一种民族药小飞扬草的快速繁殖方法

1.本发明涉及农业生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种民族药小飞扬草的快速繁殖方法。


背景技术：

2.民族药小飞扬草(euphorbia thymifolia l.)系大戟科大戟属植物的全草，也称千根草。作为民族药，小飞扬草主要收录在广东、广西等地方志或地方中药手册中，其有清热利湿、消肿解毒、收敛止痒等功效，主要用于疟疾、泄泻、痔疮、过敏性皮炎、皮肤瘙痒等症的治疗。由于小飞扬草的药效物质基础尚不明确，所以一直未能得到很好的开发利用。有研究表明，小飞扬草中的木犀草素、槲皮素是其发挥抗炎镇痛作用的重要物质基础。小飞扬草主要分布于我国广东、广西、云南、江西和福建等省草地中。目前小飞扬草于野生状态，但随着药农大量采挖，其野生资源锐减，因此发展人工种植小飞扬草显得十分迫切。目前小飞扬草种苗繁殖主要通过扦插方式进行，但存在周期长、繁殖系数低等问题。
3.目前，国内外尚未有小飞扬草组织培养技术的报道，也未有小飞扬草快速繁殖专利的申请。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种民族药小飞扬草的快速繁殖方法，选择小飞扬草当年生茎段为外植体，经诱导不定芽、增殖、生根、移栽等步骤，其不定芽诱导率可达到85％以上，诱导生根率达到了93％以上，移栽成活率达到97％以上，实现了民族药小飞扬草种苗的快速繁殖。
5.本发明提供的技术方案为：一种民族药小飞扬草的快速繁殖方法，包括依次进行的如下步骤：小飞扬草外植体采集、诱导不定芽、增殖培养、生根培养、移栽；
6.所述的用于诱导外植体形成不定芽的诱导培养基包括：ms培养基、2.0～4.0mg/l 6-ba、1.0～2.0mg/l tdz、1.0～3.0mg/l naa、20～30g/l蔗糖、3.0～4.0g/l琼脂，诱导培养基ph为5.4～5.8。
7.所述的外植体诱导形成不定芽操作的方法为：将小飞扬草当年生茎段经消毒后切成3.0～4.0cm的茎段并接种到诱导培养基中，置于25～28℃进行全黑暗培养40～60天即可诱导形成不定芽。
8.所述的增殖培养操作所用到的增殖培养基包括：ms培养基、2.0～3.0mg/l 6-ba、1.0～2.0mg/l iba、20～30g/l蔗糖、3.0～4.0g/l琼脂，增殖培养基ph为5.4～5.8。
9.所述的增殖培养操作具体为：将外植体诱导培养操作得到的不定芽去除顶端后接种到增殖培养基中培养20～30天即可实现不定芽的继代。
10.所述的生根培养操作所用到的生根培养基包括：1/2ms培养基、2.0～3.0mg/l ggr、1.0～2.0mg/l naa、15～20g/l蔗糖、3.0～4.0g/l琼脂、0.5～1.0g/l活性炭，生根培养基ph为5.4～5.8。
11.所述的生根培养操作具体为：将增殖培养操作得到的长3.0～4.0cm的无根不定芽从基部切下并接种到生根培养基中培养20～30天即能生根。
12.所述的移栽操作的具体方法为：将经诱导生根培养操作得到的高约6～7cm、根系粗壮、生长健壮、叶色浓绿的试管苗在温室的自然光下炼苗5～7天，洗净根部的培养基移栽于经消毒处理后的栽培基质中栽培成苗即得种苗。栽培基质的配比为炭土:农家肥:河沙＝8:1:1。
13.增殖培养操作、生根培养操作中培养条件均为：培养温度为25～28℃，光照强度为3000～4000lx，光照时间为10～12小时/天。
14.有益效果：
15.本发明选择小飞扬草当年生茎段为外植体，经诱导不定芽、增殖、生根、移栽等步骤，建立了民族药小飞扬草的组织培养快繁体系。本发明具有技术性强、成本低廉、工艺简单等特点，可直接用于民族药小飞扬草种苗的工厂化生产，对于促进民族药小飞扬草开发利用具有重要的现实意义。
具体实施方式
16.下面结合具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
17.实施例一
18.(1)外植体采集：在野外选取生长健壮、无明显病害的小飞扬草植株当年生茎段为外植体，采集后立即进行保水保湿处理并及时带回实验室。
19.(2)诱导不定芽：当步骤(1)采集回实验室的外植体先在自来水下冲洗过夜，置于超净工作台中于75％的乙醇溶液中消毒10秒钟，无菌水冲洗3次并用无菌滤纸吸干表面水珠后，置于0.1％的升汞溶液中消毒10分钟，无菌水冲洗3次后用无菌滤纸吸干表面水珠后切成3.0～4.0cm左右的茎段并接种到诱导培养基中，置于25℃进行全黑暗培养60天即可诱导形成不定芽，诱导率为85％，污染率为低于20％。所述的诱导培养基为：ms培养基 2.0mg/l 6-ba 1.0mg/l tdz 1.0mg/l naa 20g/l蔗糖 3.0g/l琼脂，ph为5.4。
20.(3)增殖培养：将步骤(2)诱导得到的无根不定芽切成长约3.0～4.0cm的茎段并去除顶端后接种到增殖培养基中培养30天即可实现不定芽的增殖，增殖系数达到2.7倍。所述的增殖培养基为：ms培养基 2.0mg/l 6-ba 1.0mg/l iba 20g/l蔗糖 3.0g/l琼脂，ph为5.4。
