一种青蒿素及其衍生物的新用途、验证方法

1.本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及一种青蒿素及其衍生物的新用途、验证方法。


背景技术：

2.幽门螺杆菌是一种人类常见感染性病菌，它是多种疾病如慢性胃炎、胃溃疡、胃腺癌，甚至是黏膜相关淋巴组织淋巴瘤等的危险因素，因此1994年世界卫生组织国际癌症研究机构（iarc）将幽门螺杆菌列为人类i类致癌原。在全世界，胃癌每年影响着超过100万人，并造成超过70万人的死亡。它的感染已经成为一个全球性的卫生问题，全球超过一半的人感染了幽门螺杆菌，在我国的感染率为40-60%。
3.幽门螺杆菌感染的高发不一定等同于胃癌的高发。例如，非洲一些地区的幽门螺杆菌感染率高，但胃癌的发病率却相对较低。它的致病能力除了与感染相关，更与感染菌株的毒力表达水平息息相关。如常见的空泡细胞毒素vaca、细胞毒素相关蛋白caga、鞭毛蛋白flaa、尿素酶蛋白ureb等。幽门螺杆菌感染后最常用的治疗方法是以抗生素为代表的三联或四联疗法，其治疗理念在于杀灭或清除感染机体的幽门螺杆菌，从而减缓或终止疾病的发生发展。如上所述，幽门螺杆菌的致病能力主要取决于其毒力表达水平，同时幽门螺杆菌感染与一些疾病，如胃食管返流、肥胖等的发生呈负相关关系。因此，杀灭或清除幽门螺杆菌在降低患某些胃部疾病风险的同时，增加了罹患另一些疾病的风险。同时关于幽门螺杆菌抗生素耐药的报道仍在不断增加，现有治疗方法很难达到对幽门螺杆菌的根除。除此之外，抗生素的不良使用容易使宿主菌群紊乱进而导致疾病的发生发展，因此，亟待发展新的抑制幽门螺杆菌毒力药物，降低其毒力水平，一方面有效防治幽门螺杆菌感染，另一方面减少抗生素使用以减少细菌耐药及抗生素不良使用导致的菌群紊乱情况。
4.现有技术青蒿素及衍生物预防h.pylori诱导的胃癌的作用及机制（《广州中医药大学》期刊，李方园作者）虽然也公开了青蒿素的研究，但是其仅将青蒿素及其衍生物作用于胃癌上皮细胞，检测其对胃癌上皮细胞的抑制作用；检测青蒿素及其衍生物对幽门螺杆菌对胃上皮细胞诱导的炎症反应和氧化反应的抑制作用；检测青蒿素及其衍生物对胃癌上皮细胞裸鼠移植瘤的生长抑制作用；以及检测青蒿素及其衍生物对幽门螺杆菌联合甲基亚硝基脲诱导的胃癌的预防作用。在上述现有技术中，研究焦点在于青蒿素及其衍生物对幽门螺杆菌诱导的细胞炎症及氧化反应的抑制，以及直接对肿瘤细胞的体内外抑制作用，作用对象均在于细胞，却并未检测青蒿素及其衍生物对幽门螺杆菌菌体及毒力水平的直接抑制作用，不具有普适性。而对于青蒿素及其衍生物对幽门螺杆菌毒力水平抑制的研究，其适用范围不仅局限于胃上皮细胞，而适用于幽门螺杆菌感染所接触及影响的一切细胞、生物及自然环境。
5.通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：（1）现一线抗幽门螺杆菌药物的治疗理念在于杀灭或清除感染机体的幽门螺杆菌，而幽门螺杆菌的致病能力主要取决其毒力表达水平，同时幽门螺杆菌的存在能降低一
些疾病的发病几率，因此抑制其毒力水平可能比完全杀灭幽门螺杆菌更适合大多感染人群；（2）现有技术采用容易导致抗生素滥用使包括幽门螺杆菌在内的大量细菌产生细菌耐药，甚至产生超级细菌，危害到全球人类健康，同时易使宿主菌群紊乱进而导致疾病的发生发展；（3）现有技术采用多种药物的联合应用，不良反应发生率较高，且易导致药物性肝损伤；（4）现有技术缺乏安全、温和、副作用少，并具有良好抗幽门螺杆菌作用，同时兼具抗炎及免疫调节等的新药；（5）现有技术没有将青蒿素及其衍生物用于制备用于抑制幽门螺杆菌毒力表达的药物中的方法或研究。
