一种基于代谢组学的烟叶霉变识别方法与流程

1.本发明涉及烟叶检测的技术领域，具体为一种基于代谢组学的烟叶霉变识别方法。


背景技术：

2.烟叶原料作为农产品，在生长、仓储、醇化过程中烟叶极易受环境因素的影响发生霉变，导致卷烟企业经济损失严重。霉变烟叶不仅影响烟叶的外观和品质，甚至产生有毒代谢物(如黄曲霉毒素等)及附着病原微生物对吸烟者的健康构成潜在危害。
3.近年来，霉变烟叶的研究备受烟草企业、烟草研究者及国家烟草专卖局等关注，霉变烟叶识别成为烟草品质评价和香味提升亟待解决的关键问题之一。目前对烟叶霉变预防多以人工干预为主，耗费了大量的人力和财力却难以解决霉变发生的机理、机制等关键问题。现有的烟叶霉变机制和防霉技术方面主要包括营养物质与菌群、温湿度等环境条件对烟叶的霉变影响，有关烟叶霉变过程的代谢组相关的研究较少。因此，如何对烟叶霉变识别以提高烟草品质，具有重要的意义。


技术实现要素：

4.本发明提供一种基于代谢组学的烟叶霉变识别方法，解决现有烟叶霉变识别存在不精准和效率低的问题，能提高烟叶霉变识别的准确度和效率，提高烟丝的品质，减少吸烟者的健康危害。
5.为实现以上目的，本发明提供以下技术方案：
6.一种基于代谢组学的烟叶霉变识别方法，包括：
7.获取同一品种烟叶样本，并将一定量的所述烟叶样本进行人为霉变得到霉变烟叶，进而得到正常样本和霉变样本；
8.采用固相微萃取-气相色谱-质谱法对所述烟叶样本进行霉变前后烟叶中挥发性和半挥发性成分的测量，以得到质谱数据；
9.对采集的质谱数据进行数据处理以获取霉变样本与正常样本中不同种类化合物占比含量，进而得到霉变前后的烟叶样本中的挥发性化合物含量的变化差异，以筛选出霉变烟叶的判别变量；
10.根据所述判别变量建立烟叶霉变的识别模型，以通过所述识别模型对烟叶进行霉变识别。
11.优选的，所述对采集的质谱数据进行数据处理，包括：
12.利用质谱数据绘制火山图，并通过火山图分析霉变前后烟叶样本中挥发性化合物含量。
13.优选的，所述对采集的质谱数据进行数据处理，还包括：
14.采用主成分分析法分析烟叶霉变前后化合物的变化，以得到霉变前后的烟叶样本中的挥发性化合物含量的变化。
15.优选的，所述对采集的质谱数据进行数据处理，还包括：
16.采用正交偏最小二乘法对烟叶霉变前后的化合物成分的差异进行计算，以判定各种化合物对烟叶霉变的贡献值，进而根据所述贡献值确定判别变量。
17.优选的，所述对采集的质谱数据进行数据处理，还包括：
18.利用热图分析及层次聚类分析可视化分析，以直观分析霉变前后的烟叶样本中挥发性化合物的变化。
19.优选的，所述获取霉变样本与正常样本中不同种类化合物占比含量，包括：
20.对采集的质谱数据经nist标准谱库进行检索进行鉴定，采取峰面积归一化法计算各物质的相对含量，以获取霉变样本与正常样本中不同种类化合物占比结果；
21.对采集到的挥发性化合物占比结果进行数据标准化和归一化处理，以获得霉变前后的烟叶样本中的挥发性化合物含量差异。
22.优选的，对烟叶样本进行人为霉变，包括：
23.对所述烟叶样本的烟叶含水率进行调节，采用烘箱干燥法测定烟叶含水率，使烟叶含水率在18％以上；
24.将预处理后的所述烟叶样本放入恒温恒湿箱，调节温度和相对湿度分别为28℃和70％条件下进行烟叶霉变实验。
25.优选的，进行微萃取时所述烟叶样本的进样温度为280℃，解吸2min。
26.优选的，气相色谱条件为：进样口温度：280℃，he载气，流速：1ml/min；升温条件为：初始温度50℃并保持2min，以5℃/min升温至140℃并保持1min，再以10℃/min升温至280℃并保持1min。
