一种多重交联的可注射骨修复水凝胶制备材料及其制备方法

一种多重交联的可注射骨修复水凝胶制备材料及其制备方法
1.技术领域
2.本发明属于生物医学工程技术领域，具体涉及一种多重交联的可注射骨修复水凝胶制备材料及其制备方法。


背景技术：

3.临床针对由创伤、肿瘤、感染等各种原因导致的骨缺损修复，多采用自体骨为主，人工骨为辅的策略。而现有人工骨产品多为无机陶瓷，植入多采用器械局部填塞，且在血液冲刷下易溃散，原位骨修复能力弱，易形成异位骨化。除无机陶瓷外，还开发了金属、有机高分子等骨修复材料，但无论哪一种现有骨修复材料，均存在缺损部位骨量丢失风险。现有骨修复材料多采用仿生设计，结合有机和无机材料构建修复平台。磷酸钙骨水泥（cpc）和半水α-硫酸钙（csh）虽然得到了临床应用，但cpc注射性能差，易塌陷，而csh骨诱导能力差。可注射水凝胶具有固有的生物相容性、生物降解性和可注射性，在多生物领域得到了应用。但是作为骨修复材料，其力学性能的弊端限制了其应用。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种多重交联的可注射骨修复水凝胶制备材料及其制备方法，该可注射骨修复水凝胶的力学性能显著提升，并且在功能设计上，同时满足生物相容性高，可注射性强，骨诱导能力好，光热转化效率高。
5.本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：一种可注射骨修复水凝胶材料，包括水凝胶基体以及多重交联改性剂；上述水凝胶基体至少包括羧甲基壳聚糖、氧化海藻酸镁，上述多重交联改性剂包括丝素蛋白、多巴胺包裹纳米羟基磷灰石。
6.本发明构建了一种骨缺损修复可注射水凝胶体系，该水凝胶以羧甲基壳聚糖、氧化海藻酸镁为基体，可在常温下短时间内成胶，满足临床注射要求。该体系中无机成分纳米羟基磷灰石，并非单纯以物理方式结合，而是通过有机分子包裹，进一步实现了化学交联，使体系凝胶性能更加稳定。此外本体系水凝胶还加入了丝素蛋白，利用丝素蛋白的机械性能和双重化学交联，进一步提升了水凝胶的力学性能。以此获得了注射性能、力学性能、生物性能满足临床骨缺损的修复的可注射水凝胶。且该水凝胶具有较强的光热转化效率，对成骨细胞增殖具有明显的促进作用。
7.对本发明而言，水凝胶基体中采用柯里拉京/羧甲基壳聚糖复合物替代羧甲基壳聚糖。本发明采用柯里拉京与羧甲基壳聚糖研磨复配得到柯里拉京/羧甲基壳聚糖复合物，再与氧化海藻酸镁构建水凝胶网络体系，对其网络结构产生有益的影响，使水凝胶具有更优的力学性能，其弹性模量和压缩强度显著提升；并且制得的水凝胶具有良好的生物相容性及降解性，一定程度上能够促进水凝胶促细胞增殖、成骨细胞诱导骨化能力，提升水凝胶
的光热转化性能。
8.对本发明而言，上述柯里拉京/羧甲基壳聚糖复合物的制备方法，包括：在柯里拉京、羧甲基壳聚糖中加入去离子水湿润混合，研磨至干燥蓬松状，制得柯里拉京/羧甲基壳聚糖复合物。
9.对本发明而言，柯里拉京与羧甲基壳聚糖的质量比为1:5-7。
10.对本发明而言，上述氧化海藻酸镁由海藻酸镁通过高碘酸钠氧化而得。
11.具体的，上述氧化海藻酸镁的制备方法，包括：将海藻酸镁ma溶于去离子水，充分搅拌，获得浓度为0.015-0.025g/ml的ma溶液；加入高碘酸钠，在室温避光条件下搅拌反应12-15h，加入乙二醇继续反应2-3h以终止氧化反应；去离子水透析72-84h，将透析后的溶液在-80
‑‑
