纳升流速双柱毛细管色谱装置及其应用、使用方法与流程

1.本发明属于生物样本的分析鉴别仪器技术领域，具体涉及一种纳升流速双柱毛细管色谱装置及其应用、使用方法。


背景技术：

2.从生物样本(例如血液和尿液)中寻找发现与疾病(例如癌症)密切相关的生物标志物用于疾病的诊断和预后评估是临床医学的迫切需要，这对改善疾病诊断与治疗效果有着极其重要的意义。由于这些生物标志物通常来自发病组织器官部位，分泌到生物体液后的浓度较低(《0.5ng/ml)，因此，建立一种灵敏度高且无样本间交叉污染的分析技术至关重要。纳升级流速毛细管高效液相色谱-质谱(caplc-ms)在线分析方法由于其出色的检测灵敏度特性而广泛用于复杂生物样本中各种生物标志物的分析检测，包括蛋白质、核酸、代谢物和脂质类分子。
3.现有的纳升级流速毛细管高效液相色谱-质谱分析方法采用单根毛细管色谱柱与质谱仪电喷雾(esi)离子化源直接联用方式，从毛细管色谱柱分离后的组分经过esi离子化方式以气态离子状态进入质谱分析仪进行分析检测。该方法由于采用纳升/分钟(nl/min)流速，可以提供高于常规流速的微升/分钟～毫升/分钟(ul/min～ml/min)数十倍的检测灵敏度。然而，现有的纳升级流速毛细管高效液相色谱-质谱技术存在以下主要不足：
4.①
分析通量低，一次只能分析一个样本；清洗色谱柱时，质谱仪器处于待机或无效数据采集状态。
5.②
样本在色谱柱内残留导致样本间的交叉污染，影响样本分析准确性。
6.③
清洗色谱柱的废液直接经过esi离子化源进入质谱仪内，造成对质谱仪不必要的污染，增加了因为清洗仪器而造成的停机次数和时间。
7.④
样本在色谱柱内的残留和积累，降低了色谱柱分离效能和缩短了色谱柱的使用寿命。
8.⑤
因样本在色谱柱内的残留和积累增加了色谱柱发生堵塞而报废的几率。


技术实现要素：

9.本发明的目的在于提供一种对复杂生物样本进行分析的纳升流速双柱毛细管色谱装置及其应用和使用方法。
10.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
11.一种纳升流速双柱毛细管色谱装置，包括自动进样器，第一色谱泵，第二色谱泵，切换阀，第一富集柱，第二富集柱，第一毛细管色谱柱，第二毛细管色谱柱，第一截止阀，第二截止阀，第一废液瓶，第二废液瓶，质谱分析仪；
12.流动相在第一色谱泵的作用下流经自动进样器，由自动进样器流出的溶液进入切换阀，切换阀经第一富集柱对流经第二截止阀和第一毛细管色谱柱的液体进行平衡，流经第一毛细管色谱柱的液体经切换阀进入质谱仪；
13.流动相在第二色谱泵的作用下流经切换阀，切换阀经第二富集柱对流经第一截止阀和第二毛细管色谱柱的液体进行平衡，流经第二毛细管色谱柱的液体经切换阀流入第一废液瓶；
14.所述第一截止阀和所述第二截止阀的出口均与第二废液瓶相连通。
15.本技术采用的质谱仪可为任何商品化电喷雾离子化质谱，包括四级杆-飞行时间质谱、四级杆-轨道阱质谱、离子阱质谱等。
16.上述一种纳升流速双柱毛细管色谱装置，作为一种优选的实施方案，所述自动进样器包括进样泵、进样阀、进样针和样本盘，所述进样阀为6-port-2-position进样阀；所述样本盘包含至少2个待测样本，样本环的两端分别与进样阀的进口2和进样阀的进口5相连通；优选地，样本环为20ul的peek管。
17.所述进样泵与所述进样阀的进口3相连通，所述进样针的一端与所述进样阀的进口4相连通，所述进样针的另一端与所述样本盘相连通。
18.上述一种纳升流速双柱毛细管色谱装置，作为一种优选的实施方案，所述切换阀为10-port-2-position切换阀，所述切换阀内部通道间的死体积＜7nl；
19.所述第一截止阀和所述第二截止阀均为6-port-2-position截止阀。
20.上述一种纳升流速双柱毛细管色谱装置，作为一种优选的实施方案，所述第一色谱泵与所述进样阀的进口1相连通，所述进样阀的出口6与所述切换阀进口10相连通；
21.所述切换阀的出口1和所述第一富集柱相连通，第一富集柱的出口通过三通分别与第二截止阀的进口4和第一毛细管色谱柱相连通，所述第一毛细管色谱柱与所述切换阀的进口4相连通，所述切换阀的出口5与所述质谱仪相连通，所述切换阀的出口3与所述第一废液瓶相连通；所述第二截止阀的出口3上设置有堵头。
