hsa_circ_0005773在防治间充质干细胞衰老及骨关节炎中的应用

1.本发明属于生物医学技术领域，具体涉及hsa_circ_0005773在防治间充质干细胞衰老及骨关节炎中的应用。


背景技术：

2.骨关节炎(osteoarthritis,oa)是一种老年退行性病变，又称骨关节病，最早称增生性关节炎或肥大性关节炎等，多发于中老年人，随着全社会人口老龄化进程加剧，该病的发生率越来越高。骨关节炎好发于负重较大、活动较多的关节，膝关节是骨关节炎最常见的发病部位之一。骨关节炎不仅作为医学问题，也成为社会问题，日益引起人们重视。
3.骨关节炎病变初期症状轻微不易发现，患者往往到了晚期只能选择进行人工膝关节置换，对医疗卫生造成了巨大的负担。近些年来由于抗衰老疗法的兴起以及对于衰老软骨细胞在oa发生发展中的认识，不少学者运用清除衰老细胞的策略来治疗oa。该策略虽然在动物模型上取得良好的疗效，但2020年一项涉及局部注射不同抗衰老药物(ubx0101)治疗骨关节炎的ii期临床试验宣告失败，揭示出进一步筛选其他抗衰老靶点及药物的必要性。
4.现在临床上对骨关节炎的治疗主要是采用保守治疗方案，即关节腔注射软骨保护剂、润滑剂等药物治疗，对晚期关节炎则采用自体、异体骨软骨移植等手术治疗。而且，目前针对骨关节炎治疗的探究主要集中在新软骨保护剂、人工软骨以及抗衰老药物等的开发。但是现有的保守治疗方案不能有效地缓解骨关节炎的进展，而晚期的关节置换术侵入性强，患者预后差，与之相比，关节腔内注射抗衰老药物更能有效缓解骨关节炎的发展，避免发展至晚期只能进行关节置换。因此，筛选治疗骨关节炎的新靶点以及相应的抗衰老药物具有重要的应用前景。


