一种评估霉酚酸药物代谢的引物组、试剂盒及评估方法

1.本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种评估霉酚酸药物代谢的引物组、试剂盒及评估方法。


背景技术：

2.慢性肾脏疾病是中国最常见的慢性疾病之一。根据全球疾病负担研究统计，2017年，中国慢性肾脏病患者数量达到1.32亿。透析是慢性肾脏疾病的一种替代治疗方法，经过长期透析治疗后，可能会出现疼痛性肌肉痉挛、低血压、呼吸窘迫和恶心等不良反应，这可能会降低透析的疗效。肾移植可以为这些患者提供更好的预后和更高的生活质量。然而，器官排斥和其他并发症(如癌症或感染)仍有可能影响肾移植患者的存活率。因此，术后长期的免疫抑制治疗及其用药管理很重要，会直接影响肾移植患者的预后。
3.霉酚酸类药物作为免疫抑制联合用药的药品之一，其在被人体吸收后会先被酯酶代谢为具有药理活性的霉酚酸(mycophenolic acid,mpa)，霉酚酸通过选择性抑制t细胞和b细胞的增殖来有效防止急性排斥反应。与其他免疫抑制剂不同，因为mpa的谷浓度(c0)与auc之间的相关性较差，mpa的药物监测主要基于时间-浓度曲线下面积(area under curve,auc)。目前mpa auc采用有限采样策略(limited sampling strategies,lss)来估计，该方法具有复杂性和滞后性的缺点，可能会影响mmf或es-mps剂量的调整，导致部分患者霉酚酸血清药物浓度处于治疗窗外。
4.因此急需一种可以在患者服药前预测患者药物代谢情况的方法，从而个体化设计霉酚酸药物的初始服用剂量，减少患者调整霉酚酸药物用量以达到最佳治疗浓度的时间，更好的治疗患者。


技术实现要素：

5.1.要解决的问题
6.本发明针对现有的血清中霉酚酸药物浓度检测方法因需要测量用药后多个不同时间点后，根据公式计算霉酚酸时间-浓度曲线下面积，临床操作较为繁琐，且会导致药物调整具有滞后性，从而增加患者的血清药物浓度过低或过高而导致排斥反应或感染、骨髓抑制、肿瘤等肾移植术后远期并发症的风险的问题，根据霉酚酸相关的代谢酶在人体内的表达情况的个体差异，开发一种霉酚酸药物代谢的评估方法，能在患者服药前预测患者药物代谢情况，从而个体化设计霉酚酸药物的用药方案，从而减少患者调整霉酚酸药物用量以达到最佳治疗浓度的时间。
7.2.技术方案
8.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
9.本发明提供了一种霉酚酸药物代谢的评估方法，该方法包括如下步骤：
10.s1：确认患者slco1b1rs4149036，abcc2rs3824610，abcc2rs4148395，por rs4732514四个位点的基因型；
11.s2：根据下列公式确定霉酚酸血清药物浓度-时间曲线下面积：
12.霉酚酸血清药物浓度-时间曲线下面积：mpa auc(mg
×
h/l)＝10.583
×
rs3824610 10.994
×
rs4148395-2.686
×
rs4149036-0.984
×
rs4732514-2.019
×
年龄(岁)-24.647
×
性别 21.224
×
急性排斥反应 2.456
×
白蛋白(g/l)-11.579
×
淋巴细胞(109/l)-0.526
×
移植后时间(月)-385.968。
13.其中，公式中各参数赋值如下：
14.性别：女性，性别＝1，男性，性别＝2；
15.急性排斥反应：发生过＝1，没发生过＝2；
16.rs3824610基因型：ct时，rs3824610＝24；cc时，rs3824610＝22；tt时，rs3824610＝44；
17.rs4148395基因型：ga时，rs4148395＝31；gg时，rs4148395＝33；aa时，rs4148395＝11；
18.rs4149036基因型：ca时，rs4149036＝21；aa时，rs4149036＝11；cc时，rs4149036＝22；
19.rs4732514基因型：tt时，rs4732514＝44；ct时，rs4732514＝24；cc时，rs4732514＝22；
