肾透明细胞癌早期诊断的分子标志物组

1.本发明涉及标志物组技术领域，具体为肾透明细胞癌早期诊断的分子标志物组。


背景技术：

2.肾透明细胞癌（ccrcc）是肾细胞癌中最常见的一种类型，其发病率和死亡率有逐年增高的趋势。ccrcc早期无明显表现，出现症状后说明肿瘤已进入晚期，手术以及放化疗效果较差，因此早期诊断对ccrcc意义重大。目前临床上ccrcc的诊断主要依靠影像学，虽然具有较高的特异性，但是难以筛查出体积较小的肿瘤或鉴别不明确性质的肾占位，从而导致肿瘤的漏诊或误诊。而最终诊断依赖于病理活检，但是组织活检也有一定局限性，比如说肿瘤的异质性以及在治疗过程中不能重复取样，经过活检刺激后或操作不当有加速播散转移的风险，这些都限制了组织活检在临床中的应用。因此，在精准医疗时代临床迫切需要新型、可靠的ccrcc早期诊断方法。
3.随着液体活检技术在肿瘤研究的不断深入，越来越多的血液分子标志物应用临床诊断，甚至全程监测。近些年，外泌体在疾病的诊疗方面的研究已成为学术界的热点，其快速发展极大地促进了生物标志物的进展。外泌体是直径大小约40nm
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160nm小细胞外囊泡，内含蛋白质、核酸、脂类等多种遗传物质，具有脂质双分子层可保护其内容物不在循环中降解，在维持细胞间物质和细胞交流中起重要作用。肿瘤来源的外泌体参与调控肿瘤的发生发展，在参与肿瘤转移、免疫逃逸等过程中也发挥重要作用。最新报道发现外周血外泌体rna可作为有价值的分子标志物用于癌症筛检，但目前缺乏对外泌体mrna在ccrcc早期诊断的研究。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供肾透明细胞癌早期诊断的分子标志物组，以解决上述背景技术中缺乏对外泌体mrna在ccrcc早期诊断的研究的问题。
5.为实现上述目的，本发明第一方面提供一种肾透明细胞癌早期诊断的分子标志物组，所述标志物组包括：外泌体源性cul9基因的mrna、外泌体源性kmt2d基因的mrna、外泌体源性pbrm1基因的mrna、外泌体源性prex2基因的mrna和外泌体源性setd2基因的mrna。
6.优选的，所述cul9基因的mrna选自第2-4号外显子；优选的，所述kmt2d基因的mrna选自第31号外显子、第51号外显子；优选的，所述pbrm1基因的mrna选自第2号外显子、第29-30号外显子；优选的，所述prex2基因的mrna选自第36-38号外显子；优选的，所述setd2基因的mrna选自第7-8号外显子或第14-15号外显子。
7.优选的，所述外泌体为血液、血浆或血清外泌体。
8.本发明第二方面提供了上述的标志物组在制备用于肾透明细胞癌诊断的产品中的应用。
9.优选的，所述肾透明细胞癌诊断包括肾透明细胞癌的早期筛查和鉴别诊断。
10.本发明第三方面提供了一种诊断或预测肾透明细胞癌的产品，所述产品包括检测上述的生物标志物的检测试剂；优选的，所述检测试剂包括外泌体提取试剂、核糖核酸抽提试剂和反转录试剂，以及荧光pcr反应液。
11.优选的，所述外泌体提取试剂包括用于pcr的上、下游引物和检测探针。
12.本发明第四方面提供了一种肾透明细胞癌早期诊断系统，包括：信息获取模块，所述信息获取模块用于执行获取受试者检测信息的操作，包括如上述标志物组的信息；模型建立模块，所述信息分析模块用于执行构建受试者标志物组信息的诊断模型，由此进行肾透明细胞癌早期诊断的分析。
13.本发明第五方面提供了一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，所述计算机程序被处理器执行时实现如上述的肾透明细胞癌早期诊断系统。
14.与现有技术相比，本发明的有益效果是：通过以外周血为切入点，易于临床转化；以外泌体作为肾癌液体活检的“突破口”，具有稳定、无创、实时、可重复的特点；通过找到肾癌相关的血清外泌体mrna表达谱以及肾癌相关差异基因，外泌体中mrna携有丰富的遗传信息，可以代表肿瘤特性，然后通过建立肾癌诊断模型，能够更为精确的指导肾癌临床早期诊断，也为肾癌诊断试剂盒的研发提供相关理论依据。