22.上述一种纳升流速双柱毛细管色谱装置，作为一种优选的实施方案，所述第二色谱泵与所述切换阀的进口8相连通，所述切换阀的出口9与第二富集柱相连通，所述第二富集柱的出口通过三通分别与第一截止阀的进口2和第二毛细管色谱柱相连通，所述第二毛细管色谱柱与所述切换阀的进口6相连通；所述第一截止阀的出口1上设置有堵头。
23.上述一种纳升流速双柱毛细管色谱装置，作为一种优选的实施方案，所述第一截止阀的出口3和所述第二截止阀的出口5均与所述第二废液瓶相连通。
24.上述一种纳升流速双柱毛细管色谱装置，作为一种优选的实施方案，所述第一富集柱和所述第二富集柱均为75～200μm，id x 2cml的富集柱；所述第一毛细管色谱柱和所述第二毛细管色谱柱均为50～100μm，id x 10～50cml的毛细管色谱柱。
25.本技术的第二方面，提供上述纳升流速双柱毛细管色谱装置在生物样本分析中的应用。
26.本技术的第三方面，提供了上述纳升流速双柱毛细管色谱装置分析复杂生物样本的方法，包括以下步骤：
27.(1)第一个样本的上样：调整进样阀，使进样阀的进口3、进口2、进口5、进口4依次相连通，进样阀的进口1和进样阀的出口6相连通；
28.调整切换阀：使切换阀的出口3、进口2、进口7、进口6依次相连通，使切换阀的进口4和出口5相连通，使切换阀的出口1和进口10相连通，使切换阀的进口8和出口9相连通；
29.调整第一截止阀：使第一截止阀的进口5和进口6相连通，使第一截止阀的进口2和
出口1相连通，使第一截止阀的进口4和出口3相连通；
30.调整第二截止阀：使第二截止阀的进口1和进口2相连通，使第二截止阀的进口6和出口5相连通，使第二截止阀的进口4和出口3相连通；
31.进样针吸取第一个样本5ul；
32.第一色谱泵使用的流动液为95％的流动相a和5％的流动相b，流动液的流速为300nl/min，第二色谱泵使用的流动液为95％的流动相a和5％的流动相b，流动液的流速为1.0ul/min；
33.(2)第一样本的富集：调整进样阀，使进样阀的进口3和进口4相连通，使进样阀的进口1、进口2、进口5和出口6依次相连通；
34.调整切换阀，使切换阀的进口6、进口7、进口2和出口3依次相连通，使切换阀的进口4和出口5相连通，使切换阀的进口10和出口1相连通，使切换阀的进口8和出口9相连通；
35.调整第二截止阀：使第二截止阀的进口1和进口6相连通，使第二截止阀的进口2和出口3相连通，使第二截止阀的进口4和出口5相连通；
36.第一色谱泵使用的流动液为95％的流动相a和5％的流动相b，流动液的流速为5ul/min，第二色谱泵使用的流动液为95％的流动相a和5％的流动相b，流动液的流速为1.0ul/min；
37.(3)梯度洗脱和质谱检测：
38.调整进样阀、切换阀、第一截止阀和第二截止阀的进口、出口连通方式与步骤(1)的连通方式相同；
39.第一色谱泵进行分离梯度洗脱：洗脱方式为：
40.0min＜洗脱时间≤0.1min，由95％流动相a和5％流动相b线性变化为90％流动相a和10％流动相b，洗脱液流速为300nl/min；
41.0.1min＜洗脱时间≤96min，由90％流动相a和5％流动相b线性变化为67％流动相a和33％流动相b，洗脱液流速为300nl/min；
42.96min＜洗脱时间≤106min，由67％流动相a和33％流动相b线性变化为50％流动相a和50％流动相b，洗脱液流速为300nl/min；
43.106min＜洗脱时间≤111min，使用50％流动相a和50％流动相b，由50％流动相a和50％流动相b线性变化为0％流动相a和100％流动相b，洗脱液流速为300nl/min；
44.111min＜洗脱时间≤120min，使用0％流动相a和100％流动相b，洗脱液流速为1000nl/min；
45.第二色谱泵使用的流动液为95％的流动相a和5％的流动相b，流动液的流速为1.0ul/min；
46.(4)第二个样本的上样：调整进样阀、第一截止阀和第二截止阀的进口、出口连通方式均与步骤(1)的连通方式相同；
47.调整切换阀的出口1、进口2、进口7和进口8依次相连通，调整切换阀的进口10和出口9相连通，调整切换阀的进口4和出口3相连通，调整切换阀的进口6和出口5相连通；
48.进样针吸取第二个样本5ul；
49.第一色谱泵使用的流动液为95％的流动相a和5％的流动相b，流动液的流速为300nl/min，第二色谱泵使用的流动液为95％的流动相a和5％的流动相b，流动液的流速为
1.0ul/min；
50.(5)第二样本的富集：调整进样阀，使进样阀的进口3和进口4相连通，使进样阀的进口1、进口2、进口5和出口6依次相连通；