85℃条件下冷冻并干燥，获得氧化海藻酸镁oma。
12.对本发明而言，ma与高碘酸钠的质量比为1:1-1.5；ma与乙二醇的质量体积比为1g:4-6ml。
13.具体的，上述多巴胺包裹纳米羟基磷灰石的制备方法，步骤为：将纳米羟基磷灰石溶于ph 8-9 trils缓冲液，充分搅拌后超声20-30min，获得浓度为0.1-0.3wt%的溶液a；取盐酸多巴胺溶于去离子水，充分搅拌混合，获得浓度为0.1-0.3wt%的溶液b；将溶液a以恒定速度逐滴加到溶液b中搅拌混合，搅拌速度500-1000r/min，持续搅拌12-24h，冷冻干燥，得到多巴胺包裹的纳米羟基磷灰石pha。
14.对本发明而言，纳米羟基磷灰石与盐酸多巴胺的质量比为1:1-1.3。
15.本发明还提供了上述可注射骨修复水凝胶的制备方法，包括以下步骤：将羧甲基壳聚糖、氧化海藻酸镁溶于去离子水中，然后加入改性剂丝素蛋白及多巴胺包裹纳米羟基磷灰石，搅拌5-10min后静置，即可得到改性后的羧甲基壳聚糖-氧化海藻酸镁水凝胶；或，将柯里拉京/羧甲基壳聚糖复合物、氧化海藻酸镁溶于去离子水中，然后加入改性剂丝素蛋白及多巴胺包裹纳米羟基磷灰石，搅拌5-10min后静置，即可得到改性后的柯里拉京/羧甲基壳聚糖复合物-氧化海藻酸镁水凝胶。
16.对本发明而言，去离子水中羧甲基壳聚糖或柯里拉京/羧甲基壳聚糖复合物的百分含量为4-6%；羧甲基壳聚糖或柯里拉京/羧甲基壳聚糖复合物与氧化海藻酸镁的质量比为1:0.7-1；羧甲基壳聚糖或柯里拉京/羧甲基壳聚糖复合物与丝素蛋白、多巴胺包裹纳米羟基磷灰石的质量比为5:2-3:1.5-2.5。
17.对本发明而言，水凝胶的弹性模量≥0.16mpa，压缩强度≥0.19mpa；更优选地，水凝胶的弹性模量≥0.18mpa，压缩强度＞0.25mpa。
18.本发明还公开了上述制备方法制得的水凝胶在制备骨修复材料、吸附材料以及载体材料中的用途。
19.本发明还公开了一种组合物，包含上述制备方法制得的水凝胶，上述组合物具有如下功效：止血活性、促成骨细胞增殖活性及成骨细胞诱导骨化活性。
20.更优选地，上述组合物还包括茶黄素，其中茶黄素用量为水凝胶质量的5-10%。本发明制备的水凝胶具有良好的生物活性，将其与茶黄素复配使用，应用于保健品、药剂中，得到的产品具有良好的生物相容性及降解性同时，具有更高的止血性能；且当茶黄素与柯里拉京/羧甲基壳聚糖复合物同时存在的条件下，水凝胶的促细胞增殖、成骨细胞诱导骨化
能力以及止血能力进一步提升。
21.本发明的有益效果：本发明提供了一种可注射骨修复水凝胶的制备方法。该水凝胶采用半湿润研磨法制备柯里拉京/羧甲基壳聚糖复合物，然后以柯里拉京/羧甲基壳聚糖复合物或羧甲基壳聚糖、氧化海藻酸镁为基体，满足临床注射需求，在此基础上加入丝素蛋白与多巴胺包裹纳米羟基磷灰石对水凝胶进行改性，使其具有更强的光热转化效率及更好的力学性能，且促细胞增殖、成骨细胞诱导骨化能力得到有效提升。另外，将其与茶黄素复配使用时，制得的水凝胶具有良好的生物相容性及降解性的同时，其对成骨细胞增殖、诱导骨化能力以及止血性能活性具有进一步的提升。
22.因此，本发明提供了一种多重交联的可注射骨修复水凝胶制备材料及其制备方法，该可注射骨修复水凝胶的力学性能显著提升，并且在功能设计上，同时满足生物相容性高，可注射性强，骨诱导能力好，光热转化效率高。
附图说明