附图说明
15.图1为本发明实施例中反应液放入荧光pcr仪器反应完成后读取到的ct值的图；图2为本发明实施例中的目标基因的拷贝数的标准曲线图；图3为本发明的其中一个试验队列的roc曲线图；图4为本发明的其中一个试验队列的roc曲线图；图5为本发明的其中一个试验队列的roc曲线图；图6为本发明的其中一个试验队列的roc曲线图；图7为本发明的其中一个试验队列的roc曲线图。
具体实施方式
16.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
17.为了更好的对本发明进行理解，现对本发明中部分术语进行定义：本发明所述“ct值”是指pcr反应过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，其中c代表cycle，t代表threshold。
18.本发明所述cul9基因为cullin 9基因，共41个外显子。
19.本发明所述kmt2d基因为lysine methyltransferase 2d基因，共55个外显子。
20.本发明所述pbrm1基因为polybromo 1基因，共33个外显子。
21.本发明所述prex2基因为phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate dependent rac exchange factor 2基因，共40个外显子。
22.本发明所述setd2基因为set domain containing 2, histone lysine methyltransferase基因，共21个外显子。
23.本发明针对cul9、kmt2d、pbrm1、prex2和setd2基因设计引物：其中cul9覆盖2-4号外显子；kmt2d覆盖31、51号外显子；pbrm1覆盖2号、29-30号外显子；prex2覆盖36-38外显子；setd2覆盖7-8号、14-15号外显子。
24.其中，外显子的优选结果为：cul9基因序列的2号外显子；kmt2d基因序列的51号外显子；pbrm1基因序列的2号外显子；prex2基因序列的38号外显子；setd2基因序列的7号外显子。
25.实施例1本实施例提供一种肾透明细胞癌早期诊断的分子标志物组，所述标志物组包括：外泌体源性cul9基因的mrna、外泌体源性kmt2d基因的mrna、外泌体源性pbrm1基因的mrna、外泌体源性prex2基因的mrna和外泌体源性setd2基因的mrna。
26.优选的，所述cul9基因的mrna选自第2-4号外显子。
27.优选的，所述kmt2d基因的mrna选自第31号外显子、第51号外显子。
28.优选的，所述pbrm1基因的mrna选自第2号外显子、第29-30号外显子。
29.优选的，所述prex2基因的mrna选自第36-38号外显子。
30.优选的，所述setd2基因的mrna选自第7-8号外显子或第14-15号外显子。
31.优选的，所述外泌体为血液、血浆或血清外泌体。
32.本实施例还提供了上述的标志物组在制备用于肾透明细胞癌诊断的产品中的应用。
33.优选的，所述肾透明细胞癌诊断包括肾透明细胞癌的早期筛查和鉴别诊断。
34.本实施例还提供了一种诊断或预测肾透明细胞癌的产品，所述产品包括检测上述的生物标志物的检测试剂；优选的，所述检测试剂包括外泌体提取试剂、核糖核酸抽提试剂和反转录试剂，以及荧光pcr反应液。
35.优选的，所述外泌体提取试剂包括用于pcr的上、下游引物和检测探针。
36.本实施例还提供了一种肾透明细胞癌早期诊断系统，包括：信息获取模块，所述信息获取模块用于执行获取受试者检测信息的操作，包括如上述标志物组的信息；模型建立模块，所述信息分析模块用于执行构建受试者标志物组信息的诊断模型，由此进行肾透明细胞癌早期诊断的分析。