51.调整切换阀，使切换阀的出口1、进口2、进口7、进口8依次相联通，使切换阀的进口10和出口9相连通，使切换阀的进口6和出口5相连通，使切换阀的进口4和出口3相连通；
52.调整第一截止阀，使第一截止阀的出口1和进口6相连通，使第一截止阀的进口4和进口5相连通，使第一截止阀的进口2和出口3相连通；
53.调整第二截止阀，使第二截止阀的进口1和进口2相连通，使第二截止阀的进口4和出口3相连通，使第二截止阀的进口6和出口5相连通；
54.第一色谱泵使用的流动液为95％的流动相a和5％的流动相b，流动液的流速为5ul/min，第二色谱泵使用的流动液为95％的流动相a和5％的流动相b，流动液的流速为1.0ul/min；
55.(6)梯度洗脱和质谱检测：
56.调整进样阀、切换阀和第二截止阀的进口、出口连通方式均与步骤(4)的连通方式相同；
57.调整第一截止阀的进口4和进口5相连通，调整第一截止阀的进口2和出口3相连通，调整第一截止阀的进口6和出口1相连通；
58.第一色谱泵进行清洗梯度洗脱：洗脱方式为：
59.0min＜洗脱时间≤28min，由95％流动相a和5％流动相b线性变化为5％流动相a和95％流动相b，洗脱液流速为1.0ul/min；
60.28min＜洗脱时间≤30min，由5％流动相a和95％流动相b线性变化为95％流动相a和5％流动相b，洗脱液流速为1.0ul/min；
61.30min＜洗脱时间≤58min，由95％流动相a和5％流动相b线性变化为5％流动相a和95％流动相b，洗脱液流速为1.0ul/min；
62.58min＜洗脱时间≤60min，由5％流动相a和95％流动相b线性变化为95％流动相a和5％流动相b，洗脱液流速为1.0ul min；
63.60min＜洗脱时间≤88min，由95％流动相a和5％流动相b线性变化为5％流动相a和95％流动相b，洗脱液流速为1.0ul/min；
64.88min＜洗脱时间≤90min，由5％流动相a和95％流动相b线性变化为95％流动相a和5％流动相b，洗脱液流速为1.0ul/min；
65.90min＜洗脱时间≤118min，由95％流动相a和5％流动相b线性变化为5％流动相a和95％流动相b，洗脱液流速为1.0ul/min；
66.118min＜洗脱时间≤120min，由5％流动相a和95％流动相b线性变化为95％流动相a和5％流动相b，洗脱液流速为1.0ul/min；
67.第二色谱泵使用的流动液为95％的流动相a和5％的流动相b，流动液的流速为1.0ul/min；
68.(7)重复步骤(1)-步骤(6)实现对样本盘中其余样本在纳升流速双柱毛细管色谱的分析。
69.上述一种纳升流速双柱毛细管色谱装置分析复杂生物样本的方，作为一种优选的
实施方案，流动相a为0.1％甲酸的水溶液，流动相b为0.1％甲酸的乙腈溶液。
70.本发明的有益效果为：本发明所述纳升流速双柱毛细管色谱装置，采用双毛细管色谱柱通过一个切换阀(10-port-2-position)将毛细管色谱柱分离的组分与esi离子化源在线联结，达到质谱始终处于采集来自毛细管色谱柱分离的组分，从而达到高通量和低样本交叉污染的效果，可对复杂生物样本(癌症患者的血浆样本)中蛋白质的胰酶酶解产物进行高通量分析。
71.本发明所述纳升流速双柱毛细管色谱装置避免了现有的单根毛细管柱色谱分离技术的分析通量低、样本间交叉污染，毛细管色谱柱寿命短和毛细管色谱柱清洗废液污染质谱分析仪的问题，可用于血液、尿液和组织等复杂生物样本中代谢物、核酸、蛋白质及蛋白质酶解产物的纳升级流速毛细管色谱-质谱分析，同时也适用环境污染物和药物残留的高灵敏分析。
72.本发明所述纳升流速双柱毛细管色谱装置为从生物样本中寻找发现与疾病密切相关的生物标志物提供了一种通量高、无样本间交叉污染、延长色谱柱寿命和降低质谱仪污染的高效分析技术。
附图说明
73.为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
74.本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
75.图-1a为本发明所述纳升流速双柱毛细管色谱装置第一个样本上样的结构示意图；
76.图-1b为本发明所述纳升流速双柱毛细管色谱装置第一个样本富集的结构示意图；
77.图-1c为本发明所述纳升流速双柱毛细管色谱装置第一个样本梯度洗脱和质谱检测的结构示意图；
