一种丝素蛋白基仿生骨膜-骨移植物及其制备方法和应用

1.本发明属于生物医用材料领域的技术，具体涉及一种丝素蛋白基仿生骨膜-骨移植物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.外伤、骨肿瘤切除、先天性的遗传疾病等引起的大节段性骨缺损难以自我愈合，需临床干预。但是传统的修复方法由于移植物数量有限、供体部位受损、免疫排斥反应等原因，其应用受到诸多限制。随着组织工程的快速发展，组织工程骨移植物显示出良好的应用前景。但目前一些骨移植物仍存在血管化不足、成骨活性不足的问题。
3.骨膜是成骨相关细胞的天然来源，对成骨十分重要。利用组织工程制备人工骨膜有助于修复大面积骨缺损。传统的由组织来源的材料或细胞片制成的人工骨膜存在诸多缺陷，如制造过程复杂、成本高、降解较快和难以储存。目前，临床上使用的骨膜材料大多是进口的胶原蛋白膜，不仅售价高，而且体内降解速度快，操作时容易破损，容易产生免疫反应，并且缺乏骨膜的生物学功能(如成骨和血管生成)。为了增强人工骨膜的成骨和成血管功能，许多研究直接添加生物活性物质(如生长因子)，但往往存在释放失控等缺陷。
4.因此，构建能模拟天然骨膜的纤维状微观结构、能够持续提供生长因子并具有成骨和血管生成等生物学功能的人工骨膜至关重要。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，本发明提供一种丝素蛋白基仿生骨膜-骨移植物，包括丝素蛋白管状支架和覆盖于所述丝素蛋白管状支架的外表面的仿生骨膜生发层；
6.所述丝素蛋白管状支架通过冷冻干燥得到；
7.所述仿生骨膜生发层包括丝素蛋白静电纺丝膜，以及负载在所述丝素蛋白静电纺丝膜上的骨髓间充质干细胞和内皮祖细胞。
8.优选的，所述骨髓间充质干细胞和内皮祖细胞的密度均为1
×
10
4-3
×
104个/cm2。
9.优选的，所述骨髓间充质干细胞和内皮祖细胞的个数比为1：1-2。
10.优选的，所述仿生骨膜生发层的制备方法，包括以下步骤：
11.(1)利用纺丝液进行静电纺丝，得到所述丝素蛋白静电纺丝膜；所述纺丝液由丝素蛋白溶解于六氟异丙醇得到；
12.(2)在所述丝素蛋白静电纺丝膜上培养所述骨髓间充质干细胞和内皮祖细胞，得到所述仿生骨膜生发层。
13.进一步地，所述步骤(1)中，纺丝液中丝素蛋白的浓度为5-15wt％。
14.进一步地，所述步骤(1)中，纺丝的电压为10-14kv，流速为0.1-0.3ml
·
h-1
。
15.进一步地，所述步骤(2)中，培养的条件为，温度37℃，co2的体积浓度4-6％，培养时间为7天。
16.具体的，所述步骤(2)中，培养的方法为：在37℃和5％的二氧化碳条件下，将骨髓
间充质干细胞和内皮祖细胞按1：1的比例接种，密度为2
×
104个/cm2。细胞在培养基(α培养基：egm-2培养基为1：1的混合培养基)中培养，每两天更换新的培养基。
17.优选的，所述丝素蛋白管状支架的制备方法，包括如下步骤：
18.s1：将丝素蛋白水溶液加入管状模具后进行冷冻干燥，得到丝素蛋白固体；
19.s2：将所述丝素蛋白固体置于甲醇溶液中，反应，得到所述丝素蛋白管状支架。
20.进一步地，所述丝素蛋白水溶液的浓度为5-15wt％。
21.进一步地，所述甲醇溶液的浓度90wt％。
22.具体的，所述丝素蛋白管状支架的制备方法为：配制浓度为10％的sf溶液，放入定制的管状硅胶模具中。该模具的尺寸根据兔桡骨尺寸及缺损造模长度定制(长1.5cm，外径0.5cm，内径0.4cm)。为了诱导形成具有取向、连通孔结构的sf支架，在模具上方倒入液氮，而后放入-80℃地冰箱冷冻过夜。将其放入冷冻干燥机中干燥3天。从硅胶模具中小心取出制备好的支架，并将其置于浓度为90％的甲醇溶液中进行β折叠。进一步地，所述丝素蛋白溶液的浓度为5-15wt％。