37.本实施例还提供了一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，所述计算机程序被处理器执行时实现如上述的肾透明细胞癌早期诊断系统。
38.实施例2本实施例的主要目的在于建立一种ccrcc诊断模型的构建方法，所述方法至少包括：1、早晨采集患者或健康人空腹外周血，然后将所有样本在1600
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g离心15分钟以
分离血清，将血清（上清液）收集在1.5毫升离心管中。
39.2、用外泌体提取试剂盒(exoeasy maxi kit； qiagen公司)提取血清中的总外泌体；3、随后利用核糖核酸抽提试剂盒(exorneasy serum/plasma maxi kit；qiagen公司)将提取的外泌体核糖核酸进行提取；4、用反转录试剂盒(primescripttm rt reagent kit；takara公司)将提取后的核糖核酸转化成cdna；5、随后将cdna依次加入到荧光定量pcr反应液中，共5管反应液，每管反应液中加入2微升的cdna，并分别加入用于扩增cul9、kmt2d、pbrm1、 prex2和setd2基因的引物对和检测探针，如下表1所示，然后将混合好的反应液放入荧光pcr仪器(abi 7500荧光pcr仪；applied biosystems公司)上，如图1所示，反应完成后读取每个反应孔的ct值；表1 基因对应引物与探针6、将标准品稀释为不同浓度（103、104、105、106、107），以检测的ct值为横坐标，以标准品的拷贝数的对数值为纵坐标绘制标准曲线，如图2所示，计算目标基因的拷贝数；7、在构建模型前，通过z-score方法，对数据进行标准化预处理，所述计算方法如下： z=(x-μ)/σ；μ=average()； σ=stdevp()。
40.实施例3本实施例主要目的在于提供一种ccrcc诊断模型，所述模型包括：logit(p=ccrcc)=1.21943
×
kmt2d 1.97072
×
prex2 1.30485，该模型纳入142例
样本（92例ccrcc、50例健康人），如图3所示，roc曲线下面积auc：0.836，p＜0.001，灵敏性78.3%，特异性90%，说明外泌体mrnas对ccrcc患者与健康人具有较高的区分效力。
41.将模型在另一队列（203例样本，其中106例ccrcc、97例健康人）中验证，如图4所示，roc曲线下面积auc：0.830，p＜0.001，灵敏性67.0%，特异性93.8%，说明该模型可以用于ccrcc的筛查。
42.实施例4本实施例主要目的在于提供另一种ccrcc诊断模型，所述模型包括：logit(p=ccrcc)=1.68689
×
cul9-1.16173
×
kmt2d 1.17881
×
prex2 0.75145，该模型纳入179例样本（106例ccrcc、73例肾良性病变，其中47例肾实性病变，26例肾囊性病变），如图5所示，roc曲线下面积auc：0.816，p＜0.001，灵敏性75.5%，特异性79.5%，说明外泌体mrnas对ccrcc患者与肾良性病变患者具有较好的鉴别能力。
43.将模型在亚组中验证，roc曲线下面积auc分别为图6中的0.810和图7中0.832，说明该模型可以用于ccrcc的鉴别。
44.本发明实施例通过定量地检测血液外泌体中mrna（kmt2d和prex2）表达，能够从健康人群中有效筛选出肾透明细胞癌患者，有望成为肾癌新型分子标志物，可以有效降低现有技术——超声引起的漏诊，从而提高早期诊断率；通过定量地检测血液外泌体中mrna（cul9、kmt2d和prex2）表达，可以鉴别肾脏占位的性质，有效预测肾透明细胞癌患者，用以弥补现有技术——ct或mri无法准确判断多种肾占位（乏脂肪错构瘤、嗜酸性细胞瘤等）性质的缺陷，避免临床上由于占位性质判断不明确引起的过度治疗。
45.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。