78.图-1d为本发明所述纳升流速双柱毛细管色谱装置第二个样本上样的结构示意图；
79.图-1e为本发明所述纳升流速双柱毛细管色谱装置第二个样本富集的结构示意图；
80.图-1f为本发明所述纳升流速双柱毛细管色谱装置第二个样本梯度洗脱和质谱检测的结构示意图；
81.图-2a为本发明所述纳升流速双柱毛细管色谱装置第一样本的分离和清洗条件；
82.图-2b为本发明所述纳升流速双柱毛细管色谱装置第二样本的分离和清洗条件；
83.图3为本发明所述纳升流速双柱毛细管色谱装置在线联用分析与单柱毛细管色
谱-质谱在线联用分析清洗效果对比图；
84.图4为本发明所述纳升流速双柱毛细管色谱装置和单柱毛细管色谱-质谱的分析结果比较；
85.图5为本发明所述纳升流速双柱毛细管色谱装置分析的重现性；
86.图中：1、进样泵；2、进样阀；3、进样针；4、样本盘；5、第一色谱泵；6、第二色谱泵；7、切换阀；8、第一富集柱；9、第二富集柱；10、第一毛细管色谱柱；11、第二毛细管色谱柱；12、第一截止阀；13、第二截止阀；14、第一废液瓶；15、第二废液瓶；16、质谱分析仪。
具体实施方式
87.以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
88.在本技术中，术语“上”、“下”、“左”、“右”、“前”、“后”、“顶”、“底”、“内”、“外”、“中”、“竖直”、“水平”、“横向”、“纵向”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系。这些术语主要是为了更好地描述本技术及其实施例，并非用于限定所指示的装置、元件或组成部分必须具有特定方位，或以特定方位进行构造和操作。
89.并且，上述部分术语除了可以用于表示方位或位置关系以外，还可能用于表示其他含义，例如术语“上”在某些情况下也可能用于表示某种依附关系或连接关系。对于本领域普通技术人员而言，可以根据具体情况理解这些术语在本技术中的具体含义。
90.本发明提供了一种纳升流速双柱毛细管色谱装置，包括自动进样器，第一色谱泵，第二色谱泵，切换阀，第一富集柱，第二富集柱，第一毛细管色谱柱，第二毛细管色谱柱，第一截止阀，第二截止阀，第一废液瓶，第二废液瓶，质谱分析仪；
91.流动相在第一色谱泵的作用下流经自动进样器，由自动进样器流出的溶液进入切换阀，切换阀经第一富集柱对流经第二截止阀和第一毛细管色谱柱的液体进行平衡，流经第一毛细管色谱柱的液体经切换阀进入质谱仪；
92.流动相在第二色谱泵的作用下流经切换阀，切换阀经第二富集柱对流经第一截止阀和第二毛细管色谱柱的液体进行平衡，流经第二毛细管色谱柱的液体经切换阀流入第一废液瓶；
93.所述第一截止阀和所述第二截止阀的出口均与第二废液瓶相连通。
94.本技术所采用的进样阀为6-port-2-position进样阀，所采用的切换阀为10-port-2-position切换阀，所述切换阀内部通道间的死体积＜7nl，所采用的第一截止阀和第二截止阀均为6-port-2-position截止阀。
95.本技术描述的自动进样器，包括进样泵、进样阀、进样针和样本盘；且所述样本盘包含至少2个待测样本，样本环的两端分别与进样阀的进口2和进样阀的进口5相连通。
96.进样泵与所述进样阀的进口3相连通，所述进样针的一端与所述进样阀的进口4相连通，所述进样针的另一端与所述样本盘相连通。
97.第一色谱泵与进样阀的进口1相连通，进样阀的出口6与切换阀进口10相连通；
98.所述切换阀的出口1和所述第一富集柱相连通，第一富集柱的出口通过三通分别
与第二截止阀的进口4和第一毛细管色谱柱相连通，所述第一毛细管色谱柱与所述切换阀的进口4相连通，所述切换阀的出口5与所述质谱仪相连通，所述切换阀的出口3与所述第一废液瓶相连通；所述第二截止阀的出口3上设置有堵头。
99.所述第二色谱泵与所述切换阀的进口8相连通，所述切换阀的出口9与第二富集柱相连通，所述第二富集柱的出口通过三通分别与第一截止阀的进口2和第二毛细管色谱柱相连通，所述第二毛细管色谱柱与所述切换阀的进口6相连通；所述第一截止阀的出口1上设置有堵头。
100.所述第一截止阀的出口3和所述第二截止阀的出口5均与所述第二废液瓶相连通。
101.为实现大体积上样，所述第一富集柱和所述第二富集柱均采用75～200μm，id x 2cml的富集柱；所述第一毛细管色谱柱和所述第二毛细管色谱柱均采用50～100μm，id x 10～50cml的毛细管色谱柱。
102.实施例1