23.图1为实施例1制备的氧化海藻酸镁实物图；图2为实施例1制备的多巴胺包裹纳米羟基磷灰石扫描电镜图；图3为水凝胶的压缩强度测试结果；图4为水凝胶的弹性模量测试结果；图5为实施例1制备的水凝胶扫描电镜图；图6为水凝胶的溶胀率测试结果；图7为水凝胶的体外降解情况；图8为水凝胶的光热转化性能测试结果；图9为水凝胶对细胞增殖的影响；图10为水凝胶对成骨细胞诱导骨化的影响；图11为水凝胶的血液相容性测试结果；图12为水凝胶的止血性测试结果。
具体实施方式
24.以下结合具体实施方式和附图对本发明的技术方案作进一步详细描述：本发明实施例所用丝素蛋白的制备方法：按质量体积比为1g:30ml的比例取干蚕茧放入浓度5g/l的na2co3中煮沸30min进行脱胶，脱胶后用去离子水洗涤，重复2次干燥箱干燥；按质量体积比为1g:10ml的比例将脱胶后的蚕丝溶于三元体系cacl2·
ch3ch2oh
·
h2o，摩尔比1:2:8的水溶液中，80℃加热2h；2000r/min离心15min，过滤，去离子水透析，冷冻干燥，得到丝素蛋白。
25.实施例1：一种多重交联的可注射骨修复水凝胶的制备：取柯里拉京、羧甲基壳聚糖加入去离子水湿润混合，研磨至干燥蓬松状，制得柯里拉京/羧甲基壳聚糖复合物；其中，柯里拉京与羧甲基壳聚糖的质量比为1:5；将海藻酸镁ma溶于去离子水，充分搅拌，获得浓度为0.02g/ml的ma溶液；加入高碘
酸钠，在室温避光条件下搅拌反应12h；之后加入乙二醇继续反应2h以终止氧化反应；去离子水透析72h（透析袋截断分子量：3500 da），将透析后的溶液在-80℃条件下冷冻并干燥，获得氧化海藻酸镁oma（其实物如图1所示）；其中，ma与高碘酸钠的质量比为1:1；ma与乙二醇的质量体积比为1g:5ml；将纳米羟基磷灰石溶于ph 8.5 trils缓冲液，充分搅拌后超声20min，获得浓度为0.2wt%的溶液a；取盐酸多巴胺溶于去离子水，充分搅拌混合，获得浓度为0.2wt%的溶液b；然后按照纳米羟基磷灰石与盐酸多巴胺的质量比为1:1的比例，将溶液a以恒定速度逐滴加到溶液b中搅拌混合，搅拌速度1000r/min，持续搅拌12h，冷冻干燥，得到多巴胺包裹的纳米羟基磷灰石pha，电镜扫描观察结如图2所示，证明成功合成纳米颗粒；将柯里拉京/羧甲基壳聚糖复合物、氧化海藻酸镁溶于去离子水中配制成的混合物，其中，柯里拉京/羧甲基壳聚糖复合物的百分含量为5%；然后加入改性剂丝素蛋白及多巴胺包裹纳米羟基磷灰石，搅拌10min后静置，即可得到改性后的柯里拉京/羧甲基壳聚糖复合物-氧化海藻酸镁水凝胶；其中，柯里拉京/羧甲基壳聚糖复合物与氧化海藻酸镁的质量比为1:1；柯里拉京/羧甲基壳聚糖复合物与丝素蛋白、多巴胺包裹纳米羟基磷灰石的质量比为5:2.5:2。
26.实施例2：一种多重交联的可注射骨修复水凝胶制备方法与实施例1的区别：柯里拉京/羧甲基壳聚糖复合物与氧化海藻酸镁的质量比为1:0.8；柯里拉京/羧甲基壳聚糖复合物与丝素蛋白、多巴胺包裹纳米羟基磷灰石的质量比为5:2:1.5。
27.实施例3：一种多重交联的可注射骨修复水凝胶制备方法与实施例1的区别：柯里拉京/羧甲基壳聚糖复合物与氧化海藻酸镁的质量比为1:0.7；柯里拉京/羧甲基壳聚糖复合物与丝素蛋白、多巴胺包裹纳米羟基磷灰石的质量比为5:3:2.5。
28.实施例4：一种多重交联的可注射骨修复水凝胶制备方法与实施例1的区别：在水凝胶的制备过程中茶黄素与改性剂丝素蛋白、多巴胺包裹纳米羟基磷灰石同时加入，搅拌10min后静置，制得加入茶黄素的水凝胶，其中茶黄素用量为水凝胶质量的5%。