27.优选的，所述根据所述判别变量建立烟叶霉变的识别模型，包括：
28.将烟叶样本中的挥发性化合物进行fisher逐步判别分析判筛选出对霉变烟叶判别有效的所述判别变量，根据所述判别变量建立fisher线性判别函数。
29.本发明提供一种基于代谢组学的烟叶霉变识别方法，采用固相微萃取-气相色谱-质谱法测定霉变前后烟叶中挥发性和半挥发性成分，利用非靶向代谢组学结合多元统计分析方法探析烟叶霉变前后代谢物的差异性，构建预测模型对霉变烟叶品质的鉴别方法，对烟叶霉变的提前预测和实时监控。能提高烟叶霉变识别的准确度和效率，提高烟丝的品质，减少吸烟者的健康危害。
附图说明
30.为了更清楚地说明本发明的具体实施例，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
31.图1为本发明提供的一种基于代谢组学的烟叶霉变识别方法示意图。
32.图2为本发明提供的烟叶霉变识别的流程图。
33.图3为本发明实施例提供的不同种类化合物占比图。
34.图4为本发明实施例提供的霉变前后的烟叶样本中挥发性化合物含量的火山图分析图。
35.图5a～5c为本发明实施例提供的霉变前后烟叶样本的多元统计分析图。
36.图6为本发明实施例提供的霉变前后烟叶样本中挥发性化合物的hma和hca分析结
果图。
具体实施方式
37.为了使本技术领域的人员更好地理解本发明实施例的方案，下面结合附图和实施方式对本发明实施例作进一步的详细说明。
38.针对当前烟叶霉变识别存在效率低和不准确的问题，本发明提供一种基于代谢组学的烟叶霉变识别方法，解决现有烟叶霉变识别存在不精准和效率低的问题，能提高烟叶霉变识别的准确度和效率，提高烟丝的品质，减少吸烟者的健康危害。
39.如图1和图2所示，一种基于代谢组学的烟叶霉变识别方法，包括：
40.s1：获取同一品种烟叶样本，并将一定量的所述烟叶样本进行人为霉变得到霉变烟叶，进而得到正常样本和霉变样本。
41.s2：采用固相微萃取-气相色谱-质谱法对所述烟叶样本进行霉变前后烟叶中挥发性和半挥发性成分的测量，以得到质谱数据。
42.s3：对采集的质谱数据进行数据处理以获取霉变样本与正常样本中不同种类化合物占比含量，进而得到霉变前后的烟叶样本中的挥发性化合物含量的变化差异，以筛选出霉变烟叶的判别变量。
43.s4：根据所述判别变量建立烟叶霉变的识别模型，以通过所述识别模型对烟叶进行霉变识别。
44.具体地，在一实施例中，包括以下步骤：
45.步骤一：将仓储k326品种烟叶人为霉变，将烟叶样品分为正常烟叶和霉变烟叶两类；
46.对仓储烟叶样品的烟叶含水率进行调节，采用烘箱干燥法测定烟叶含水率，使烟叶含水率在18％以上。将预处理后的仓储烟叶样品放入恒温恒湿箱，调节温度和相对湿度分别为28℃和70％条件下进行烟叶霉变实验，以30天为实验周期。将发生霉变的烟叶从恒温恒湿箱内取出，贮存于-18℃的冰柜中备用。仓储烟叶样品信息表数据如表1。
47.表1仓储烟叶样品信息表
48.[0049][0050]
步骤二：采用固相微萃取-气相色谱-质谱法(spme-gc-ms)测定k326品种霉变前后烟叶中挥发性和半挥发性成分；微萃取操作过程为：
[0051]
实验开始前将萃取头插入gc进样口于300℃老化1h，直至无杂峰。称取0.5g的烟叶样品置于22ml的顶空瓶中，并加入10μl浓度为100μg/ml的萘乙醇溶液作为内标以定量。将该萃取瓶置于80℃的加热搅拌台上。用萃取手柄的萃取头刺穿顶空瓶瓶盖的橡胶垫置样品顶空，再推出萃取头内的纤维头并顶空吸附烟叶自然挥发气体50min。吸附完成后，将纤维头撤回，并将整个萃取手柄从顶空瓶中拔出。再将萃取头插入gc-ms联用仪的gc进样口，推出纤维头，在280℃时解吸2min，完成样品的进样。