103.一种纳升流速双柱毛细管色谱装置分析复杂生物样本的方法，包括以下步骤：
104.(1)第一个样本的上样：调整进样阀，使进样阀的进口3、进口2、进口5、进口4依次相连通，进样阀的进口1和进样阀的出口6相连通；
105.调整切换阀：使切换阀的出口3、进口2、进口7、进口6依次相连通，使切换阀的进口4和出口5相连通，使切换阀的出口1和进口10相连通，使切换阀的进口8和出口9相连通；
106.调整第一截止阀：使第一截止阀的进口5和进口6相连通，使第一截止阀的进口2和出口1相连通，使第一截止阀的进口4和出口3相连通；
107.调整第二截止阀：使第二截止阀的进口1和进口2相连通，使第二截止阀的进口6和出口5相连通，使第二截止阀的进口4和出口3相连通；
108.第一色谱泵通过进样针从样本盘中第一个样本瓶内吸取一定体积的样本(5ul)至进样阀的样本环内。第一色谱泵将95％流动相-a和5％流动相-b以300nl/min流速流经进样阀、由进样阀流出的液体流入切换阀，切换阀经第一富集柱对流经第二截止阀和第一毛细管色谱柱的液体进行平衡。从第一富集柱流出的溶液经过三通后分别进入第二截止阀的进口4和第一毛细管色谱柱，因第二截止阀的出口3连接堵头，而使溶液全部流经第一毛细管色谱柱。从第一毛细管色谱柱流出的溶液进入切换阀的进口4后从出口5流出而进入质谱仪的电喷雾离子化源，此时电离电压为“0”kv；
109.第二色谱泵以1.0ul/min(流动液为95％的流动相a和5％的流动相b)流速流经切换阀，切换阀经第二富集柱对流经第一截止阀和第二毛细管色谱柱的液体进行平衡。从第二富集柱流出的溶液经过三通后分别进入第一截止阀的进口2和第二毛细管色谱柱，因第一截止阀的出口1连接堵头，而使溶液全部流经第二毛细管色谱柱(对第二毛细管色谱柱进行洗脱清洗)，从第二毛细管色谱柱流出的溶液进入切换阀的进口6后从出口3流出而进入第一废液瓶。
110.(2)第一样本的富集：调整进样阀，使进样阀的进口3和进口4相连通，使进样阀的进口1、进口2、进口5和出口6依次相连通；
111.调整切换阀，使切换阀的进口6、进口7、进口2和出口3依次相连通，使切换阀的进口4和出口5相连通，使切换阀的进口10和出口1相连通，使切换阀的进口8和出口9相连通；
112.调整第二截止阀：使第二截止阀的进口1和进口6相连通，使第二截止阀的进口2和
出口3相连通，使第二截止阀的进口4和出口5相连通；
113.第一色谱泵将95％流动相a和5％流动相b以5ul/min流速进入进样阀进口1后，将进样阀样本环内的样本从进样阀出口6推出经切换阀进入第一富集柱。样本被富集在第一富集柱内，从第一富集柱流出的溶液经过三通后分别进入第二截止阀的进口4和第一毛细管色谱柱，因第二截止阀的出口5连接到第二废液瓶，在第一毛细管色谱柱固定相的阻力(反压)而使溶液全部流入第二废液瓶。
114.第二色谱泵以1.0ul/min(流动液为95％的流动相a和5％的流动相b)流速流经切换阀，切换阀经第二富集柱对流经第一截止阀和第二毛细管色谱柱的液体进行平衡。从第二富集柱流出的溶液经过三通后分别进入第一截止阀的进口2和第二毛细管色谱柱，因第一截止阀的出口1连接堵头而使溶液全部流经第二毛细管色谱柱。从第二毛细管色谱柱流出的溶液进入切换阀的进口6后从出口3流出而进入第一废液瓶。
115.(3)梯度洗脱和质谱检测：
116.调整进样阀、切换阀、第一截止阀和第二截止阀的进口、出口连通方式与步骤(1)的连通方式相同；
117.第一色谱泵将流动相a和流动相b按照梯度洗脱程序流经进样阀、切换阀对第一富集柱和第一毛细管色谱柱进行梯度洗脱。从第一富集柱洗脱流出的样本组分溶液经过三通后分别进入第二截止阀的进口4和第一毛细管色谱柱，因第二截止阀的出口3连接堵头，而使样本组分溶液全部流经第一毛细管色谱柱。从第一毛细管色谱柱分离后的样本组分进入切换阀的进口4后从出口5流出而进入质谱仪的电喷雾离子化源(电离电压为2.0kv)，离子化后的样本组分进入质谱仪并得到检测；
118.第一色谱泵进行分离梯度洗脱：洗脱方式为：
119.0min＜洗脱时间≤0.1min，由95％流动相a和5％流动相b线性变化为90％流动相a和10％流动相b，洗脱液流速为300nl/min；
120.0.1min＜洗脱时间≤96min，由90％流动相a和10％流动相b线性变化为67％流动相a和33％流动相b，洗脱液流速为300nl/min；
121.96min＜洗脱时间≤106min，由67％流动相a和33％流动相b线性变化为50％流动相a和50％流动相b，洗脱液流速为300nl/min；