20.霉酚酸在人体内发挥药理作用后，在肝脏内被代谢为无活性的葡萄糖醛酸mpa(7-o-mpa-glucuronide,mpag)和酰基化mpag(acyl-mpag,acmpag)，目前已有研究表明尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸转移酶(uridine diphosphate glucuronosyltransferase,ugt)在这一过程中起到了调控作用。mpag以及acmpag主要通过肾脏排泄以及胆汁排泄，这一过程被证实受到有机阴离子转运多肽(organic anion transporting polypeptides,oatp)和多药耐药相关蛋白2(multidrug resistance-associated protein-2,mrp-2)的调控。而p450(细胞色素)氧化还原酶主要与钙调磷酸酶抑制剂的药物代谢过程相关，目前无明确证据表明其参与调控mpa药物的代谢过程，然而本中心研究表明，por基因上rs4732514位点的突变可以显著影响mpa auc。
21.单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，snp)被称为“第三代dna遗传标记”，具有分布密集、数量庞大、频率高、属二态性标记、存在相对稳定的特点，被认为是应用前景最好的遗传标记物。因此，通过检测霉酚酸药物相关代谢基因的snp位点，得到患者的基因型，可有效而稳定地在肾移植术后预测霉酚酸在受者体内的代谢状态。发明人通过研究发现slco1b1基因上的rs4149036，abcc2基因上的rs3824610和rs4148395，por基因上的rs4732514四个snp位点的突变，能够显著影响霉酚酸在患者体内的代谢情况。
22.本发明还提供了一种检测slco1b1基因上的rs4149036，abcc2基因上的rs3824610和rs4148395，por基因上的rs4732514四个snp位点基因型的引物组，包括引物对1，引物对2，引物对3和引物对4，其序列如表1所示：
23.表1.pcr引物组序列
[0024][0025]
本发明还提供了一种检测slco1b1基因上的rs4149036，abcc2基因上的rs3824610和rs4148395，por基因上的rs4732514四个snp位点的基因型的试剂盒，该试剂盒包括上述引物组。
[0026]
优选地，上述试剂盒还包括(1)总rna提取试剂；(2)pcr扩增试剂和测序试剂。
[0027]
优选地，上述总rna提取试剂包括：trizol、氯仿、异丙醇、乙醇、去离子甲酰胺。
[0028]
优选地，上述pcr扩增和测序试剂包括：上述四个位点的pcr引物组、dntp、pcr buffer、taq酶、内参(g3pd)特异性引物、焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate，depc)水、双蒸水等。
[0029]
本发明还提供了上述试剂盒的应用方法，包括如下步骤：
[0030]
s11：血标本总rna的提取；
[0031]
s12：cdna的合成；
[0032]
s13：目的基因pcr扩增；
[0033]
s14：基因型结果分析。
[0034]
优选地，上述s11血标本总rna的提取，包括如下步骤：
[0035]
(1)取全血标本2ml置于冰上，加入1ml trizol进行裂解并静置5min；
[0036]
(2)5min加入0.2ml氯仿，混合后分装至1.5ml的离心管中，用涡旋仪剧烈振荡15s，15～30℃条件下孵育2～3min，将离心管4℃12000rpm离心15min后取上清至新离心管中，每管加入与上清同体积的异丙醇，15～30℃条件下静置10min；
[0037]
(3)将离心管4℃12000rpm离心10min后弃上清，加入75％无水乙醇清洗沉淀，然后4℃7500rpm离心5min；
[0038]
(4)离心过后弃去上清，室温下晾干沉淀，干燥后每管按需要加入去离子甲酰胺吹打混匀，置于-70℃保存。
[0039]
优选地，上述s12cdna的合成，包括如下步骤：
[0040]
(1)取0.5ml的微量离心管并加入1～5μg提取出的总rna，适量加入焦碳酸二乙酯水定容至11μl，加入10μm的oligo(dt)12～18μl，振荡混匀后离心；
[0041]
(2)将离心管置于70℃环境中加热10min，随后将离心管插入冰块在0℃中冷却1min以上；
[0042]
(3)在离心管中加入混合物，在室温条件下，将各试剂震荡混合并且离心，随即置于42℃环境中2～5min,各试剂比例如下：
[0043][0044]
(4)在离心管中加入1μl的superscriptⅱ并置于42℃水浴锅中孵育50min；
[0045]
(5)随后将离心管转移至70℃环境下加热15min终止孵育；
[0046]
