一种柑橘果实白皮层“蓝变”物质的分离纯化方法

1.本发明涉及一种柑橘果实的有机物质分离纯化方法，尤其涉及一种柑橘果实白皮层“蓝变”物质的分离纯化方法。


背景技术：

2.我国柑橘产量、面积已居世界第一，但是早熟和晚熟柑橘的比例不高，仅占总产量的20％左右。沃柑(渝审柑橘2012002)系“坦普尔”橘橙与“丹西”红橘杂交品种，为翌年1-2月成熟的晚熟柑橘新品种，具有树势强、丰产、易栽培、果实外观靓丽、高糖低酸(可溶性固形物14％-18％，总酸0.5％-0.8％)、成熟后挂树时间长(3-5个月)、耐贮运性好等优点，且较易剥皮，汁多肉脆，富香气，深受果农和消费者欢迎。自2012年广西、云南、重庆等地首批区试点沃柑园投产以来，因其价格高、产量高，果农种植积极性高涨，面积迅速扩张。但是，随着沃柑的陆续投产，广西、云南、四川等地均发现有果实白皮层(海绵层)“蓝变”现象，又称为“褐变”、“蓝褐变”、“霉变”和“内霉”等。“蓝变”不仅影响果实观感，发病严重的果实还会导致风味变差甚至产生异味，严重影响果实的商品性。“蓝变”问题不仅引起种植者担忧，而且消费者还对其食用安全性表示疑虑，甚至恐慌。因此，“蓝变”问题已成为沃柑产业的一大隐忧，事关沃柑产业的健康发展和几十万种植农户的收入。
3.柑橘果实“蓝变”问题由来已久，最早发现于1944年的美国，先后在亚利桑那州、佛罗里达州、加利福尼亚州和得克萨斯州的橙子、橘柚、葡萄柚中观察到；在中国，除了沃柑外，果实“蓝变”问题在千金橘、茂谷柑、温州蜜柑、马水橘、沙糖橘、南丰蜜橘等品种中也有发生。但是，由于“蓝变”物质难以分离纯化，所以致变因素和机理一直难以厘清，生产上也难以防控。