6.（6）现有的青蒿素的对于肿瘤细胞或幽门螺杆菌诱导的细胞炎症及氧化反应的抑制研究，不具有普适性；适用范围仅局限于胃上皮细胞，无法扩展应用。
7.解决以上问题及缺陷的难度为：1. 现一线抗幽门螺杆菌药物主要为抗生素类药物，主要针对细菌杀灭而非毒力抑制，而对于低浓度作用即有效抑制幽门螺杆菌毒力水平新药的研发需要耗费巨大的人力物力；2. 抗生素作为使用最广泛的抗菌药物，仍是体内抗细菌的首选药物，但耐药及持留菌的生成机制仍不明确，难以通过体内手段进行阻断以减少细菌的产生；3. 新药研发的难度在于，难以在独立高效抗幽门螺杆菌的同时保持良好生物安全性；4. 对于幽门螺杆菌新药研发，多数聚焦于小分子合成药物，其生物安全性相对较低，且难以兼顾抗炎及免疫调节作用；5. 青蒿素作为一种从中草药青蒿中提取出来的有效成分，其毒副作用小，同时具有抗炎、免疫调节等作用，现研究多数聚焦于细胞层面的作用，暂无将其作用于直接抑制幽门螺杆菌毒力水平相关研究。
8.解决以上问题及缺陷的意义为：1. 将青蒿素及衍生物作用于抑制幽门螺杆菌毒力水平，在降低其导致的胃部疾病发生几率及严重程度的同时，保存活性幽门螺杆菌，避免胃食管返流、肥胖等疾病发生概率的增加；2. 将青蒿素及其衍生物作用于幽门螺杆菌，可减少抗生素使用导致的细菌耐药及菌群紊乱等不良反应；3. 青蒿素作为从中草药中提取的有效成分，及其衍生物具有良好的抗炎及免疫调节作用，生物相容性强；4. 本发明表示，青蒿素及其衍生物在低浓度即可有效降低幽门螺杆菌毒力水平。


技术实现要素：

9.为克服相关技术中存在的问题，本发明公开实施例提供了一种青蒿素及其衍生物的新用途。所述技术方案如下：一种青蒿素及其衍生物的新用途，所述新用途为青蒿素和/或青蒿素衍生物在制备用于预防、治疗或缓解由幽门螺杆菌存在引起的任一疾病的药物中的应用。
10.在一个实施例中，所述由幽门螺杆菌存在引起的任一疾病包括：慢性胃炎、胃溃疡、胃癌、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤、口臭、缺铁性贫血、特发性血小板减少性紫癜等。
11.在一个实施例中，所述青蒿素和/或青蒿素衍生物通过抑制幽门螺杆菌毒力因子水平起作用；所述青蒿素和/或青蒿素衍生物通过抑制幽门螺杆菌的特异性基因和/或特异性毒力基因的表达起作用。
12.在一个实施例中，所述青蒿素及其衍生物的新用途还包括：青蒿素和/或青蒿素衍生物在制备用于抗幽门螺杆菌的疫苗的中的应用。
13.在一个实施例中，所述青蒿素及其衍生物的新用途进一步包括：青蒿素和/或青蒿素衍生物在制备用于抗炎的药物中的应用。
14.在一个实施例中，所述青蒿素及其衍生物的新用途进一步包括：青蒿素和/或青蒿素衍生物在制备用于免疫调节的药物中的应用。
15.在一个实施例中，所述青蒿素衍生物为蒿甲醚、青蒿琥酯。
16.在一个实施例中，所述青蒿素和/或青蒿素衍生物的有效浓度为：青蒿素0.125μg/ml、蒿甲醚0.125μg/ml、青蒿琥酯1μg/ml。
17.本发明的另一目的在于提供一种验证所述的青蒿素及其衍生物的新用途的方法，所述青蒿素及其衍生物的新用途的验证方法包括：进行幽门螺杆菌的平板培养，并确定青蒿素及其衍生物的最小抑菌浓度及最小杀菌浓度；基于确定的青蒿素及其衍生物的最小抑菌浓度及最小杀菌浓度进行青蒿素及衍生物作用下幽门螺杆菌毒力表达测定。
18.在一个实施例中，所述进行青蒿素及衍生物作用下幽门螺杆菌毒力表达测定包括：首先，提取青蒿素及其衍生物作用后的幽门螺杆菌的rna，并利用试剂盒去除rna样本中的dna进行纯化及rna反转录；其次，以反转录后的cdna为模板，实时荧光定量pcr，以幽门螺杆菌管家基因16s rrna为内参基因，使用2