技术实现要素：

5.为了克服上述现有技术的不足，本发明经研究发现，可以可将hsa_circ_0005773为作为治疗间充质干细胞衰老以及骨关节炎的新靶点。
6.本发明是通过以下技术方案来实现的：
7.本发明提供了抑制hsa_circ_0005773的试剂在制备防治和/或治疗间充质干细胞衰老的药物中的应用。
8.本发明还提供了抑制hsa_circ_0005773的试剂在制备防治和/或治疗骨关节炎的药物中的应用。
9.环状rna hsa_circ_0005773是其亲本丝氨酸蛋白酶抑制剂-2(serpine2)基因外显子3、4环化而成的环状rna，在circbase中的编号为hsa_circ_0005773，在ncbi中的序列号为nm_006216.4。本发明经研究发现，hsa_circ_0005773升高能够导致间充质干细胞衰老，对hsa_circ_0005773进行敲减发现，hsa_circ_0005773表达的降低可以有效缓解关节
腔内组织及细胞衰老，有助于缓解小鼠骨关节炎的进展，而间充质干细胞的衰老已被证明与骨关节炎的发生发展息息相关，说明可以可将hsa_circ_0005773为作为治疗间充质干细胞衰老以及骨关节炎的新靶点，并以hsa_circ_0005773为靶点研制缓解间充质干细胞以及治疗骨关节炎的新rna药物。
10.优选地，所述抑制为降低hsa_circ_0005773的表达。
11.优选地，所述抑制hsa_circ_0005773的试剂包括sirna。
12.优选地，所述抑制hsa_circ_0005773的试剂的给药方式包括关节腔内注射。
13.本发明提出了一种关节腔内注射缓解细胞衰老的sirna药物来治疗骨关节炎。与目前临床上现有的疗法相比，本发明从骨关节炎的病因出发，通过缓解细胞衰老来达到治疗骨关节炎的目的，而不仅仅是缓解症状。同时，与现有的通过关节腔内注射慢病毒/腺病毒/腺相关病毒来治疗骨关节炎的方法相比，本发明更加安全有效。此外，rna疗法能够靶向无法下药的靶标，由于本发明涉及的靶标是一种环状rna，无法被现有的小分子和抗体药物所作用。而且rna药物能够被快速生产，只需确定rna的化学结构和进入体内的途径，就可以快速设计和合成基于rna的药物用于临床试验。与dna疗法相比，rna疗法没有明显的遗传毒性作用。最后，基于rna药物的递送系统逐渐成熟，为rna药物的体内使用提供了坚实的基础。
14.进一步地，所述sirna的核苷酸序列如seq id no.1和seq id no.2所示。
15.本发明还提供了一种用于防治和/或治疗间充质干细胞衰老的药物，所述药物以抑制hsa_circ_0005773的试剂为主要活性成分。
16.本发明还提供了一种用于防治和/或治疗骨关节炎的药物，所述药物以抑制hsa_circ_0005773的试剂为主要活性成分。
17.优选地，两种所述药物还包括药物学上可接受的载体。
18.进一步地，所述载体是药物领域中可接受的功能性药用辅料，包括表面活性剂、助悬剂、乳化剂以及一些新型药用高分子材料，如环糊精、壳聚糖、聚乳酸(pla)、聚乙醇酸聚乳酸共聚物(plga)、透明质酸等。
19.优选地，两种所述药物的剂型为临床上可接受的常规剂型。
20.进一步地，本发明对上述药物的剂型没有特殊的限制，可以制成本领域技术人员熟知的注射剂、片剂、胶囊剂、栓剂和粉针剂等。所制备的制剂可以是经口服或胃肠外方式(例如静脉、皮下、腹膜内或局部)给药，如果某些药物在胃部条件下是不稳定的，可将其制备成肠衣片剂。
21.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
22.本发明经研究发现，hsa_circ_0005773升高能够导致间充质干细胞衰老，而间充质干细胞的衰老已被证明与骨关节炎的发生发展息息相关，说明通过抑制hsa_circ_0005773有望用于防治和/或治疗骨关节炎。进一步通过对骨关节炎小鼠进行膝关节腔内注射hsa_circ_0005773sirna对hsa_circ_0005773进行敲减发现，hsa_circ_0005773表达的降低可以有效缓解关节腔内组织及细胞衰老，有助于缓解小鼠骨关节炎的进展。说明可以可将hsa_circ_0005773为作为治疗间充质干细胞衰老以及骨关节炎的新靶点，并以hsa_circ_0005773为靶点研制缓解间充质干细胞以及治疗骨关节炎的新rna药物。
附图说明
23.图1为hsa_circ_0005773影响间充质干细胞衰老进展的实验流程图；
24.图2为充质干细胞的sa-β-gal染色结果；
25.图3为充质干细胞的edu染色结果；
26.图4为充质干细胞的sasps rt-qpcr结果；
27.图5为充质干细胞的细胞周期流式结果；
28.图6为hsa_circ_0005773治疗骨关节炎小鼠模型的实验流程图；
29.图7为番红固绿染色及oarsi评分结果；
30.图8为小鼠ct及骨赘最长径统计结果。
具体实施方式
31.下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
32.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
33.术语解释：circrna：环状rna；sirna：小干扰rna，现有rna疗法中的一种；rna疗法：即基因编辑技术治疗，其广泛意义上是指基于特定rna序列的靶向治疗手段；sasps：细胞衰老相关分泌表型，是细胞衰老标志物之一；sa-β-gal：β-半乳糖苷酶染色，是细胞衰老标志物之一；rt-qpcr：检测rna表达水平的实验。
34.实施例1hsa_circ_0005773对间充质干细胞衰老进展的影响
35.如图1所示，通过hsa_circ_0005773相应的敲减sirna及过表达慢病毒，验证hsa_circ_0005773对间充质干细胞衰老进展的影响：
36.(1)在广州艾基生物技术有限公司合成hsa_circ_0005773sirna(5
’‑3’
(seq id no.1)：guguggaguugguaaaauauudtdt，3
’‑5’