技术实现要素：

4.本发明目的在于针对柑橘“蓝变”问题，提供一种柑橘果实白皮层“蓝变”物质分离纯化的方法。
5.本发明的技术方案如下：
6.本发明提供一种柑橘果实白皮层“蓝变”物质的分离纯化方法，包括以下步骤：
7.s1：将果实白皮层“蓝变”样本用有机溶剂浸泡，所得残渣用盐酸乙醇液提取，将提取液离心，冷冻干燥，得“蓝变”固体物质；
8.s2：将所述“蓝变”固体物质用甲酸甲醇水溶液溶解，点样进行薄层层析，层析液为四氢呋喃水溶液；刮取蓝色层析条带，用甲酸甲醇水溶液溶解得到粗样液；
9.s3：将所述粗样液离心，上清液再次点样进行薄层层析，层析液为乙腈水溶液；刮取蓝色层析条带，用甲酸甲醇水溶液溶出，冷冻干燥后得到纯化的“蓝变”固体物质。
10.其中，所述有机溶剂为丙酮、水、甲醇、乙醇、氯仿和乙酸乙酯中的任意一种。
11.可选的，所述样本用有机溶剂浸泡的时间为18-36h。
12.可选的，所述盐酸乙醇液中，盐酸与乙醇的体积比为1:45-90。
13.可选的，所述残渣用盐酸乙醇液浸泡提取两次，提取的时间独立地为1.5-3h。
14.进一步的，第一次残渣与盐酸乙醇液浸泡的质量体积比为1:10-20，第二次残渣与盐酸乙醇液浸泡的质量体积比为1:5-15，合并两次提取液。
15.可选的，所述甲酸甲醇水溶液为体积分数为0.5％的甲酸水溶液与甲醇按照体积比7:3-9:1-配制而成。
16.可选的，所述薄层层析的层析板为反相键合薄层层析板。
17.可选的，所述薄层层析的层析板为silica gel 60 rp-18 f254s。
18.可选的，所述四氢呋喃水溶液中，水和四氢呋喃的体积比为4:6-2:8。
19.可选的，所述乙腈水溶液中，水和乙腈的体积比为5:5-3:7。
20.本发明的有益效果：
21.本发明首次提供了一种柑橘果实白皮层“蓝变”物质的分离纯化方法，通过将果实白皮层“蓝变”样本用有机溶剂浸泡，盐酸乙醇液提取，经冷冻干燥得到“蓝变”固体物质，利用两次薄层层析得到纯化的“蓝变”固体物质。薄层层析后的样品进行荧光显色，层析条带窄而清晰。本发明对纯化的“蓝变”固体物质进行高效液相色谱分析，在210nm、240nm和570nm的波长下，除去甲醇溶剂峰后，在同一洗脱时间仅有一个单一的吸收峰，表明该“蓝变”物质为纯化物质，其特征吸收峰为570nm。
附图说明
22.图1：实施例1沃柑“蓝变”物质的薄层层析图谱，其中，a为步骤(4)薄层层析后的图；b为步骤(4)薄层层析后的365nm荧光显色图；c为步骤(5)薄层层析后的365nm荧光显色图；a为“蓝变”物质条带。
23.图2：实施例1沃柑“蓝变”物质在210nm、240nm和570nm的高效液相图谱，其中，210nm波长下洗脱时间1.15min处的吸收峰为溶剂吸收峰；210nm、240nm和570nm波长下洗脱时间5.08min处的吸收峰为“蓝变”物质的吸收峰。
具体实施方式
24.本发明提供了一种柑橘果实白皮层“蓝变”物质的分离纯化方法，包括以下步骤：
25.s1：将果实白皮层“蓝变”样本用有机溶剂浸泡，所得残渣用盐酸乙醇液提取，将提取液离心，冷冻干燥，得“蓝变”固体物质；
26.s2：将所述“蓝变”固体物质用甲酸甲醇水溶液溶解，点样进行薄层层析，层析液为四氢呋喃水溶液；刮取蓝色层析条带，用甲酸甲醇水溶液溶解得到粗样液；
27.s3：将所述粗样液离心，上清液再次点样进行薄层层析，层析液为乙腈水溶液；刮取蓝色层析条带，用甲醇溶出，冷冻干燥后得到纯化的“蓝变”固体物质。
28.本发明的果实白皮层“蓝变”样本优选为沃柑果实白皮层“蓝变”鲜样。所述鲜样可选的进行破碎后用有机溶剂浸泡。本发明所述有机溶剂可选的为丙酮、水、甲醇、乙醇、氯仿和乙酸乙酯中的任意一种，其中更优选的为丙酮。丙酮对“蓝变”物质有一定的溶解度，会造成“蓝变”物质的流失，但是相对于水、甲醇、乙醇、氯仿和乙酸乙酯等，它能更好的溶出与“蓝变”物质相似的杂质，以利于后续薄层层析过程中“蓝变”物质的分离纯化。本发明所述鲜样与所述有机溶剂的质量体积比为1:10-20，更优选为1:15。本发明优选样本用有机溶剂
浸泡的时间为18h-36h，更优选为24h。
29.本发明将所得残渣用盐酸乙醇液提取。所述盐酸乙醇液中，盐酸与乙醇的体积比为1:45-90，更优选的为1:60。所述盐酸为浓度为36％-38％的盐酸。本发明优选残渣用盐酸乙醇液浸泡提取，提取次数优选为两次。作为可选的实施方式，第一次残渣与盐酸乙醇液浸泡的质量体积比优选为1:10-20，更优选的为1:15，第二次残渣与盐酸乙醇液浸泡的质量体积比优选为1:5-15，更优选的为1:5。本发明将两次提取液离心后进行合并，或者先将两次提取液合并，然后离心。所述离心的转速优选为8000g-10000g，离心时间优选的为10min-15min。
30.本发明将提取液进行冷冻干燥。作为优选的实施方式，将提取液预先冷冻成坚硬的固体后，再进行真空冷冻干燥。冷冻干燥后得到初提的“蓝变”固体物质。
31.本发明的“蓝变”固体物质用甲酸甲醇水溶液溶解后进行薄层层析。所述甲酸甲醇水溶液为体积分数为0.5％甲酸水溶液与甲醇按照体积比7:3-9:1配制而成，更优选的为0.5％甲酸水溶液与甲醇按照体积比8:2配制而成。用甲酸甲醇水溶液溶解“蓝变”固体物质将更有利于后续层析时蓝色条带的分离，避免出现拖尾现象。
32.本发明所述薄层层析的层析板优选为反相键合薄层层析板，实现“蓝变”物质的有效分离。本发明所述反相键合薄层层析板优选为silica gel 60rp-18f254s，“蓝变”物质条带与杂质带间的分离效果最好，条带也更为清晰。本发明第一次层析所用层析液为四氢呋喃水溶液，“蓝变”物质条带与杂质带间的分离效果好。优选四氢呋喃和水的体积比为4:6-2:8，更优选为7:3。第一次层析完成后，刮取蓝色层析条带，用甲酸甲醇水溶液溶解得到粗样液。