−
δδct法进行幽门螺杆菌16s rrna、vaca、caga、flaa、ureb的表达检测。
19.结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为： 本发明的青蒿素及其衍生物能够在使用剂量少的前提下有效抑制幽门螺杆菌致病毒力效果，减少抗生素的不良使用，进而减少抗生素耐药及其导致的宿主菌群紊乱的问题，同时能减少多种抗生素的联合应用，减少不良反应。本发明提供了具有良好抗幽门螺杆菌作用，同时兼具抗炎及免疫调节等的新药物。
20.本发明提供了一种安全、温和、副作用少，并具有良好抗幽门螺杆菌作用，同时兼具抗炎及免疫调节等的新药物。
21.本发明的青蒿素及其衍生物作用对象是幽门螺杆菌的特异性基因及特异性毒力基因，仅存在于幽门螺杆菌等原核生物体内，在人体及鼠细胞等真核细胞中不存在。等同于本发明检测青蒿素及其衍生物对幽门螺杆菌的直接抑制作用，不管其在自然环境中、其他生物体内、还是在人体内不同微生态环境中，结果均具有普适性。可应用范围不仅局限于胃上皮细胞及胃癌相关研究，在幽门螺杆菌存活、感染及致病途径中均具有指导意义。
22.本发明对比现有技术-青蒿素及衍生物预防h.pylori诱导的胃癌的作用及机制（《广州中医药大学》期刊，李方园作者）应用对象不同，作用对象不同，同时本发明直接检测青蒿素及其衍生物对幽门螺杆菌菌体及毒力水平的直接抑制作用，而上述现有技术并不具备，即本发明对比现有技术具有普适性。同时本发明青蒿素及其衍生物对幽门螺杆菌毒力水平抑制适用范围不仅局限于胃上皮细胞，而适用于幽门螺杆菌感染所接触及影响的一切细胞、生物及自然环境；而上述现有技术则并不能，即本发明对比上述现有技术还具备更好
的扩展性，实用性强。
23.当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本发明的公开。
附图说明
24.此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本公开的实施例，并与说明书一起用于解释本公开的原理。
25.图1是本发明实施例提供的青蒿素1/2
×
mic（即0.125μg/ml）浓度时作对幽门螺杆菌主要的毒力因子表达程度影响示意图。
26.图2是本发明实施例提供的蒿甲醚1/2
×
mic（即0.125μg/ml）浓度时作对幽门螺杆菌主要的毒力因子表达程度影响示意图。
27.图3是本发明实施例提供的青蒿琥酯1/2
×
mic（即1μg/ml）浓度时作对幽门螺杆菌主要的毒力因子表达程度影响示意图。
具体实施方式
28.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其他方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
29.本发明实施例提供的青蒿素及其衍生物可制备用于预防、治疗或缓解由幽门螺杆菌存在引起的任一疾病的药物。
30.本发明实施例提供的由幽门螺杆菌存在引起的任一疾病包括：慢性胃炎、胃溃疡、胃癌、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤、口臭、缺铁性贫血、特发性血小板减少性紫癜等。
31.本发明实施例提供的青蒿素和/或青蒿素衍生物通过抑制幽门螺杆菌毒力因子水平起作用。
32.本发明实施例提供的青蒿素和/或青蒿素衍生物通过抑制幽门螺杆菌的特异性基因和/或特异性毒力基因的表达起作用。
33.本发明实施例提供的青蒿素及其衍生物可制备用于抗幽门螺杆菌的疫苗的中的应用。
