一种生物炭基芽孢杆菌菌剂的固态发酵制备及其应用

1.本发明属于微生物、土壤改良剂和生态改良应用领域，涉及芽孢杆菌固态发酵制备微生物菌剂的工艺，以及微生物菌剂在土壤修复和增加土壤碳汇等领域的应用。


背景技术：

2.我国土壤重金属污染日益严重。在这些重金属污染土壤中生长的蔬菜，其重金属含量一般都会超标，并以铅和镉超标为最多。重金属污染农田土壤修复的三种方法中，物理修复消耗人力、物力，并且治标不治本，化学修复可能造成二次污染，而生物修复中的微生物修复通过生物吸附和生物氧化—还原机制对污染土壤进行修复，具有效果好、投资省、费用低、易于管理与操作、不产生二次污染等优点，日益成为污染土壤修复研究的热点。
3.中国微生物菌剂领域的发展十分迅速，在修复土壤污染方面的应用正逐步上升。随着我国对生态农业和有机农业的推广与发展，固态发酵技术在农业生产中的应用日益广泛，已涵盖土壤改良剂、植物保护、生物饲料等多个领域。与液态发酵相比，固态发酵用水量少、“三废”排放少、能量消耗少、设备投资少、原料适用性强、产物浓度高。发展与推广固态发酵技术，替代或部分替代液态发酵，在节能减排中具有重要意义。细菌、放线菌和真菌等微生物菌剂均可采用固态发酵的方法生产。但有关修复菌剂的发酵培养基和培养条件优化技术、以及符合《农用微生物菌剂》国家标准的产品还很少见。
4.生物炭是由可再生生物质在密闭缺氧的条件下，经过高温热解而成的一种高科技产品。生物炭含碳量丰富、孔隙多、稳定性强，它能改善土壤质地，提高土壤肥力，增强土壤碳汇能力，降低重金属对植物的毒害，作为土壤改良剂被广泛应用。考虑到生物炭多孔性和营养作用，可以将生物炭作为微生物菌剂的载体材料。但大多数研究都将生物炭与菌液混合或与菌液混施。有关利用生物炭作为基质进行固态发酵生产菌剂的应用还未见报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的是针对固态发酵活菌数较低的问题，提供一种能够提高微生物菌剂有效活菌数的固态发酵工艺。
6.本发明的目的可通过如下技术方案实现：
7.保藏编号为cctcc no:m 20211144的短小芽孢杆菌(bacillus pumilus)yg35在降低蔬菜及农田土壤cd含量、促进蔬菜生长和/或增加土壤有机碳含量中的应用。
8.保藏编号为cctcc no:m 20211144的短小芽孢杆菌(bacillus pumilus)yg35在制备降低蔬菜及农田土壤cd含量、促进蔬菜生长和/或增加土壤有机碳含量的生物菌剂中的应用。
9.一种生物炭基芽孢杆菌菌剂，以含有生物炭的固态发酵培养基发酵权利要求1中所述的短小芽孢杆菌yg35制备得到.
10.作为本发明的一种优选，所述的固态发酵培养基由生物炭、糖蜜、大豆粉和水组成。
11.作为本发明的进一步优选，所述的固态发酵培养基以生物炭的质量为基准，其他组分的分重量百分比为：糖蜜2-3％、大豆粉1-3％、水45-50％。
12.作为本发明的更进一步优选，将生物炭过20目筛，取100g生物炭放入500ml锥形瓶中，再加入2.5％糖蜜(重量比)，2.0％大豆粉(重量比)，50ml水，搅拌均匀后封口，于121℃下灭菌25min后冷却即得固体发酵培养基。
13.作为本发明的一个优选实施例，所述的固态菌剂中yg35细胞数量达到2
×
109cfu/g以上。
14.作为本发明的一种优选，发酵条件为发酵温度为30-33℃优选30℃、最佳接种量为13％(％表示ml/100g生物炭)，发酵72～96h。
15.本发明所述的生物炭基芽孢杆菌菌剂在降低蔬菜及农田土壤cd含量、促进蔬菜生长和/或增加土壤有机碳含量中的应用。
16.有益效果
17.本发明选用短小芽孢杆菌yg35，分类命名为bacillus pumilus yg35，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年9月6日，菌种保藏号为cctcc m 20211144。对其固态发酵培养基和条件进行优化，提高了在成品菌剂的有效活菌数，制备生物炭基菌剂。
18.本发明所述的含有b.pumilus yg35的生物炭基菌剂(jhm03)能够促进蔬菜生长，显著降低重金属污染土壤和蔬菜cd含量，增加土壤有机碳含量。与现有技术相比有如下优点：
19.(1)本发明所述的b.pumilus yg35生物炭基菌剂(jhm03)的有效活菌数可达2.38
×
109cfu/g。
20.(2)生物炭基菌剂(jhm03)在室温下放置6个月后有效活菌数依旧能保持在8.7
×
108cfu/g。
21.(3)施撒生物炭基菌剂(jhm03)的重金属污染土壤有效态cd含量显著降低37.2％(p《0.05)。
22.(4)施撒生物炭基菌剂(jhm03)处理的菠菜、生菜、胡萝卜、白萝卜可食用部分cd含量显著降低36.7-66.7％(p《0.05)。
23.(5)施撒生物炭基菌剂(jhm03)处理的菠菜、生菜可食用部分干重显著增加74.7％和92.8％(p《0.05)，胡萝卜和白萝卜干重显著增加3.6倍和3.7倍(p《0.05)。