29.实施例5：一种多重交联的可注射骨修复水凝胶制备方法与实施例1的区别：在水凝胶中加入茶黄素，其中茶黄素用量为水凝胶质量的8%。
30.实施例6：一种多重交联的可注射骨修复水凝胶制备方法与实施例1的区别：采用羧甲基壳聚糖替代柯里拉京/羧甲基壳聚糖复合物。
31.实施例7：一种多重交联的可注射骨修复水凝胶制备方法与实施例6的区别：在水凝胶中加入茶黄素，其中茶黄素用量为水凝胶质量的5%。
32.试验例1：水凝胶的性能1. 水凝胶压缩强度和弹性模量的测试
将凝胶样品置于10ml的离心管中，在室温条件下制备成直径10mm、厚度8mm圆柱状水凝胶，然后进行压缩测试，使用试验机mx-0580，速率1mm/min。水凝胶的弹性模量e计算公式如下：e=nh/a
△
h其中，n为应力，pa；h为凝胶未变形前的厚度，m；a为压缩样品的面积，m2；
△
h为样品受压变形的厚度，m。
33.对实施例1~7进行上述测试，结果如图3、4所示。由图3、4可知，实施例4与实施例1的压缩强度与弹性模量相差不大，实施例7的效果与实施例6相当，说明茶黄素的加入对水凝胶的压缩强度和弹性模量无消极影响。实施例1与实施例6相比，弹性模量和压缩强度提升，表明柯里拉京/羧甲基壳聚糖复合物的存在显著提升其压缩性能；且获得的水凝胶弹性模量与松质骨相近，满足大段缺损中松质骨缺损修复需求。
34.2. 扫描电子显微镜形貌观察（sem）为了观察水凝胶的内部微结构，将水凝胶在冻干机上冻干。切割冻干后的样品暴露其横截面，并用导电胶将其固定到电镜台上，经90s喷金，使用冷场发射扫描隧道显微镜（hitachi公司的s-4800）观察，加速电压为15kv。
35.对实施例1制备的水凝胶进行上述测试，结果如图5所示。分析图5可知，通过扫描电镜对冻干后的水凝胶内部微观结构进行观察，水凝胶具有多孔结构，并且孔隙彼此相连，存在相通性，互连通的多孔结构有利于营养物质和氧气的运输，以及代谢物的排除，而且水凝胶孔径适宜，适宜骨长入。
36.3. 溶胀实验测试利用膜具制备统一尺寸的水凝胶，将各组水凝胶浸泡于过量的pbs中。在15min、30min、1h、2h、3h、5h、9h、24h、48h分别对各组水凝胶称量，直到达到溶胀平衡。溶胀率公式如下：sr=（ws-wd）/wd
×
100%其中ws和wd分别是溶胀的水凝胶和未溶胀的水凝胶的重量。
37.对实施例1、实施例4、实施例6进行上述测试，结果如图6所示，由图6分析可知，水凝胶的溶胀率随时间的延长而逐渐升高并最终趋于平缓。改性后的水凝胶相对改性之前溶胀性能有所下降，但仍具备较好的溶胀性能，这在体内能保障缺损部位的营养组分，从而促使周围组织向中间聚集性生长。
38.4. 体外降解测试利用膜具制备成2
×
1cm尺寸水凝胶，将水凝胶浸于pbs中，并放在37℃恒温箱中，间隔5天换液，分别在15天、30天、60天分别测试干燥后水凝胶重量。剩余重量百分比计算公式如下：剩余重量（%）=（wt/w0）
×
100%其中w0和wt分别是水凝胶的初始重量和每个时间水凝胶的重量。
39.对实施例1、实施例4、实施例6进行上述测试，测试结果如图7所示。由图7可知，随着降解时间的延长，水凝胶的降解量均逐渐增加。且水凝胶在体外1个月时间降解了35-50%，而两个月时基本降解了55-70%，说明制备的水凝胶具有良好的生物降解性。
40.5. 光热性能测试