(seq id no.2)：aauauuuuaccaacuccacacdtdt)，在上海和元生物有限公司构建hsa_circ_0005773过表达慢病毒(所用载体为plc5-cir)；
37.(2)分别使用hsa_circ_0005773sirna及过表达慢病毒转染间充质干细胞48小时；间充质干细胞的制备如下：
38.1)招募选取体检合格的健康志愿者进行骨髓采集，采集前对志愿者告知相关风险事宜，并询问确认身体健康状态。
39.2)严格对志愿者穿刺部位髂骨进行消毒，随后进行局麻，采用无菌注射器抽取志愿者的骨髓，骨髓抽取量为20ml(如因个体差异，骨髓抽取量可因志愿者实际情况进行适当减少)。
40.3)在无菌细胞培养室严格按照操作步骤分离培养mscs，将细胞培养至3代后冻存备用(具体培养方法见文献：peng w,li y,huang l.effects and safety of allogenic mesenchymal stem cell intravenous infusion in active ankylosing spondylitis patients who failed nsaids:a 20-week clinical trial.[j].cell transplantation,2014,23(10):1293-303.)，用于后续体外细胞研究工作。
[0041]
(3)分别使用sa-β-gal染色法和edu染色试剂盒检测间充质干细胞的阳性细胞数【positive cells(％)】；使用rt-qpcr仪检测细胞的sasps表达水平(relative expression)；使用流式仪检测细胞周期。其中，sasps表达水平的检测方法为：mscs敲减或过表达hsa_circ_0005773后用rna提取试剂盒(accurate biology)提取总rna，用evo m-mlv rt kit(accurate biology)进行逆转录，使用green premix pro taq hs qpcr kit(accurate biology)进行qpcr定量检测。
[0042]
sa-β-gal即细胞衰老染色，阳性率高表明细胞比较老，阳性率低则反之；edu染色阳性即细胞处于增殖阶段(细胞较年轻)，阳性率高即细胞比较年轻；s与g2细胞多也表明细胞增殖能力较强，细胞较年轻。如图2-5所示，敲减hsa_circ_0005773后间充质干细胞sa-β-gal阳性细胞数下调、edu阳性细胞数上调、sasps表达水平下调、s及g2期细胞比例上调；过表达后则与之相反，证明hsa_circ_0005773能够促进间充质干细胞衰老进展。说明hsa_circ_0005773升高能够导致间充质干细胞衰老，而间充质干细胞的衰老已被证明与骨关节炎的发生发展息息相关。可见，有望以hsa_circ_0005773作为新的靶点用于防治和/或治疗骨关节炎。
[0043]
实施例2hsa_circ_0005773对骨关节炎小鼠模型的治疗效果
[0044]
如图6所示，通过对骨关节炎小鼠进行膝关节腔内注射hsa_circ_0005773sirna对hsa_circ_0005773进行敲减来达到缓解关节腔内组织及细胞衰老的目的，从而缓解小鼠骨关节炎的进展：
[0045]
(1)骨关节炎小鼠模型构建：选取8-10周龄的雄性c57小鼠，打开小鼠右侧膝关节囊内侧，离断内侧副韧带，使内侧半月板失稳，缝合伤口。
[0046]
(2)分组关节腔内注射sirna：骨关节炎小鼠动物模型构建后分为三组，包括假手术组(只打开关节腔不离断内侧副韧带，sham)、nc sirna组(5'-3'：uucuccgaacgugucacgudtdt；3'-5'，acgugacacguucggagaadtdt；dmm nc)和hsa_circ_0005773sirna组(dmm si)。以造模时为第0周，nc sirna组及hsa_circ_0005773sirna组分别关节腔内注射1nmol/10μl的nc sirna及hsa_circ_0005773sirna，每周一次，共持续4周，之后改为每两周一次，至第8周。
[0047]
(3)小鼠关节软骨破坏及骨赘形成检测：在第8周时处死小鼠，取膝关节使用micro ct观察骨赘形成情况【骨赘最长径，osteophyte maximunlength(mm)】；石蜡包埋切片后对切片进行番红固绿染色(sanfrani o and fast green staining)检测软骨破坏程度；对切片进行p21组织化学检测，观察p21在软骨组织中的表达差异(具体检测方法参照“deng l,ren r,liu z,et al.stabilizing heterochromatin by dgcr8 alleviates senescence and osteoarthritis[j].nature communications,2019,10(1).”中的histology and immunohistochemistry部分，所用抗体为p21(abcam,188224))。软骨破坏的oarsi评分(oarsi grade)标准如下：0分：软骨正常无破坏；0.5分：番红固绿染色丢失，但无结构破坏；1分：纤维颤动形成，但无软骨破坏；2分：垂直的裂缝刚到达软骨表层下并伴有表层部分缺失；3分：垂直裂缝到达软骨表面与钙化软骨之间的25％以下；4分：垂直裂缝到达软骨表面与钙化软骨之间的25％-50％；5分：垂直裂缝到达软骨表面与钙化软骨之间的50％-75％；6分：垂直裂缝到达软骨表面与钙化软骨之间75％以上。
[0048]
与nc sirna组相比，hsa_circ_0005773sirna组骨关节炎小鼠关节软骨破坏明显
减轻。oarsi评分明显下降，骨赘数量及体积明显减少，但与假手术组相比，未能达到完全缓解骨关节炎发展的疗效。说明对hsa_circ_0005773进行敲减可以有效缓解关节腔内组织及细胞衰老，有助于缓解小鼠骨关节炎的进展。
[0049]
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。