24.(6)施撒生物炭基菌剂(jhm03)的菠菜、生菜、胡萝卜、白萝卜根际土壤有机碳含量显著增加52.4-94.8％(p《0.05)。
具体实施方式
25.下面结合具体实施方式，对本发明的权利要求做进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何人在本发明权利要求保护范围之内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求保护范围之内。
26.以下实施例中除特例说明外，均为本领域内的常规实验方法和操作步骤。
27.实施例1固态发酵培养
28.将保藏在-80℃冰箱甘油管中的bacillus pumilus yg35(保藏编号为cctcc no:m 20211144，该菌株在cn113913331a中公开)置于37℃水浴锅中水浴60s解冻，后接入lb平板
中，于30℃培养箱中培养24h，进行菌种活化；将活化的菌种接入装有150ml lb液体培养基的250ml锥形瓶中，于30℃，180r/min振荡培养16h，作为种子液。将种子液添加到固态发酵培养基(将生物炭过20目筛，取100g生物炭放入500ml锥形瓶中，再加入2.5％糖蜜(重量比)，2.0％大豆粉(重量比)，50ml水，搅拌均匀后封口，于121℃下灭菌25min后冷却即得固体发酵培养基)中，接种量13％，30℃，静置培养3d，制得生物炭基菌剂jhm03。取样，按10倍梯度稀释涂布lb平板，计算有效活菌数。结果显示有效活菌数可达2.38
×
109cfu/g。
29.实施例2生物炭基菌剂jhm03保藏
30.在实施例1获得的生物炭基菌剂jhm03在室温，经过6个月储藏后，菌剂jhm03中有效活菌数保持在8.7
×
108cfu/g，符合农用微生物菌剂中有效活菌数的国家标准。
31.实施例3生物炭基菌剂降低重金属污染土壤和蔬菜cd含量的作用
32.采集南京市栖霞区重金属污染的土壤。布置盆栽实验，每个盆栽装1.5kg土，并向盆栽中添加去离子水700g，使整个土壤环境保持适宜含水量。处理组在盆栽土中混合5％实施例1制备的菌剂jhm03，不施加菌剂处理作为对照。选择生菜、菠菜、胡萝卜和白萝卜作为供试蔬菜。将蔬菜种子用5％的次氯酸钠溶液进行表面消毒20min后，置于无菌纱布上，放置在30℃无菌培养箱，保持湿度在60％～80％进行催芽，再挑取大小一致露白后的种子放置于水培钵上进行培养。当芽长到1cm左右时，挑选长势大小均匀一致的蔬菜幼苗种植。每个处理三个重复，进行为期45天的常规管理。收集蔬菜根际土测定土壤中有效态cd含量。将样品烘至恒重，用组织粉碎机磨碎。准确称取0.1g蔬菜样品进行微波消解，后用5％hno3定容，采用icp-oes测定消解液中的cd含量。由表5可知，与对照相比，施加菌剂处理后的蔬菜可食用部分cd含量显著降低36.7-66.7％，其中胡萝卜cd含量降低率最大(表1)。菠菜、生菜和白萝卜cd含量符合国家农业部(gb 2762-2017)关于绿色蔬菜、根菜类蔬菜中cd含量的相关规定，达到安全生产效果。
33.由表2可知，菌剂处理后蔬菜根际土有效态cd含量显著降低28.9-37.5％，生物有效性降低，缓解了cd毒害。
34.表1生物炭基菌剂jhm03降低蔬菜可食用部分cd含量(mg/kg)
[0035][0036][0037]
表2生物炭基菌剂jhm03降低蔬菜根际土壤有效态cd含量
[0038]
[0039]
实施例4重金属土壤中生物炭基菌剂jhm03促进蔬菜生长的作用
[0040]
收集实施例3中各处理的蔬菜，测定蔬菜可食用部分干重，以评判菌剂的增产效果。由表3可知，与对照相比，施加菌剂处理后的菠菜和生菜可食用部分干重显著增加74.7％和92.8％(p《0.05)，胡萝卜和白萝卜干重显著增加3.6倍和3.7倍，菌剂对蔬菜的增产作用显著。
[0041]
表3生物炭基菌剂jhm03促进蔬菜生长
[0042][0043]
实施例5重金属土壤中生物炭基菌剂jhm03增加蔬菜根际土有机碳含量
[0044]
收集实施例3中各处理的蔬菜根际土壤，取过100目的风干土样0.1g～1g，置于无水份的玻璃试管底部，用移液枪精准加入1/6k2cr2o7标准液5ml，再使用移液枪打入5ml浓硫酸，摇匀，管口盖弯颈漏斗，用冷凝蒸出水蒸气。将试管置于铁丝笼，放入190℃油浴锅，再调节油浴锅温度至170℃～180℃，待管内液体沸腾出气泡开始计时，沸腾5min，将试管取出并冷却至室温。冷却后，将管内液体及残渣无损转入三角瓶内，使三角瓶溶液总体积为60ml～70ml，并保持混合液浓度为2～3mol l-1
，然后使用邻啡啰琳指示剂进行滴定，滴定结束后换算土壤样品中所含有机碳含量。
[0045]
由表4可知，与对照相比，施加菌剂处理后的蔬菜根际土有机碳含量显著增加52.4-94.8％(p《0.05)，有利于培育土壤肥力。
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表4生物炭基菌剂jhm03增加蔬菜根际土壤有机碳
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