23.本发明还提供一种上述的丝素蛋白基仿生骨膜-骨移植物的制备方法，包括如下步骤：将所述丝素蛋白静电纺丝膜上培养骨髓间充质干细胞和内皮祖细胞后，覆盖于所述丝素蛋白管状支架上，得到所述丝素蛋白基仿生骨膜-骨移植物。
24.本发明还提供上述丝素蛋白基仿生骨膜-骨移植物在修复长段骨缺损支架中的应用。本发明提供的丝素蛋白基仿生骨膜-骨移植物，该丝素蛋白基仿生骨膜-骨移植物包括丝素蛋白(silk fibroin，sf)静电纺丝膜、骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell，bmsc)、内皮祖细胞(endothelial progenitor cell，epc)及取向连通孔隙结构的丝素蛋白管状支架，发挥促血管化和促成骨的作用，为节段性骨缺损的修复提供一种新材料和新思路。
25.本发明的技术方案相比现有技术具有以下优点：
26.(1)通过静电纺丝技术可将sf制备成具有与天然骨膜生发层类似微观结构的sf静电纺丝膜可为细胞生长提供支持并阻止软组织的侵入。将bmsc和epc在sf静电纺丝膜上共培养组成仿生骨膜生发层，通过细胞间的相互作用调控生物活性物质分泌，具有促成骨和血管生成的潜能。避免了直接添加生物活性物质产生的释放失控、血肿等副作用。
27.(2)采用定向冻干法制备了具有取向、连通孔隙的sf管状支架来仿生长骨。具有取向、连通孔隙的sf管状支架不仅起到支撑仿生骨膜生发层的作用，其上的连通孔隙还可以提升气体/营养物质的流通和连接上下骨，从而加快骨缺损修复。
28.(3)与临床现有的膜诱导技术相比，该sf基仿生骨膜-骨移植物，避免了二次手术和高感染风险的问题，可作为优异的长段骨缺损修复材料用于骨组织工程，具有很好的临床意义。
附图说明
29.图1为本发明实施例1中sf静电纺丝膜的sem图；
30.图2为本发明实施例2中sf静电纺丝膜的生物相容性实验；
31.图3为本发明实施例2中载有不同比例bmsc/epc的sf静电纺丝膜的成骨性能图；
32.图4为本发明实施例2中载有不同比例bmsc/epc的sf静电纺丝膜的成血管性能图；
33.图5为本发明实施例3中具有取向、连通孔隙的sf管状支架的大体图及sem图；
34.图6是本发明实施例3中sf骨膜－骨替代物的横截面sem图像；
35.图7是本发明实施例3中sf骨膜－骨替代物植入兔长段骨缺损部位6周及12周的体内骨缺损修复情况的micro-ct。
具体实施方式
36.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
37.实施例1
38.本实施例sf静电纺丝膜的制备方法，包括以下步骤：
39.s11：称量6-8g干燥后的蚕茧，用3l浓度为0.4％的na2co3在98℃下连续脱胶两次，每次时长30min。脱胶后的丝用蒸馏水洗三次以脱去外层丝胶蛋白，随后在56℃下干燥2h。
40.s12：称取2g脱胶后的蚕丝按1：50的比例溶于9.3m的libr溶液中，在60℃的水浴中加热溶解，并均匀搅拌，使其完全溶解。然后将溶液冷却到室温。将溶液倒入透析膜中，用去离子水透析72h，期间每2h更换去离子水。
41.s13：将透析好的sf溶液在-80℃冰箱冷冻过夜，然后冷冻干燥3天。将冻干的sf用六氟异丙醇溶解为浓度10％的sf溶液。随后采用静电纺丝设备制备sf静电纺丝膜。电纺参数：纺丝电压为12kv；尖端到收集器的距离设置为10cm；纺丝溶液被装入10ml注射器，金属针头的内径为0.9mm；溶液的流速为0.2ml
·
h-1