(6)将离心管置于冰上加入1μl的rnase h，接着置于37℃环境中孵育20min，最后置于-20℃保存待用；
[0047]
优选地，上述s13目的基因pcr扩增，包括如下步骤：
[0048]
(1)按照比例加入以下试剂至0.5ml的pcr管中：
[0049][0050]
(2)在pcr管中加入双蒸水定容至50μl并震荡混匀，室温环境下进行离心；
[0051]
(3)将pcr管置于pcr仪中，设置相应程序进行检测并对数据进行相应的分析。
[0052]
优选地，上述s14基因型结果分析，包括如下步骤：
[0053]
对步骤s13中的扩增片段进行测序，获得基因型。
[0054]
优选地，上述获得基因型选用软件对测序结果进行分析。更优选地，通过htsnper1.0软件分析。
[0055]
本发明还提供了上述检测slco1b1基因上的rs4149036，abcc2基因上的rs3824610和rs4148395，por基因上的rs4732514四个snp位点的基因型的引物组、试剂盒及应用方法在霉酚酸药物代谢的评估方法中的应用。
[0056]
3.有益效果
[0057]
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
[0058]
(1)本发明提供的一种霉酚酸药物代谢的评估方法，据霉酚酸相关的代谢酶在人体内的表达情况的个体差异，选取与霉酚酸代谢显著相关(p《0.05)的slco1b1基因上的rs4149036，abcc2基因上的rs3824610和rs4148395，por基因上的rs4732514四个snp位点，能在患者服药前预测患者药物代谢情况，从而个体化设计霉酚酸药物的用药方案，减少患者调整霉酚酸药物用量以达到最佳治疗浓度的时间。
[0059]
(2)本发明提供的检测引物组及试剂盒，包含的4对特异性引物能准确、特异性的扩增出slco1b1rs4149036，abcc2rs3824610，abcc2rs4148395，por rs4732514的基因片段，通过标准pcr-限制性片段长度多态性方法进行基因分型，能够准确检测各位点的基因型。
[0060]
(3)本发明提供的一种霉酚酸药物代谢的评估方法，是基于四个snp位点基因型显著相关，且基因型的确定步骤简单、结果准确的基础上，对于指导临床上使用霉酚酸进行免疫抑制治疗以及增加霉酚酸的临床安全性均具有积极的意义。
[0061]
(4)本发明提供的一种霉酚酸药物代谢的评估方法，是建立在大样本肾移植受者的研究结果上，方法准确、高效、具有较高的实用性，为综合患者病情及药理学作用特点制定适宜的霉酚酸给药方案提供依据。
附图说明
[0062]
图1：slco1b1 rs4149036，abcc2 rs3824610，abcc2 rs4148395，por rs4732514四个位点的突变对mpa auc的影响，其中a为slco1b1 rs4149036位点，b为abcc2 rs3824610位点，c为por rs4732514位点，d为abcc2 rs4148395位点；****代表p值《0.0001，**代表p《0.01。
[0063]
图2：使用本发明的方法对验证队列中霉酚酸代谢状态预测能力的roc曲线。
具体实施方式
[0064]
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
[0065]
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同；本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
[0066]
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0067]
如本文所使用，术语“约”用于提供与给定术语、度量或值相关联的灵活性和不精确性。本领域技术人员可以容易地确定具体变量的灵活性程度。
[0068]
浓度、量和其他数值数据可以在本文中以范围格式呈现。应当理解，这样的范围格式仅是为了方便和简洁而使用，并且应当灵活地解释为不仅包括明确叙述为范围极限的数值，而且还包括涵盖在所述范围内的所有单独的数值或子范围，就如同每个数值和子范围都被明确叙述一样。例如，约1至约4.5的数值范围应当被解释为不仅包括明确叙述的1至约4.5的极限值，而且还包括单独的数字(诸如2、3、4)和子范围(诸如1至3、2至4等)。相同的原理适用于仅叙述一个数值的范围，诸如“小于约4.5”，应当将其解释为包括所有上述的值和范围。此外，无论所描述的范围或特征的广度如何，都应当适用这种解释。