21.(4)诱导生根：从基部切取步骤(3)增殖得到的长约3.0～4.0cm的无根不定芽并接种到生根培养基中培养30天即能诱导试管苗生根，生根率为93％。所述的生根培养基为：1/2ms培养基 2.0mg/l ggr 1.0mg/l naa 15g/l蔗糖 3.0g/l琼脂 0.5g/l活性炭，ph为5.4。
22.(5)移栽：将步骤(4)得到的高约6～7cm、根系粗壮、生长健壮、叶色浓绿的试管苗在温室的自然光下炼苗5天，洗净根部的培养基移栽于经消毒处理后的栽培基质(栽培基质的配比为炭土:农家肥:河沙＝8:1:1)中栽培成苗即得种苗，移栽30天后成活率为97％。
23.上述步骤(3)～(4)的培养条件为：培养温度为25℃，光照强度为3000lx，光照时间为10小时/天。
24.实施例二
25.(1)外植体采集：在野外选取生长健壮、无明显病害的小飞扬草植株当年生茎段为外植体，采集后立即进行保水保湿处理并及时带回实验室。
26.(2)诱导不定芽：当步骤(1)采集回实验室的外植体先在自来水下冲洗过夜，置于超净工作台中于75％的乙醇溶液中消毒15秒钟，无菌水冲洗4次并用无菌滤纸吸干表面水珠后，置于0.1％的升汞溶液中消毒15分钟，无菌水冲洗4次后用无菌滤纸吸干表面水珠后切成3.0～4.0cm左右的茎段并接种到诱导培养基中，置于26℃进行全黑暗培养50天即可诱导形成不定芽，诱导率为87.5％，污染率为低于17％。所述的诱导培养基为：ms培养基 3.0mg/l 6-ba 1.5mg/l tdz 1.5mg/l naa 25g/l蔗糖 3.5g/l琼脂，ph为5.6。
27.(3)增殖培养：将步骤(2)诱导得到的无根不定芽切成长约3.0～4.0cm的茎段并去除顶端后接种到增殖培养基中培养25天即可实现不定芽的增殖，增殖系数达到3.0倍。所述的增殖培养基为：ms培养基 2.5mg/l 6-ba 1.5mg/l iba 25g/l蔗糖 3.5g/l琼脂，ph为5.6。
28.(4)诱导生根：从基部切取步骤(3)增殖得到的长约3.0～4.0cm的无根不定芽并接种到生根培养基中培养25天即能诱导试管苗生根，生根率为95.7％。所述的生根培养基为：1/2ms培养基 2.5mg/l ggr 1.5mg/l naa 17g/l蔗糖 3.5g/l琼脂 0.7g/l活性炭，ph为5.6。
29.(5)移栽：将步骤(4)得到的高约6～7cm、根系粗壮、生长健壮、叶色浓绿的试管苗在温室的自然光下炼苗6天，洗净根部的培养基移栽于经消毒处理后的栽培基质(栽培基质的配比为炭土:农家肥:河沙＝8:1:1)中栽培成苗即得种苗，移栽30天后成活率为97.9％。
30.上述步骤(3)～(4)的培养条件为：培养温度为26℃，光照强度为3500lx，光照时间为11小时/天。
31.实施例三
32.(1)外植体采集：在野外选取生长健壮、无明显病害的小飞扬草植株当年生茎段为外植体，采集后立即进行保水保湿处理并及时带回实验室。
33.(2)诱导不定芽：当步骤(1)采集回实验室的外植体先在自来水下冲洗过夜，置于超净工作台中于75％的乙醇溶液中消毒20秒钟，无菌水冲洗5次并用无菌滤纸吸干表面水珠后，置于0.1％的升汞溶液中消毒20分钟，无菌水冲洗5次后用无菌滤纸吸干表面水珠后切成3.0～4.0cm左右的茎段并接种到诱导培养基中，置于28℃进行全黑暗培养40天即可诱导形成不定芽，诱导率为88.9％，污染率为低于15％。所述的诱导培养基为：ms培养基 4.0mg/l 6-ba 2.0mg/l tdz 2.0mg/l naa 25g/l蔗糖 3.5g/l琼脂，ph为5.6。
34.(3)增殖培养：将步骤(2)诱导得到的无根不定芽切成长约3.0～4.0cm的茎段并去除顶端后接种到增殖培养基中培养20天即可实现不定芽的增殖，增殖系数达到3.4倍。所述的增殖培养基为：ms培养基 3.0mg/l 6-ba 2.0mg/l iba 30g/l蔗糖 4.0g/l琼脂，ph为5.8。
35.(4)诱导生根：从基部切取步骤(3)增殖得到的长约3.0～4.0cm的无根不定芽并接种到生根培养基中培养20天即能诱导试管苗生根，生根率为93％。所述的生根培养基为：1/2ms培养基 3.0mg/l ggr 2.0mg/l naa 20g/l蔗糖 4.0g/l琼脂 1.0g/l活性炭，ph为5.8。
36.(5)移栽：将步骤(4)得到的高约6～7cm、根系粗壮、生长健壮、叶色浓绿的试管苗在温室的自然光下炼苗7天，洗净根部的培养基移栽于经消毒处理后的栽培基质(栽培基质
的配比为炭土:农家肥:河沙＝8:1:1)中栽培成苗即得种苗，移栽30天后成活率为100％。
37.上述步骤(3)～(4)的培养条件为：培养温度为28℃，光照强度为4000lx，光照时间为10小时/天。
38.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。