122.106min＜洗脱时间≤111min，使用50％流动相a和50％流动相b，由50％流动相a和50％流动相b线性变化为0％流动相a和100％流动相b，洗脱液流速为300nl/min；
123.111min＜洗脱时间≤120min，使用0％流动相a和100％流动相b，洗脱液流速为1000nl/min；
124.第二色谱泵使用的流动液为95％的流动相a和5％的流动相b，流动液的流速为1.0ul/min。
125.第二色谱泵以1.0ul/min流速(流动液为95％的流动相a和5％的流动相b)流经切换阀和第一截止阀对第二富集柱和第二毛细管色谱柱进行梯度洗脱清洗。从第二富集柱流出的溶液经过三通后分别进入第一截止阀的进口2和第二毛细管色谱柱，因第一截止阀的出口1连接堵头，而使溶液全部流经第二毛细管色谱柱。从第二毛细管色谱柱流出的溶液进入切换阀的进口6后从出口3流出而进入第一废液瓶。
126.(4)第二个样本的上样：调整进样阀、第一截止阀和第二截止阀的进口、出口连通
方式均与步骤(1)的连通方式相同；
127.调整切换阀的出口1、进口2、进口7和进口8依次相连通，调整切换阀的进口10和出口9相连通，调整切换阀的进口4和出口3相连通，调整切换阀的进口6和出口5相连通；
128.第一色谱泵通过进样针从样本盘中第二个样本瓶内吸取一定体积的样本(5ul)至进样阀的样本环内。第一色谱泵将95％流动相a和5％流动相b以300nl/min流速流经进样阀、由进样阀流出的液体流入切换阀，切换阀经第二富集柱对流经第一截止阀和第二毛细管色谱柱的液体进行平衡。从第二富集柱流出的溶液经过三通后分别进入第一截止阀的进口2和第二毛细管色谱柱，因第一截止阀的出口1连接堵头而使溶液全部流经第二毛细管色谱柱。从第二毛细管色谱柱流出的溶液进入切换阀的进口6后从出口5流出而进入质谱仪的电喷雾离子化源，此时电离电压为“0”kv；第二色谱泵以1.0ul/min(流动液为95％的流动相a和5％的流动相b)流速流经切换阀，切换阀经第一富集柱对流经第二截止阀和第一毛细管色谱柱的液体进行平衡。从第一富集柱流出的溶液经过三通后分别进入第二截止阀的进口4和第一毛细管色谱柱，因第二截止阀的出口3连接堵头而使溶液全部流经第一毛细管色谱柱。从第一毛细管色谱柱流出的溶液进入切换阀的进口4后从出口3流出而进入第一废液瓶。
129.(5)第二样本的富集：调整进样阀，使进样阀的进口3和进口4相连通，使进样阀的进口1、进口2、进口5和出口6依次相连通；
130.调整切换阀，使切换阀的出口1、进口2、进口7、进口8依次相联通，使切换阀的进口10和出口9相连通，使切换阀的进口6和出口5相连通，使切换阀的进口4和出口3相连通；
131.调整第一截止阀，使第一截止阀的出口1和进口6相连通，使第一截止阀的进口4和进口5相连通，使第一截止阀的进口2和出口3相连通；
132.调整第二截止阀，使第二截止阀的进口1和进口2相连通，使第二截止阀的进口4和出口3相连通，使第二截止阀的进口6和出口5相连通；
133.第一色谱泵将95％流动相a和5％流动相b以5ul/min流速进入进样阀进口1后，将进样阀样本环内的样本从进样阀出口6推出后进入切换阀进口10，然后从切换阀出口9流出并进入第二富集柱。样本被富集在第二富集柱内，从第二富集柱流出的溶液经过三通后分别进入第一截止阀的进口2和第二毛细管色谱柱，因第一截止阀的出口3连接到第二废液瓶和第二毛细管色谱柱固定相的阻力(反压)而使溶液全部流入第二废液瓶。
134.第二色谱泵以1.0ul/min(流动液为95％的流动相a和5％的流动相b)流经切换阀和第一截止阀对第一富集柱和第一毛细管色谱柱进行梯度洗脱清洗。从第一富集柱流出的溶液经过三通后分别进入第二截止阀的进口4和第一毛细管色谱柱，因第二截止阀的出口3连接堵头而使溶液全部流经第一毛细管色谱柱。从第一毛细管色谱柱流出的溶液进入切换阀的进口4后从出口3流出而进入第一废液瓶。
135.(6)梯度洗脱和质谱检测：
136.调整进样阀、切换阀和第二截止阀的进口、出口连通方式均与步骤(4)的连通方式相同；
137.调整第一截止阀的进口4和进口5相连通，调整第一截止阀的进口2和出口3相连通，调整第一截止阀的进口6和出口1相连通；
138.第一色谱泵将流动相a和流动相b按照梯度洗脱程序以350nl/min流速流经进样