34.本发明实施例提供的青蒿素及其衍生物可制备用于抗炎的药物中的应用。
35.本发明实施例提供的青蒿素及其衍生物可制备用于免疫调节的药物中的应用。
36.本发明实施例提供的青蒿素衍生物为蒿甲醚、青蒿琥酯。
37.本发明实施例提供的青蒿素和/或青蒿素衍生物的有效浓度为：青蒿素0.125μg/ml、蒿甲醚0.125μg/ml、青蒿琥酯1μg/ml。
38.本发明实施例提供的青蒿素及其衍生物作用对象是幽门螺杆菌的特异性基因及特异性毒力基因，仅存在于幽门螺杆菌等原核生物体内，在人体及鼠细胞等真核细胞中不存在。等同于本发明检测青蒿素及其衍生物对幽门螺杆菌的直接抑制作用，不管其在自然环境中、其他生物体内、还是在人体内不同微生态环境中，结果均具有普适性。可应用范围不仅局限于胃上皮细胞及胃癌相关研究，在幽门螺杆菌存活、感染及致病途径中均具有指
导意义。
39.本发明实施例提供的青蒿素及其衍生物的新用途的验证方法包括：进行幽门螺杆菌的平板培养，并确定青蒿素及其衍生物的最小抑菌浓度及最小杀菌浓度；基于确定的青蒿素及其衍生物的最小抑菌浓度及最小杀菌浓度进行青蒿素及衍生物作用下幽门螺杆菌毒力表达测定。
40.本发明实施例提供的进行青蒿素及衍生物作用下幽门螺杆菌毒力表达测定包括：首先，提取青蒿素及其衍生物作用后的幽门螺杆菌的rna，并利用试剂盒去除rna样本中的dna进行纯化及rna反转录；其次，以反转录后的cdna为模板，实时荧光定量pcr，以幽门螺杆菌管家基因16s rrna为内参基因，使用2
−
δδct法进行幽门螺杆菌16s rrna、vaca、caga、flaa、ureb的表达检测。
41.下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
42.幽门螺杆菌标准菌株g27。
43.哥伦比亚血琼脂（columbia blood agar, cba）培养基：cba粉末（oxoid, basingstoke, 英国）15.6g，加灭菌去离子水400ml溶解，高温高压灭菌。微波炉加热至完全融化，60℃水浴30分钟，待培养基冷却至50℃左右，加入100ml无菌脱纤维绵羊血（solarbio，中国），八字法混匀。迅速倒入无菌平板，待完全冷却凝固。封口膜封口，置于4℃保存，1月内使用。
44.脑心浸液肉汤（brian heart infusion, bhi）血清培养基：bhi粉末（becton, dickinson and company，美国）14.8g，加灭菌去离子水400ml溶解，使用0.22 μm微孔滤膜滤菌，加入10%体积无菌胎牛血清（gibco，澳大利亚），混匀，置于4℃保存。
45.第一部分：青蒿素及衍生物作用下幽门螺杆菌毒力表达测定1、平板培养：使用10μl一次性接种环，将幽门螺杆菌均匀涂抹于cba固体培养基上，置于二氧化碳恒温孵箱（thermo，美国），37℃ ，微需氧条件（5%氧气，10%二氧化碳和85%氮气）下培养24小时。
46.2、药物最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，mic）及最小杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，mbc）确定：使用10μl一次性接种环，从cba培养基上刮下新鲜菌体，置于bhi血清培养基中，交替使用枪尖吹打和涡旋振荡器充分混匀。使用多功能酶联检测仪spectramax id5（molecular devices，美国）调节菌液od值为od600nm=0.3，稀释10倍，此时菌液浓度约为1
×
10