[0069]
实施例1
[0070]
本实施例提供slco1b1rs4149036，abcc2rs3824610，abcc2rs4148395，por rs4732514四个位点与霉酚酸在患者体内的代谢的关系，四个snp位点的基本信息如表2所示。
[0071]
表2 snp位点的基本信息
[0072]
[0073]
根据表2可知，rs4149036，rs3824610，rs4148395和rs4732514位点可能的基因型如表3所示。
[0074]
表3 snp各位点可能的基因型
[0075][0076]
从图1或表4中可以看出，rs4149036，rs3824610，rs4148395和rs4732514四个snp位点的突变与霉酚酸在患者体内的代谢显著性相关，snp各位点可能的基因型能够揭示了霉酚酸在患者体内的代谢情况。
[0077]
表4 rs4149036，rs3824610，rs4148395和rs4732514四个snp位点与霉酚酸代谢之间的关系
[0078][0079]
备注:p值小于0.05为显著。
[0080]
实施例2
[0081]
本实施例提供本发明的评估方法用于预测患者的霉酚酸浓度-时间曲线下面积。
[0082]
该研究纳入了71例在本中心(南京医科大学第一附属医院肾移植中心)完成肾脏移植手术的受者，该研究设计通过了南京医科大学第一附属医院的伦理委员会审批。
[0083]
采用本发明的评估方法预测患者的霉酚酸浓度-时间曲线下面积，包括如下步骤：
[0084]
s1：确定患者基本信息
[0085]
患者，32岁，女性，术后未发生急性排斥反应，肾移植术后16个月，血清白蛋白45g/l，淋巴细胞0.65(109/l)。
[0086]
s2：确定患者4个位点的基因型，通过本发明提供的试剂盒及方法进行检测，包括：
[0087]
s21：血标本总rna的提取：
[0088]
(1)取全血标本2ml置于冰上，加入1ml trizol进行裂解并静置5min；
[0089]
(2)5min加入0.2ml氯仿，混合后分装至1.5ml的离心管中，用涡旋仪剧烈振荡15s，15～30℃条件下孵育2～3min，将离心管4℃12000rpm离心15min后取上清至新离心管中，每管加入与上清同体积的异丙醇，15～30℃条件下静置10min；
[0090]
(3)将离心管4℃12000rpm离心10min后弃上清，加入75％无水乙醇清洗沉淀，然后4℃7500rpm离心5min；
[0091]
(4)离心过后弃去上清，室温下晾干沉淀，干燥后每管按需要加入去离子甲酰胺吹打混匀，置于-70℃保存。
[0092]
s22：cdna的合成：
[0093]
(1)取0.5ml的微量离心管并加入1～5μg提取出的rna，适量加入焦碳酸二乙酯水定容至11μl，加入10μm的oligo(dt)12～18μl，振荡混匀后离心；
[0094]
(2)将离心管置于70℃环境中加热10min，随后将离心管插入冰块在0℃中冷却1min以上；
[0095]
(3)在离心管中加入混合物，在室温条件下，将各试剂震荡混合并且离心，随即置于42℃环境中2～5min,各试剂比例如下：
[0096][0097]
(4)在离心管中加入1μl的superscriptⅱ并置于42℃水浴锅中孵育50min；
[0098]
(5)随后将离心管转移至70℃环境下加热15min终止孵育；
[0099]
(6)将离心管置于冰上加入1μl的rnase h，接着置于37℃环境中孵育20min，最后置于-20℃保存待用。
[0100]
s23：目的基因pcr扩增
[0101]
(1)按照比例加入以下试剂至0.5ml的pcr管中：
[0102][0103]
(2)在pcr管中加入双蒸水定容至50μl并震荡混匀，室温环境下进行离心；
[0104]
(3)将pcr管置于pcr仪中，设置相应程序进行检测并对数据进行相应的分析。
[0105]
s24：基因型的确定：
[0106]
通过htsnper1.0软件分析，该患者各位点的基因型为:rs3824610基因型：ct；rs4148395基因型：gg；rs4149036基因型：ca；rs4732514基因型：cc。
[0107]
s3：根据下列公式确定霉酚酸浓度-时间曲线下面积：
[0108]
霉酚酸血清药物浓度-时间曲线下面积：mpa auc(mg
×
h/l)＝10.583
×
rs3824610 10.994
×
rs4148395-2.686
×
rs4149036-0.984