33.本发明将所述粗样液进行离心，所述离心的转速优选为5000g-10000g，离心时间优选的为10min-15min。离心后得到的上清液进行第二次薄层层析，层析液为乙腈水溶液，一方面验证第一次层析分离获得的“蓝变”条带是否是纯物质，另一方面也可进一步纯化“蓝变”物质。优选乙腈和水的体积比为5:5-3:7，更优选为5:5。第二次层析完成后，刮取蓝色层析条带，用甲酸甲醇水溶液溶出，冷冻干燥后得到纯化的“蓝变”固体物质。
34.本发明的冷冻干燥方法可以采用本领域的常规方法，作为优选的，先预先冷冻后再进行真空冷冻干燥。所述的预先冷冻可以在-80℃冷冻48h-72h，也可以用液氮速冻，但是最好用液氮速冻，这样样品在后续的干燥时能更好的保持固体冷冻状态。所述的真空冷冻干燥，最好在充氮条件下进行真空冷冻干燥，以尽量减少“蓝变”物质被氧化。真空冷冻干燥方式采用常规方式进行。
35.本发明的所有步骤优选的在低于30℃的环境温度下进行，以避免“蓝变”物质被氧化。
36.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
37.实施例1
38.(1)称取广西沃柑果实“蓝变”白皮层的鲜样，用丙酮浸泡24h，鲜样：丙酮＝1:15(g:v)。
39.(2)将残渣用盐酸：乙醇＝1:60(v:v)浸泡两次，第一次残渣：盐酸乙醇液＝1:15(g:v)浸泡2h；第二次残渣：盐酸乙醇液＝1:5(g:v)浸泡2h，10000g离心、合并两次提取液。
40.(3)将提取液在-80℃预先冷冻48h成坚硬的固体后，进行真空冷冻干燥。
41.(4)用少量0.5％甲酸水溶液：甲醇(v:v)＝8:2逐步溶解干燥后的固体物质，于silica gel 60 rp-18 f254s反相键合薄层层析板上点样进行薄层层析，层析液为水：四氢呋喃＝3:7(v:v)。
42.(5)刮取蓝色层析条带，用0.5％甲酸甲醇水溶液溶解得到粗样液，10000g离心后，上清液再次于反相键合薄层层析板上点样进行薄层层析，层析液为水：乙腈＝5:5(v:v)。
43.(6)刮取蓝色层析条带，用0.5％甲酸甲醇水溶液溶出，于充氮条件下进行真空冷冻干燥，得到纯化的“蓝变”固体物质。
44.实施例2
45.(1)称取广西沃柑果实“蓝变”白皮层的鲜样，用丙酮浸泡18h，鲜样：丙酮＝1:10(g:v)。
46.(2)将残渣用盐酸：乙醇＝1:45(v:v)浸泡两次，第一次残渣：盐酸乙醇液＝1:10(g:v)浸泡2h；第二次残渣：盐酸乙醇液＝1:10(g:v)浸泡1.5h，10000g离心、合并两次提取液。
47.(3)将提取液用-80℃预先冷冻48h成坚硬的固体后，进行真空冷冻干燥。
48.(4)用少量0.5％甲酸水溶液：甲醇(v:v)＝7:3逐步溶解干燥后的固体物质，于silica gel 60 rp-18 f254s反相键合薄层层析板上点样进行薄层层析，层析液为水：四氢呋喃＝2:8(v:v)。
49.(5)刮取蓝色层析条带，用0.5％甲酸甲醇水溶液溶解得到粗样液，10000g离心后，上清液再次于反相键合薄层层析板上点样进行薄层层析，层析液为水：乙腈＝4:6(v:v)。
50.(6)刮取蓝色层析条带，用0.5％甲酸甲醇水溶液溶出，于充氮条件下进行真空冷冻干燥，得到纯化的“蓝变”固体物质。
51.实施例3
52.(1)称取广西沃柑果实“蓝变”白皮层的鲜样，用丙酮浸泡36h，鲜样：丙酮＝1:20(g:v)。
53.(2)将残渣用盐酸：乙醇＝1:90(v:v)浸泡两次，第一次残渣：盐酸乙醇液＝1:20(g:v)浸泡2h；第二次残渣：盐酸乙醇液＝1:15(g:v)浸泡3h，8000g离心、合并两次提取液。
54.(3)将提取液在-80℃预先冷冻72h成坚硬的固体后，进行真空冷冻干燥。
55.(4)用少量0.5％甲酸水溶液：甲醇(v:v)＝9:1逐步溶解干燥后的固体物质，于silica gel 60 rp-18 f254s反相键合薄层层析板上点样进行薄层层析，层析液为水：四氢呋喃＝4:6(v:v)。
56.(5)刮取蓝色层析条带，用0.5％甲酸甲醇水溶液溶解得到粗样液，5000g离心后，上清液再次于反相键合薄层层析板上点样进行薄层层析，层析液为水：乙腈＝3:7(v:v)。
57.(6)刮取蓝色层析条带，用0.5％甲酸甲醇水溶液溶出，于充氮条件下进行真空冷冻干燥，得到纯化的“蓝变”固体物质。
58.实施例4
59.将实施例1纯化得到的“蓝变”固体物质溶解于0.5
‰
甲酸水溶液中，通过uplc(waters acquity uplc h-class，美国waters公司)检测分离纯化后“蓝色”物质的纯度。
60.色谱条件：acquity uplc beh c18色谱柱(100
×
2.1mm，1.7μm)；流动相a相为乙
腈，b相为0.1％磷酸水溶液，梯度洗脱条件：10％a(0min)～90％a(7min)；流速0.4ml/min；进样量7μl；检测波长210～700nm；柱温30℃。
61.由图2可知，实施例1所分离得到的“蓝色”物质在210nm、240nm和570nm的波长下，除去溶剂峰后，在同一洗脱时间仅有一个单一的吸收峰，表明该“蓝变”物质为纯化物质，其特征吸收峰为570nm。
62.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。