一种降解DEHP的复合微生物菌剂及其在制备有机肥中的应用

一种降解dehp的复合微生物菌剂及其在制备有机肥中的应用
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种降解dehp的复合微生物菌剂及其在制备有机肥中的应用。


背景技术：

2.邻苯二甲酸二异辛酯(dehp)是一种广泛使用的增塑剂，存在于许多产品中，如玩具、婴儿产品、食品包装袋、化妆品，还有一些医疗产品中如血液储存袋。由于没有与聚合物基质共价结合，dehp会在使用过程中或被丢弃后释放到环境中，因此，dehp在环境中呈现广泛分布，常见于各种水体包括饮用水体、沉积物、土壤、大气、垃圾渗滤液和污泥中等。在农业生产过程中，dehp会随蔬菜大棚、土地覆膜等的使用进入土壤中，从而被植物吸收积累，再通过食物链进入人体内。目前中国农业土壤中的dehp已经达到毫克/千克的级别。此外，dehp是一种典型环境内分泌刺激物，如果在人体体内的蓄积达到一定阈值后，dehp 可对人体内分泌系统的正常功能造成严重干扰，从而对人类的发育、繁殖以及神经、呼吸和免疫功能等产生严重不良影响。通过微生物降解去除dehp是最快且安全有效的，包括细菌、真菌等。从活性污泥中分离的一株红球菌对200mg/l的dehp具有98％以上的降解效果(zhao等science of the total environment 640
–
641(2018)1121
–
1131)，从混合纸浆废料中分离的一株fusarium culmorum在对1000mg/l dehp具有95％的降解效果(ahuactzin-p
é
rez 等science of the total environment 566
–
567(2016)1186
–
1193)。
3.据报道，一些相互没有拮抗作用的细菌和真菌对有机污染物降解会起到协同增效效果 (zhang等chemosphere 273(2021)129666)。本技术中的草酸青霉mem02已报道具有解磷促生和拮抗植物病原真菌禾谷镰刀菌的能力，假单胞菌mb751已报道具有杀灭植物病原根结线虫的能力，特基拉芽孢杆菌据报道具有拮抗多种植物病原真菌的能力。
4.本技术提供的复合微生物菌剂，经拮抗实验筛选出来，可共存。真菌和细菌协同增效作用，既可以解磷促生，又同时能降解土壤中的污染物dehp，达到蔬菜等作物绿色安全种植的目的。且利用微生物降解土壤中的dehp，具有绿色环保、高效快捷等优点，具有促进农业可持续发展的作用。


技术实现要素：

5.为了克服现有技术的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种降解dehp的复合微生物菌剂，所述的复合菌剂兼具溶磷效果和dhep降解效果，同时还有促生作用。
6.本发明的另一个目的在于提供了一种降解dehp的复合微生物菌剂的应用。
7.为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
8.一种降解dehp的复合微生物菌剂，包括草酸青霉(penicillium oxalicum)mem02(保藏编号：cctccno:m 20191002，cn112159761b)，假单胞菌(pseudomonasextremorientalis)mb751(保藏编号：cctcc no:m 2019495，cn110628664a)和特基拉芽孢杆菌(bacillus tequilensis)。
9.以上所述的复合微生物菌剂，所述的草酸青霉(penicillium oxalicum)mem02、假单胞菌(pseudomonas extremorientalis)mb751和特基拉芽孢杆菌(bacillus tequilensis)在复合菌剂中的菌浓度分别为：7.0～9.0