×
rs4732514-2.019
×
年龄(岁)-24.647
×
性别 21.224
×
急性排斥反应 2.456
×
白蛋白(g/l)-11.579
×
淋巴细胞(109/l)-0.526
×
移植后时间(月)-385.968。
[0109]
其中，公式中各参数赋值如下：
[0110]
性别：女性，性别＝1，男性，性别＝2；
[0111]
急性排斥反应：发生过＝1，没发生过＝2；
[0112]
rs3824610基因型：ct时，rs3824610＝24；cc时，rs3824610＝22；tt时，rs3824610＝44；
[0113]
rs4148395基因型：ga时，rs4148395＝31；gg时，rs4148395＝33；aa时，rs4148395＝11；
[0114]
rs4149036基因型：ca时，rs4149036＝21；aa时，rs4149036＝11；cc时，rs4149036＝22；
[0115]
rs4732514基因型：tt时，rs4732514＝44；ct时，rs4732514＝24；cc时，rs4732514＝22；
[0116]
根据基本信息及基因型测定结果，各参数赋值如下：
[0117]
女性，则性别＝1；
[0118]
年龄＝32；
[0119]
急性排斥反应＝2；
[0120]
白蛋白＝45；
[0121]
淋巴细胞＝0.65；
[0122]
移植后时间＝16；
[0123]
rs3824610基因型为ct，则rs3824610＝24；
[0124]
rs4148395基因型为gg，则rs4148395＝33；
[0125]
rs4149036基因型为ca，则rs4149036＝21；
[0126]
rs4732514基因型为cc，则rs4732514＝22；
[0127]
代入计算，该患者霉酚酸药物浓度-时间曲线下面积为：
[0128]
mpa auc＝10.583
×
24 10.994
×
33-2.686
×
21-0.984
×
22-2.019
×
32-24.647
×
1 21.224
×
2 2.456
×
45-11.579
×
0.65-0.526
×
16-385.968＝130.51。该患者实际测得的mpa auc＝131.50mg
×
h/l。与模型预估的mpa auc较为接近。
[0129]
实施例3
[0130]
纳入另外30例肾移植受者作为验证组，跟踪监测其术后的霉酚酸浓度-时间曲线下面积(患者一般信息见表5)，包括：
[0131]
(1)提取30例患者外周血的dna标本，采用qrt-pcr方法检测预测公式中的四个位点(rs3824610、rs4148395、rs4149036和rs4732514)。
[0132]
(2)赋值，根据下列条件进行赋值。
[0133]
性别：女性，性别＝1，男性，性别＝2；
[0134]
急性排斥反应：发生过＝1，没发生过＝2；
[0135]
rs3824610基因型：ct时，rs3824610＝24；cc时，rs3824610＝22；tt时，rs3824610＝44；
[0136]
rs4148395基因型：ga时，rs4148395＝31；gg时，rs4148395＝33；aa时，rs4148395＝11；
[0137]
rs4149036基因型：ca时，rs4149036＝21；aa时，rs4149036＝11；cc时，rs4149036
＝22；
[0138]
rs4732514基因型：tt时，rs4732514＝44；ct时，rs4732514＝24；cc时，rs4732514＝22；
[0139]
(3)将上述赋值代入公式：
[0140]
mpaauc(mg
×
h/l)＝10.583
×
rs3824610 10.994
×
rs4148395-2.686
×
rs4149036-0.984
×
rs4732514-2.019
×
年龄(岁)-24.647
×
性别 21.224
×
急性排斥反应 2.456
×
白蛋白(g/l)-11.579
×
淋巴细胞(109/l)-0.526
×
移植后时间(月)-385.968，得到霉酚酸浓度-时间曲线下面积。
[0141]
(4)收集了上述30例患者术后相应时间点的霉酚酸浓度，并计算出霉酚酸浓度-时间曲线下面积。
[0142]
结果分析：结果如图2所示，该预测公式的预测能力(auc，曲线下面积)为52.9％。因此，我们认为上述方法可有效预测肾移植术后受者体内霉酚酸的代谢状态。
[0143]
表5验证队列纳入患者的一般信息
[0144]