。将制备的sf静电纺丝膜放在室温下干燥过夜，使残留的溶剂挥发后，用90％甲醇处理纺丝膜使sf进行β折叠；所述sf静电纺丝膜的sem照片如图1所示，结果显示，纤维的表面是光滑的，形态均匀，没有明显的珠状结构。纤维重叠形成多孔结构，sf纤维的直径约为600
±
120nm。
42.实施例2
43.本实施例sf基仿生骨膜生发层的制备方法，包括以下步骤：
44.s21：为了揭示成骨和血管化的最佳细胞比例，在37℃和5％的二氧化碳条件下，将bmsc和epc按1：0、2：1、1：1和1：2的比例接种，密度为2
×
104个/cm2。细胞在培养基(α培养基：egm-2培养基为1：1的混合培养基)中培养，每两天更换新的培养基。其中bmsc和epc在sf静电纺丝膜上共培养的sem图如图2所示，成骨相关蛋白col 1和成血管相关蛋白cd31的免疫荧光分别如图3和图4所示，结果显示，两种细胞可以在sf静电纺丝膜上的增殖情况与在标准培养皿上培养时无明显差异，说明sf静电纺丝膜的生物相容性良好。相对于单纯的bmsc组，bmsc和epc共培养后可以促进bmsc的成骨分化。与其它组相比，bmsc：epc为1：1组成骨相关基因和蛋白表达更多，说明其体外成骨潜能更高。bmsc：epc为1：2组较其他组有更多的血管生成相关基因和蛋白的表达，且与bmsc：epc为1：1组相差不大。综合考虑，认为当静电纺丝膜上的bmsc与epc为1:1时，是构建仿生骨膜生发层的最优条件。
45.实施例3
46.本实施例sf基仿生骨膜-骨移植物的制备方法，包括以下步骤：
47.s31：配制浓度为10％的sf溶液，放入定制的管状硅胶模具中。该模具的尺寸根据兔桡骨尺寸及缺损造模长度定制(长1.5cm，外径0.5cm，内径0.4cm)。为了诱导形成具有取向、连通孔结构的sf管状支架，在模具上方倒入液氮，而后放入-80℃冰箱冷冻过夜。将其放
入冷冻干燥机中干燥3天。从硅胶模具中小心取出制备好的支架，并将其置于浓度为90％的甲醇溶液中进行β折叠。sf管状支架的sem图如图5所示，结果显示，sf管状支架的外表面孔隙成取向分布，孔直径分布为20～100μm，孔隙率约为60％。
48.s32：将bmsc和epc(1：1)接种在sf静电纺丝膜上，体外培养7天，期间隔天换液。然后将其包裹在长度为1.5cm、外径0.5cm、内径0.4cm的sf管状支架上制成载细胞的sf基仿生骨膜生发层－骨替代物，通过sem对支架的形态结构进行观察，结果如图6所示，在sf骨支架表面上可见一层sf静电纺丝膜，表明sf基仿生骨膜生发层－骨替代物成功构建。
49.s33：将仿生骨膜-骨移植物植入兔子桡骨节段性骨缺损处，评估了该植入物在体内促进节段性骨缺损修复的作用，各组micro-ct图如图7所示。按植入材料不同，随机将兔分为空白缺损组(control)、支架组(sf)、未载细胞的仿生骨膜-骨移植物组(sfm)、仿生骨膜-骨移植物组(sfmc)(bmsc：epc为1：1)。结果表明，对照组在6周时仍有较大的骨缺损区域没有愈合，但sf组和sfm组以及sfmc组新形成的骨可连接缺损区域的桡骨上下端，且新生骨量依次增多。有趣的是，sfmc组形成了类似髓腔的结构，而其他组没有形成髓腔。然而，新骨的形态仍然与原生桡骨明显不同。12周后各组bv/tv值较6周增加。对照组的骨缺损仍有较大区域未愈合，而在sf和sfm以及sfmc组的骨缺损部位产生了更多的新生骨。其中，sfmc组骨修复效果最佳，bv/tv高达70％以上，证明sf基仿生骨膜-骨移植物是非常好的成骨材料，具有非常好的骨组织工程应用前景。不仅节段性骨缺损处完整愈合，更重要的是形成了连通的髓腔。
50.显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。