×
108cfu/g，假单胞菌mb751 1.2～2.0
×
109cfu/g，特基拉芽孢杆菌1.0～1.4
×
10
10
cfu/g；
10.以上所述的复合微生物菌剂，优选的，其比值为：1:2:15。
11.以上所述的复合微生物菌剂，优选的，其比值为：1:50:50。
12.所述的特基拉芽孢杆菌来源于商业渠道。
13.一种复合微生物肥的制备方法，包括下述步骤：
14.将草酸青霉mem02，假单胞菌mb751和特基拉芽孢杆菌接种到cf-ppb发酵培养基中，后即得复合微生物有机肥cf-ppb；
15.所述的cf-ppb发酵培养基为：粉碎的园林废弃物30～40份，麦麸8～12份，黄豆粉4～6 份，k2hpo40.4～0.6份，kh2po40.4～0.6份，feso40.004～0.006份，mgso4·
7h2o 0.04～0.06 份，caco30.04～0.06份，水45～55份，灭菌。
16.以上所述的方法中，优选的，所述的草酸青霉mem02是将草酸青霉mem02的菌饼接至蘑菇栽培基质(市购)上获得。
17.所述的假单胞菌mb751和特基拉芽孢杆菌是将这两种菌分别接种于lb液体培养基中培养获得。
18.一种降解dehp的复合微生物菌剂的应用，其应用过程包括利用其制备成微生物有机肥；或是用于降解土壤中的dehp，或是转化土壤中的难溶解无机磷。
19.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
20.1)草酸青霉mem02、假单胞菌mb751和特基拉芽孢杆菌无明显拮抗作用，能够制备成复合菌剂。
21.2)复合菌剂显示出协同解磷效果，较单个菌株解磷活性都要强，其中较草酸青霉mem02，解磷活性提高了21.46％，培养24h解磷活性就达到了384.39
±
37.60mg/l。
22.3)申请人首次发现草酸青霉mem02具有降解dehp的功能，复合菌剂显示出协同降解dehp的效果，较单个菌株降解活性都要强，其中较草酸青霉mem02，对1000mg/ldehp 的降解活性由83.92％提升至93.54％。
23.4)利用本发明的方法制备的复合微生物有机肥cf-ppb中草酸青霉mem02孢子含量8.0
×
10
8 cfu/g，假单胞菌mb751 1.6
×
109cfu/g，特基拉芽孢杆菌1.2
×
10
10
cfu/g。
24.5)本发明提供的复合微生物有机肥cf-ppb可以明显降解番茄盆栽和小白菜盆栽中根际土壤dehp含量，添加量10％时，对40mg/kgdehp降解率达到84.76％。并且，微生物有机肥cf-ppb可以促进无机磷磷矿粉转化为植物容易吸收的可溶性磷酸盐，对番茄和小白菜具有明显的促生作用。
25.6)秀丽隐杆线虫产卵率实验显示本发明提供的复合菌剂降解1000mg/ldehp后产物无环境内分泌毒性，表明复合菌剂具有高效安全降解dehp的能力。
26.7)本发明提供的复合微生物有机肥cf-ppb制备简单，菌株来源安全，作为dehp污染土壤的修复和植物促生的材料，该复合微生物有机肥具有良好的应用前景。
附图说明
27.图1为不同的微生物菌剂对无机磷的降解效果示意图。
28.图2为不同的微生物菌剂对dehp的降解效果示意图。
具体实施方式
29.下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。本发明所用培养基：
30.lb液体培养基：酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠10.0g，蒸馏水950ml，调节ph至 7.0，用蒸馏水定容至1l。121℃灭菌20min。
31.马铃薯葡萄糖琼脂(pda)培养基：马铃薯200g，切成小块煮烂，用八层纱布过滤，加入葡萄糖20g，琼脂15～20g，加入蒸馏水定容至1l，自然ph。115℃灭菌20min。