[0052]
样品中gc-ms共检测出106多种挥发性成分，如表2所示。
[0053]
表2正常烟叶及霉变烟叶中的成分表
[0054][0055]
步骤三：数据检索：采集的质谱数据经nist标准谱库进行检索进行鉴定，采取峰面积归一化法计算各物质的相对含量。霉变组与正常组(对照组)中不同种类化合物占比结果如图3所示。
[0056]
步骤四：数据处理：对采集到的挥发性化合物定量结果进行数据标准化(log2 transformation)和归一化(pareto scaling)处理。归一化公式如下：
[0057][0058]
其中，xi为样本数据中的第i个值，x
min
为样本数据中的最小值，x
max
为样本数据中的最大值，y为第i个值进行归一化之后的数据。
[0059]
步骤五：数据分析：
[0060]
step1：用火山图分析霉变前后k326样本中挥发性化合物含量。
[0061]
采用t检验(student's t test)进行差异显著性分析，并以log2(fc)为x轴，-log(p)为y轴，绘制火山图，如图4所示。
[0062]
火山图分析确定的霉变前后k326样本中重要的挥发性化合物由表3所示。
[0063]
表3火山图分析确定的霉变前后k326样本中重要的挥发性化合物
[0064]
[0065][0066]
可以看出，共有36种化合物含量出现显著性下降，14种化合物含量出现显著性上升，其余56种化合物含量无显著性变化，其中22#(2，4-二羟基-2，5-二甲基-3(2h)-呋喃-3-酮)、47#(癸醛)、51#(5-羟甲基-糠醛)等36种化合物含量显著下降，22#(2，4-二羟基-2，5-二甲基-3(2h)-呋喃-3-酮)化合物霉变后的含量几乎为0，而70#(5-甲氧基-6，7-二甲基-苯并呋喃)、60#(4-乙烯基-1，2-二甲氧基苯)、23#(1-辛烯-3-醇)等14种化合物含量显著上升，70#(5-甲氧基-6，7-二甲基-苯并呋喃)化合物是由霉变产生的一种新的化合物。
[0067]
step2:采用主成分分析法(principal components analysis,pca)分析烟叶霉变前后化合物的变化。主成分分析法(pca)步骤如下：
[0068]
(1)由于有两种烟叶，即霉变烟叶与正常烟叶，取样品n＝2，有106种挥发性物资，取p＝106维随机向量x＝(x1,x2,
…
,x
p
)
t
,n个样品x＝(x
i1
,x
i2
,
…
,x
ip
)
t
，i＝1,2,
…
,n。构造样本矩阵，对样本矩阵中的元素通过式(2)进行标准化变换：
[0069][0070]
其中得到标准化矩阵z
[0071]
(2)对标准化矩阵z求相关系数矩阵r
[0072][0073]
其中，
[0074]
(3)解样本相关系数矩阵r的特征方程|r-λi
p
|＝0得p个特征根，确定主成分按确定m的值，使信息的利用率达到85％以上，对每个λj,j＝1,2,
…
,m解方程组rb＝λjb得单位特征向量
[0075]
(4)将标准化后的指标变量转换为主成分
[0076][0077]
其中，u
ij
为得到的主成分。
[0078]
由图5a可知，霉变前后样品具有一定的区分度，但是未能完全分开，其中前两个主成分累计贡献率达76.9％(pc1:54.6％；pc2:22.3％)。
[0079]
step3:采用正交偏最小二乘法(orthogonal projections to latent structures-discrimination analysis，opls-da)进一步研究烟叶霉变前后的化学成分的差异。