5 cfu/ml。菌液加入无菌96孔板，体系为100μl，加入98 μl菌悬液与2 μl 2倍连续稀释后的青蒿素及衍生物，使药物浓度为0、0.125、0.25、0.5、1、2μg/ml，置于孵箱中培养24小时。后观察菌液清亮的最低药物浓度组为该药物mic。
47.3、幽门螺杆菌毒力表达测定药物对细菌毒力测定：根据第2步中测得的青蒿素及衍生物对幽门螺杆菌的mic。取1/2
×
mic浓度作用于1
×
10
6 cfu/ml幽门螺杆菌菌悬液并孵育2小时。富集菌液1ml，5000rpm离心10分钟，trizol（invitrogen公司，美国）重悬。
48.（1）提取细菌rna：转移至加有氧化锆磁珠（直径0.1 mm）的破壁管（fastrep tube，betin 公司，中国）中，液氮冷却，在高速组织匀浆机（bertin公司，法国）中破碎细胞；冰浴2-5分钟，待破壁过程产生的气泡逐渐消失；加入350 μl“氯仿：异戊醇（24:1）”溶液
（solarbio公司，中国），涡旋振荡器震荡15秒，静置10分钟；13000 rpm，4℃，离心15分钟；吸取400μl上层澄清液体（勿触及白色破碎组织沉淀），转移至新的无酶ep管内。依次加入已预冷的350 μl高盐溶液（takara，中国）和250 μl异丙醇，上下颠倒ep管数次以充分混匀，静置10分钟；13000 rpm，4℃，离心15分钟；弃去上清液，13000 rpm，4℃，离心2分钟，小心去尽上清液；向沉淀中加入1 ml提前预冷的70%乙醇溶液，上下颠倒ep管数次，13000 rpm，4℃条件下离心5分钟；弃去上清，自然风干底部沉淀；根据底部沉淀多少，加入40-70μl无酶水；65℃水浴10分钟，使用无酶枪尖吹打混匀；使用nanodrop 2000分光光度计（gene company limited，中国）测定rna的浓度和纯度。
49.（2）rna纯化及反转录：使用primescript
™ꢀ
rt reagent kit with gdna eraser (perfect real time)试剂盒（taraka bio inc，otsu，日本）去除rna样本中的dna进行纯化及后续的rna反转录过程。
50.（3）实时荧光定量反转录聚合酶链式反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，rt-qpcr）：以反转录后的cdna为模板，每个样本设置4个复孔，使用tb green
™ꢀ
premix ex taq
™ꢀ
ii试剂盒（tli rnase h plus，takara，日本），采用20 μl体系。在lightcycler 480 ii system (forrenstrasse 2,6343 rotkreuz, 瑞士) 实时荧光定量pcr仪上运行，反应条件如表2-4所示。以幽门螺杆菌管家基因16s rrna为内参基因，使用2
−
δδct法进行幽门螺杆菌16s rrna、vaca、caga、flaa、ureb的表达检测。
51.图1是青蒿素1/2
×
mic浓度时作用于幽门螺杆菌，幽门螺杆菌主要的毒力因子表达程度。control为无药物处理阴性对照。
52.图2是蒿甲醚1/2
×
mic浓度时作用于幽门螺杆菌，幽门螺杆菌主要的毒力因子表达程度。control为无药物处理阴性对照。
53.图3是青蒿琥酯1/2
×
mic浓度时作用于幽门螺杆菌，幽门螺杆菌主要的毒力因子表达程度。control为无药物处理阴性对照。
54.以上所述，仅为本发明较优的具体的实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。