32.无机磷(pikovskaya)液体培养基：葡萄糖10.0g，ca3(po4)25.0g，(nh4)2so
4 0.5g， nacl 0.2g，mgso4·
7h2o 0.1g，kcl 0.2g，酵母提取物0.5g，mnso4·
h2o 0.002g， feso4·
7h2o 0.002g，ph 7.0-7.4，1000ml蒸馏水。115℃灭菌20min。
33.葡萄糖酵母提取物(gye)培养基：10g葡萄糖，5g酵母提取物，0.6g kh2po4，0.5gmgso4·
7h2o，0.4g k2hpo4，0.25g cuso4·
5h2o，0.05g feso4·
7h2o，0.05g mnso4，0.001 g znso4·
7h2o，1000ml蒸馏水。115℃灭菌20min。
34.cf-ppb发酵培养基配方：粉碎的园林废弃物35份，麦麸10份，黄豆粉5份，k2hpo
4 0.5 份，kh2po
4 0.5份，feso
4 0.005份，mgso4·
7h2o 0.05份，caco
3 0.05份，水50份。121℃灭菌20min。
35.实施例1：
36.草酸青霉mem02、假单胞菌mb751和特基拉芽孢杆菌的对峙实验
37.将草酸青霉mem02的菌饼接至pda平板上，28℃培养5天，用无菌蒸馏水洗下孢子，调节孢子浓度至1.0
×
108cfu/ml。将假单胞菌mb751和特基拉芽孢杆菌分别接种于lb液体培养基中，于28℃条件下过夜活化。将5μl草酸青霉mem02的孢子悬液滴在pda平板中间，5μl的假单胞菌mb751和特基拉芽孢杆菌菌液分别滴在孢子悬液四周，28℃培养 5天。
38.结果显示，草酸青霉mem02、假单胞菌mb751和特基拉芽孢杆菌无明显拮抗作用，能够制备成复合菌剂。
39.实施例2：
40.草酸青霉mem02、假单胞菌mb751、特基拉芽孢杆菌和复合菌剂的解磷效果
41.实验分为5组：
42.草酸青霉mem02组：将草酸青霉mem02孢子悬液(孢子浓度1
×
10^7cfu/ml)接种至无机磷(pikovskaya)液体培养基中，接种量为1％；
43.假单胞菌mb751组：将假单胞菌mb751菌液(有效菌浓度1
×
10^9cfu/ml)接种至无机磷(pikovskaya)液体培养基中，接种量为1％；
44.特基拉芽孢杆菌组：将特基拉芽孢杆菌菌液(有效菌浓度1
×
10^9cfu/ml)接种至无机磷(pikovskaya)液体培养基中，接种量为1％；
45.复合菌剂组(cf-ppb组)：将草酸青霉mem02孢子悬液(孢子浓度1
×
10^7cfu/ml)，假单胞菌mb751菌液(有效菌浓度1
×
10^9cfu/ml)，特基拉芽孢杆菌菌液(有效菌浓度 1
×
mb751为1.6
×
109cfu/g，特基拉芽孢杆菌1.2
×
10
10
cfu/g。
64.实施例5：
65.cf-ppb复合微生物有机肥番茄盆栽实验
66.从湖北荆门蔬菜农田收集土壤，过筛，将dehp溶解于丙酮中，用喷壶均匀喷洒在土壤表面，使土壤dehp含量为50mg/kg。每个盆栽装入7.5kg含dehp的土壤，移栽入幼苗期的番茄。对照组为不加任何菌剂的空白对照。
67.实验组为：
68.1、15-5-20无机肥(施用量0.1wt％)，
69.2、cf-ppb复合微生物有机肥(施用量1.0wt％) 15-5-20无机肥(施用量0.1wt％)，
70.3、cf-ppb复合微生物有机肥(施用量1.0wt％) 15-0-20无机肥(施用量0.1wt％)，
71.4、cf-ppb复合微生物有机肥(施用量1.0wt％) 15-0-20无机肥(添加27％磷矿粉) (施用量0.1wt％)。
