水气管滴注，另设模型对照组、甘草次酸单糖苷gamg组(给药浓度200mg/kg/28d)、甘草酸gl组(给药浓度200mg/kg/28d)，对模型对照组、甘草次酸单糖苷gamg组、甘草酸gl组均采用腹腔注射给药(制备过程为：将活性成分甘草次酸单糖苷原料，加入到适量注射用水中，充分搅拌，补加注射用水定量至给药浓度，加入针用活性碳2.0g，加热至60℃搅拌30min，碳棒过滤，滤液经0.25μm微孔滤膜过滤除菌后获得；但不仅限于该制备过程)，在气管滴注诱导物(单壁碳纳米管swcnt)30min之前给予3组小鼠腹腔注射药物，连续28天给药，分别在给药第3、7、28天对分别对4组中的其中10只小鼠进行取材。
[0040]
2.2评价指标及结果
[0041]
通过第3、7、28天对不同组别的小鼠进行肺组织分离，制作石蜡切片，石蜡切片行he、masson、sirius red以及ihc染色观察肺组织损伤情况。肺部炎症和肺纤维化评分标准参考炎症评分和ashcroft scores。
[0042]
2.2.1he染色结果
[0043]
通过图1的he染色结果可看出，3天炎症因子最多，28天小鼠肺组织he病理切片观察到，炎症因子下降，小鼠模型对照组与空白对照组相比，肺组织结构紊乱，且瘢痕组织明显增多，gamg组相比于模型对照组肺结构相对较好，且瘢痕减少，对肺起到保护作用。图1中柱状图是分别对第3天、第7天和第28天he染色结果的统计描述，数据重复三次，
*
p《0.05vs对照组；
#
p《0.05vs swcnt组；
*#
p《0.05vs swcnt gl组。
[0044]
2.2.2masson染色结果
[0045]
通过图2的masson染色结果可看出，模型对照组与空白对照组相比，随着时间增加，蓝色胶原纤维明显增多，而gamg组能缓解蓝色胶原纤维的生成，说明可以缓解肺纤维化，改善肺功能，起到保护作用。
[0046]
图2中柱状图是分别对第3天、第7天和第28天swcnt暴露后肺组织胶原沉积的masson染色的统计描述，数据重复三次，
*
p《0.05vs对照组；
#
p《0.05vs swcnt组；
*#
p《0.05vs swcnt gl组。
[0047]
2.2.3sirius red染色结果
[0048]
通过图3的sirius red染色结果可看出，模型对照组与空白对照组相比，随着时间增加，胶原纤维沉积明显增多，而gamg组能缓解胶原纤维的生成，也说明可以缓解肺纤维化，改善肺功能，起到保护作用。
[0049]
2.2.4ihc染色结果
[0050]
通过图4的ihc染色结果可看出，模型对照组与空白对照组相比，随着时间增加，胶原纤维沉积明显增多，而gamg组能缓解上皮至间质的生成，说明可以缓解肺纤维化，改善肺功能，起到保护作用。
[0051]
图4中柱状图是分别对肺成纤维细胞波形蛋白和α-sma蛋白水平的免疫组化分析的统计描述，数据重复三次，
*
p《0.05vs对照组；
#
p《0.05vs swcnt组；
*#
p《0.05vs swcnt gl组。
[0052]
2.2.5gamg减少炎性细胞因子分泌
[0053]
通过图5可看出，气管内注射单壁碳纳米管(swcnt)后3～28天，肺泡灌洗液中il-1β、il-6和肿瘤坏死因子(tnf-α)水平显著升高，28天时胶原沉积明显增加。
[0054]
炎症反应中细胞因子il-1β，tnf-α和il-6会上调，并参与成纤维细胞和细胞基质的形成。采用elisa试剂盒检测3天后各组肺组织中il-1β、tnf-α和il-6的表达水平均显著升高，而gamg组和gl组处理均显著降低这些细胞因子的产生。与gl组相比，gamg组(200mg/kg/d)能更有效地抑制肺组织炎症因子的表达。
[0055]
2.2.6western blotting实验结果
[0056]
通过图6可看出，单壁碳纳米管刺激pi3k-akt-nf-κb信号通路，激活磷酸化的pi3k(p-pi3k)和akt(p-akt)以及nf-κb(p-p65)的表达，gamg比gl更能有效抑制pi3k/akt磷酸化和nf-κb活化。
[0057]
(a)western blotting分析肺组织中pi3k/akt/nf-κb蛋白水平。(b)p-pi3k/pi3k、
p-akt/akt、p-p65/p65蛋白相对表达量(见图6上)；不同组pi3k/β-肌动蛋白、akt/β-肌动蛋白、p65/β-肌动蛋白的相对蛋白表达水平(图6下)。数据以每组独立实验的平均值
±
sem表示(n＝3)。
*
p《0.05vs对照组；；
#
p《0.05vs swcnt组；；
*#
p《0.05vs swcnt gl组。
[0058]
2.2.7不同剂量gamg组对炎症因子il-1β的抑制作用(预实验)
[0059]
选取7-8周龄雌性c57/bl小鼠42只，随机分为7组，每组6只，按照不同给药浓度采用腹腔注射给药，并设立模型对照组以及给药浓度分别为50mg/kg/d、100mg/kg/d、200mg/kg/d、300mg/kg/d、400mg/kg/d、500mg/kg/d，在气管滴注诱导物(单壁碳纳米管swcnt)30min之前给予3组小鼠腹腔注射药物，连续3天给药，分别在第3天对7组小鼠进行取材进行检测。
[0060]
研究发现随着时间的增加，炎症逐渐减少，纤维化逐渐增加，并且为了在预实验中以最小的代价获得最大的结果，我们主要观察了不同组别的小鼠在3天炎症因子il-1β的释放，检测结果如图7所示，相比较模型对照组swcnt，可以发现，50-500mg/kg/d剂量的gamg均能有效地抑制肺组织炎症因子的表达，尤其200mg/kg剂量组表现出最好的炎症因子il-1β抑制作用，因此选择其作为给药浓度，能达到最佳治疗效果。
[0061]
2.3实验结论
[0062]
甘草次酸单糖苷gamg通过阻断pi3k-akt-nf-κb信号通路，抑制肺成纤维细胞炎症因子表达以及hyp和胶原合成来缓解肺纤维化症状。因此，化合物甘草次酸单糖苷(给药剂量：50-500mg/kg/d，优选200mg/kg/d)能有效治疗小鼠肺纤维化。
[0063]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进，这些都属于本发明的保护范围。