阀、切换阀对第二富集柱和第二毛细管色谱柱进行梯度洗脱。从第二富集柱洗脱流出的样本组分溶液经过三通后分别进入第一截止阀的进口2和第二毛细管色谱柱，因第一截止阀的出口3连接堵头而使溶液全部流经第二毛细管色谱柱。从第二毛细管色谱柱分离后的样本组分进入切换阀的进口6后从出口5流出而进入质谱仪的电喷雾离子化源(电离电压为2.0kv)，离子化后的样本组分进入质谱仪并得到检测。
139.第一色谱泵进行清洗梯度洗脱：洗脱方式为：
140.0min＜洗脱时间≤28min，由95％流动相a和5％流动相b线性变化为5％流动相a和95％流动相b，洗脱液流速为1.0ul/min；
141.28min＜洗脱时间≤30min，由5％流动相a和95％流动相b线性变化为95％流动相a和5％流动相b，洗脱液流速为1.0ul/min；
142.30min＜洗脱时间≤58min，由95％流动相a和5％流动相b线性变化为5％流动相a和95％流动相b，洗脱液流速为1.0ul/min；
143.58min＜洗脱时间≤60min，由5％流动相a和95％流动相b线性变化为95％流动相a和5％流动相b，洗脱液流速为1.0ul/min；
144.60min＜洗脱时间≤88min，由95％流动相a和5％流动相b线性变化为5％流动相a和％流动相b，洗脱液流速为1.0ul/min；
145.88min＜洗脱时间≤90min，，由5％流动相a和95％流动相b线性变化为95％流动相a和5％流动相b，洗脱液流速为1.0ul/min；
146.90min＜洗脱时间≤118min，由95％流动相a和5％流动相b线性变化为5％流动相a和95％流动相b，洗脱液流速为1.0ul/min；
147.118min＜洗脱时间≤120min，由5％流动相a和95％流动相b线性变化为95％流动相a和5％流动相b，洗脱液流速为1.0ul/min；
148.第二色谱泵以1.0ul/min(流动液为95％的流动相a和5％的流动相b)流经切换阀和第二截止阀对第一富集柱和第一毛细管色谱柱进行梯度洗脱清洗。从第一富集柱流出的溶液经过三通后分别进入第二截止阀的进口4和第一毛细管色谱柱，因第二截止阀的出口3连接堵头而使溶液全部流经第一毛细管色谱柱。从第一毛细管色谱柱流出的溶液进入切换阀的进口4后从出口3流出而进入第一废液瓶。
149.(7)重复步骤(1)-步骤(6)实现对样本盘中其余样本在纳升流速双柱毛细管色谱的分析。
150.本发明所述纳升流速双柱毛细管色谱装置在复杂生物样本分析中的应用：
151.针对本技术所述纳升流速双柱毛细管色谱装置，发明人设计了合理的色谱分离分析条件和色谱柱清洗条件。(见图-2所示)：
152.图-2a为流速为300nl/min的梯度洗脱曲线，分析时间为120分钟，此时系统中其中一套富集柱和毛细管色谱柱(如图-1c中的第一富集柱和第一毛细管色谱柱)与质谱仪在线联用分析，实现高灵敏分析检测，梯度分离洗脱程序如下：
153.0min＜洗脱时间≤0.1min，由95％流动相a和5％流动相b线性变化为90％流动相a和10％流动相b，洗脱液流速为300nl/min；
154.0.1min＜洗脱时间≤96min，由90％流动相a和10％流动相b线性变化为67％流动相a和33％流动相b，洗脱液流速为300nl/min；
155.96min＜洗脱时间≤106min，由67％流动相a和33％流动相b线性变化为50％流动相a和50％流动相b，洗脱液流速为300nl/min；
156.106min＜洗脱时间≤111min，由50％流动相a和50％流动相b线性变化为0％流动相a和100％流动相b，洗脱液流速为300nl/min；
157.111min＜洗脱时间≤120min，使用0％流动相a和100％流动相b，洗脱液流速为1000nl/min。
158.图-2b为流速为1.0ul/min的高流速梯度清洗系统中另外一套富集柱和毛细管色谱柱(如图-1c中的第二富集柱和第二毛细管色谱柱)，清洗废液不进入质谱仪而直接进入废液收集瓶，避免了因清洗色谱柱的废液进入质谱仪而对仪器产生的污染，梯度清洗洗脱程序如下所示：
159.0min＜洗脱时间≤28min，由95％流动相a和5％流动相b线性变化为5％流动相a和95％流动相b，洗脱液流速为1.0ul/min；
160.28min＜洗脱时间≤30min，由5％流动相a和95％流动相b线性变化为95％流动相a和5％流动相b，洗脱液流速为1.0ul/min；
161.30min＜洗脱时间≤58min，由95％流动相a和5％流动相b线性变化为5％流动相a和95％流动相b，洗脱液流速为1.0ul/min；