72.每组设置3个重复。培养65天后收获，测定植株高度和湿重。收集番茄植物根际附近土壤，使用碳酸氢钠提取-钼锑抗比色法测量土壤可溶磷含量。使用二氯甲烷萃取土壤中的 dehp，高效液相色谱法检测dehp含量。
73.结果显示，施用cf-ppb复合微生物有机肥的实验组中，实验组cf-ppb复合微生物有机肥 15-0-20(添加27％磷矿粉)番茄植株高度高于空白对照38.86％，且高于只添加无机肥料的实验组15-5-20 25.69％，植物湿重高于空白对照134.67％，且高于只添加无机肥料的实验组15-5-20 24.21％，根际土壤可溶磷含量高于空白对照128.26％，且高于只添加无机肥料的实验组15-5-20 11.70％，说明cf-ppb复合微生物可有效地将难溶性无机磷(磷矿粉) 转化为番茄容易吸收的可溶磷，并且促进番茄的生长。施用cf-ppb复合微生物有机肥的实验组，番茄根际土壤dehp含量均有明显下降，其中，实验组cf-ppb复合微生物有机肥 15-0-20(添加27％磷矿粉)下降了47.68％。
74.表1 cf-ppb复合微生物有机肥番茄盆栽实验结果
75.[0076][0077]
实施例6：
[0078]
cf-ppb复合微生物有机肥小白菜盆栽实验
[0079]
从湖北荆门蔬菜农田收集土壤，过筛，将dehp溶解于丙酮中，用喷壶均匀喷洒在土壤表面，使土壤dehp含量为40mg/kg。每个盆栽装入700g含dehp的土壤，移栽入幼苗期的小白菜。对照组为不加任何菌剂的空白对照。
[0080]
实验组为：
[0081]
1、15-5-20无机肥(施用量0.1％)；
[0082]
2、cf-ppb复合微生物有机肥(施用量1.0wt％) 15-0-20无机肥(添加27％磷矿粉) (施用量0.1wt％)；
[0083]
3、cf-ppb复合微生物有机肥(施用量5.0wt％) 15-0-20无机肥(添加27％磷矿粉) (施用量0.1wt％)
[0084]
4、cf-ppb复合微生物有机肥(施用量10.0wt％) 15-0-20无机肥(添加27％磷矿粉) (施用量0.1wt％)。
[0085]
每组设置3个重复。培养30天后收获，测定植株湿重。收集小白菜植物根际附近土壤。使用二氯甲烷萃取土壤中的dehp，高效液相色谱法检测dehp含量。
[0086]
结果表明，施用cf-ppb复合微生物有机肥的实验组，cf-ppb复合微生物有机肥施用量10.0％，高于空白对照175.00％，达到无机肥料15-5-20的效果。施用cf-ppb复合微生物有机肥的实验组，对土壤中dehp有明显降解作用，其中cf-ppb复合微生物有机肥施用量10.0％，降解率达到了84.76％。
[0087]
表2cf-ppb复合微生物有机肥小白菜盆栽实验结果
[0088][0089]
实施例7：
[0090]
cf-ppb复合菌剂降解dehp后产物毒性评价
[0091]
向含有1000mg/l dehp的gye培养基中接种cf-ppb复合菌剂，在28℃条件下振荡培养5d。用与培养基等量的二氯甲烷萃取培养基两次，旋蒸蒸发仪浓缩后，用5ml 0.1％的dmso溶解发酵后产物。设置dehp不同浓度对照组分别为50、100、200mg/l。将大量孕期的秀丽隐杆线虫同步化，分别取20-30头孵化的l1期幼虫于48孔板中，加入不同浓度的染毒剂，20℃条件下染毒48h。将染毒后的线虫单独挑取至48孔板中，每组5头，观察产卵数并计数。实验重复三次。
[0092]
结果表明，随着dehp的浓度增加，秀丽隐杆线虫的产卵率不断下降，cf-ppb复合菌剂降解dehp后降解产物，秀丽隐杆线虫的产卵率无明显影响，因此，cf-ppb可有效降解环境内分泌干扰物dehp，从而有效降低dehp对于秀丽隐杆线虫生殖方面的影响。
[0093]
表3 cf-ppb复合菌剂降解dehp后产物毒性评价结果
[0094][0095]