808nm近红外光照射水凝胶，测试水凝胶的光热性能（1000w电流，输出功率734mw，面积1.1304mm2）。
41.对实施例1、实施例4、实施例6、实施例7进行上述测试，结果如图8所示。由图8可知，从体外光热效应可以看出，随着照射时间的增长，水凝胶温度随之升高，说明该水凝胶具有较强的光热转化效率。考虑到细胞和组织对温度的不耐受，故而只照射了2分钟。并且，实施例4与实施例1相差不大，实施例7与实施例6的效果相当，说明茶黄素的加入对水凝胶的光热转化无消极影响；实施例1制备的水凝胶各时间点的温度值要高于实施例6，表明水凝胶中柯里拉京/羧甲基壳聚糖复合物的加入能够进一步提升水凝胶的光热转化性能。
42.6. 水凝胶对成骨细胞增殖和成骨作用检测使用808nm近红外光照射1min水凝胶后，将mc3t3细胞分别在照射后的水凝胶中培养1、3、5、7天后，使用cck-8试剂检测细胞增殖。碱性磷酸酶alp定量检测试剂盒用于在第3，7天检测不同浓度水凝胶的alp表达量。
43.对实施例1、实施例4、实施例6、实施例7进行上述测试，结果如图9和图10所示。由图9、10可知，实施例1制得水凝胶处理后各时间点吸光度值及细胞增殖速率要好于实施例6的，且第3天和第7天alp表达量也多于实施例6的，说明柯里拉京/羧甲基壳聚糖复合物的加入对细胞增殖、成骨细胞诱导骨化具有一定的促进作用；实施例4的效果好于实施例1和实施例6、实施例7的效果好于实施例6，说明水凝胶中茶黄素的加入能够增强其对细胞增殖、成骨细胞诱导骨化的效果，并且在柯里拉京/羧甲基壳聚糖复合物同时存在的条件下，对水凝胶的促细胞增殖和成骨细胞诱导骨化性能增强效果更佳。
44.7. 水凝胶血液相容性检测向edta抗凝管中加入3ml新鲜小鼠血，离心弃上清液。加入等量0.9%生理盐水离心，并重复三次。0.1m pbs（10
×
pbs）重悬红细胞，并稀释50倍，以获得红细胞悬浮液。将900μl红细胞悬浮液加入到提前制备的100μl 25mg/ml的水凝胶中。对照组加入100μl生理盐水。37℃ 60min后离心，取上清100μl于96孔板上，测试在541nm处吸光度值。
45.溶血率=（样品吸光度-生理盐水吸光度）/triton-x100的吸光度对实施例1~7及对照组进行上述测试，结果如图11所示。由图11可知，加入改性剂丝素蛋白及多巴胺包裹纳米羟基磷灰石、茶黄素的水凝胶溶血率与对照组相差均不大，说明实施例1~7制备的水凝胶与血液均具有良好的生物相容性，满足体内植入需求。
46.8. 止血性能分别称取水凝胶样品10mg，放在洁净烧杯中，37℃保温5min。将20μl 0.2mol/l的cacl2溶液加入到100μl抗凝兔血中，然后将其滴加到水凝胶上，加入25ml蒸馏水，摇匀后，静置10min，用紫外分光光度计在545nm处测其吸光度值。
47.对实施例1~7进行上述测试，结果如图12所示。由图12可知实施例1、实施例6止血效果相当，说明柯里拉京/羧甲基壳聚糖复合物的加入，对止血效果没有消极影响。实施例4与实施例1和实施例7相比，吸光度下降明显，实施例7的效果好于实施例6，说明茶黄素的加入，能够有效增强水凝胶的止血性能；且柯里拉京/羧甲基壳聚糖复合物的存在对茶黄素的止血性能具有促进作用。
48.上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
49.以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。