162.58min＜洗脱时间≤60min，由5％流动相a和95％流动相b线性变化为95％流动相a和5％流动相b，洗脱液流速为1.0ul/min；
163.60min＜洗脱时间≤88min，由95％流动相a和5％流动相b线性变化为5％流动相a和95％流动相b，洗脱液流速为1.0ul/min；
164.88min＜洗脱时间≤90min，由5％流动相a和95％流动相b线性变化为95％流动相a和5％流动相b，洗脱液流速为1.0ul/min；
165.90min＜洗脱时间≤118min，由95％流动相a和5％流动相b线性变化为5％流动相a和95％流动相b，洗脱液流速为1.0ul/min；
166.118min＜洗脱时间≤120min，使用5％流动相a和95％流动相b，洗脱液流速为1.0ul/min。
167.采用300nl/min用于样本在纳升流速双柱毛细管色谱装置之一的富集柱和毛细管色谱柱(如第一富集柱和第一毛细管色谱柱)分离以保障质谱检测的灵敏度，此时第一富集柱和第一毛细管色谱柱与质谱仪在线联结，如图-1c，梯度洗脱分离时间为120分钟；采用1.0ul/min用于纳升流速双柱毛细管色谱装置中的另一富集柱和毛细管色谱柱(如第二富集柱和第二毛细管色谱柱)的高流速梯度清洗以最大限度除去残留在第二富集柱和第二毛细管色谱柱的样本，每次高流速的梯度洗脱清洗时间为30分钟。此时第二富集柱和第二毛细管色谱柱与质谱离线联结，如图-1c，清洗废液不进入质谱仪，直接进入废液收集瓶，避免了因为清洗色谱柱的废液进入质谱仪而对仪器产生的污染。而当切换阀切换至另外一个位置时，系统将通过第二富集柱和第二毛细管色谱柱以300nl/min流速梯度分离洗脱另外一个样本和进行在线质谱分析检测，即第二富集柱和第二毛细管色谱柱与质谱仪在线联结(见图-1f)；与此同时采用1.0ul/min高流速梯度洗脱清洗残留在第一富集柱和第一毛细管色谱柱的上一个样本，清洗废液不进入质谱仪而直接进入废液收集瓶，避免了因清洗色谱柱的废液进入质谱仪而对仪器产生的污染(见图-1f)。
168.1.采用本发明所述纳升流速双柱毛细管色谱装置对来自乳腺癌患者的血浆蛋白的胰酶酶解产物进行分析，以常规使用的单柱毛细管色谱-质谱在线联用做对比分析。
169.检测不同保留时间下检测到的不同质荷比(m/z)的肽段分子的信号强度进行二维图谱展示(见图-3所示)，图中的灰黑度表示被检测到的肽段分子的信号强弱。
170.图3右下部分为：使用通常采用的单柱毛细管色谱-质谱在线联用分析，在样本分析结束后，对毛细管色谱柱进行了三次清洗，得到每次清洗后的质谱分析结果；
171.图3左下部分为：采用本技术所述纳升流速双柱毛细管色谱装置在线联用分析相同的样本，对毛细管色谱柱进行了一次清洗，得到清洗后的质谱分析结果。
172.从图3中可以看出：
173.通过对比对毛细管柱进行一次清洗后的结果：从图3中可以看出单毛细管色谱柱内被分离样本的残留明显高于本技术所述双毛细管色谱柱内被分离样本的残留(图-3右下部分的第一张图和图-3左下部分)。
174.即使对常规采用的单毛细管色谱柱进行了三次清洗，第三次清洗结果显示其毛细管色谱柱被分离样本的残留也高于本技术所述双毛细管色谱柱一次清洗后的被分离样本的残留(图-3右下部分的第三张图和图-3左下部分)。
175.随机地选择五种不同质荷比(m/z)的肽段分子(m/z：515.627；651.563；667.718；789.906；979.275)，通过分析比较它们在本技术所述双柱毛细管色谱-质谱在线联用分析结果和在常规单柱毛细管色谱-质谱在线联用分析结果，进一步验证本技术所述双柱毛细管色谱-质谱在线联用技术在减少样本在毛细管色谱柱内的残留和降低样本之间的交叉污染方面远远优于常规的单柱毛细管色谱-质谱在线联用方法，验证结果如图4所示。
176.2.本技术所述纳升流速双柱毛细管色谱装置在分析复杂生物样本时重现性和可靠性的检验
177.使用相同的血浆样本胰蛋白酶酶解产物在本技术所述纳升流速双柱毛细管色谱-质谱系统上重复进行三次分析，以评估本发明技术在分析实际生物样本时的重现性(见图-5所示)。
178.从图5可以看出：结果显示三次重复分析的基线峰强度分别为1.35e7、1.33e7、1.32e7。其标准偏差为0.015，变异系数为1.15％，即本发明所述纳升流速双柱毛细管色谱装置在分析复杂生物样本时具有良好的重现性和可靠性。
179.虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。