[0080]
通过2个组成分(累计方差为38.9％)可以实现霉变前后k326样本的区分，如图5b所示，r2x＝0.851及q2＝0.787说明模型具有很好的解释性和预测性。差异的具体来源可以通过该模型的变量(对分类)重要性列表(variable importance for the projection,vip)获得。变量vip值越大，说明该变量对分类的作用越大。实验选取vip值大于1的化合物，vip由高到低，如图5c所示，共有42种化合物，说明这42种化合物对于k326是否霉变判定的贡献大。
[0081]
step4:选取fc≥2或fc≤0.5且vip》1、p《0.05的物质，进行热图分析(heat map analysis,hma)及层次聚类分析(hierarchical clustering analysis,hca)可视化分析，直观分析霉变前后k326样本中挥发性化合物的变化。
[0082]
结果如图6所示，霉变前后的样品可以很好地被聚类，化合物被分成了两组。
[0083]
步骤六：采用fisher逐步判别分析(stepwise discriminant analysis,sda)，建立k326品种烟叶霉变的识别模型。
[0084]
将fc≥2或fc≤0.5且p《0.05、vip》1的化合物进行fisher逐步判别分析判筛选出对霉变烟叶判别最有效的变量，建立k326烟叶是否霉变的判别模型。
[0085]
分析结果显示，样本中的18#(5-甲基-2-呋喃甲醇)、23#(1-辛烯-3-醇)、31#(苯甲
醇)、42#(1，2-二甲氧基-苯)、53#(2,4-二氯-1-甲氧基-苯)、70#(5-甲氧基-6，7-二甲基-苯并呋喃)、92#(十六酸甲酯)、96#(十六酸)等8种化合物被引入判别模型，建立fisher线性判别函数，判别模型分别如下：
[0086]
k326正常烟叶＝75.079[18#]-0.892[23#] 39.071[31#]-7.302[42#]-10.658[53#]-427[70#]-2.553[92#] 3.175[96#]-6.661。
[0087]
k326霉变烟叶＝-38.660[18#] 20.989[23#]4.640[31#] 66.778[42#] 145.421[53#] 12.943[70#] 5.126[92#]-0.743[96#]-12.170。
[0088]
综上，k326品种烟叶霉变识别利用固相微萃取-气相色谱-质谱法对霉变及正常烟叶内在挥发性代谢组分进行分析，采用pca和opls-da对霉变前后代谢物进行分析，通过直观与定量分析结合fisher逐步判别分析最终发现，5-甲基-2-呋喃甲醇、苯甲醇等8种成分所构建的判别模型可有效识别正常烟叶及霉变烟叶，此方法的建立对可靠识别霉变烟草提供了一种策略，同时为进一步研究霉变机理提供基础依据。
[0089]
可见，本发明提供一种基于代谢组学的烟叶霉变识别方法，采用固相微萃取-气相色谱-质谱法测定霉变前后烟叶中挥发性和半挥发性成分，利用非靶向代谢组学结合多元统计分析方法探析烟叶霉变前后代谢物的差异性，构建预测模型对霉变烟叶品质的鉴别方法，对烟叶霉变的提前预测和实时监控。能提高烟叶霉变识别的准确度和效率，提高烟丝的品质，减少吸烟者的健康危害。
[0090]
以上依据图示所示的实施例详细说明了本发明的构造、特征及作用效果，以上所述仅为本发明的较佳实施例，但本发明不以图面所示限定实施范围，凡是依照本发明的构想所作的改变，或修改为等同变化的等效实施例，仍未超出说明书与图示所涵盖的精神时，均应在本发明的保护范围内。