LC-MS/MS方法分离测定利福平及1-甲基-4-亚硝基哌嗪含量的方法与流程

lc-ms/ms方法分离测定利福平及1-甲基-4-亚硝基哌嗪含量的方法
技术领域
1.本发明涉及医药领域，具体涉及一种lc-ms/ms方法分离测定利福平及1-甲基-4-亚硝基哌嗪含量的方法。


背景技术：

2.利福平极其不稳定，含有很多有关物质杂质，这些杂质和利福平均容易降解生产1-甲基-4氨基哌嗪，该杂质在离子源中会进一步氧化降解生产1-甲基-4-亚硝基哌嗪，在实际生产过程中对其杂质，特别是1-甲基-4-亚硝基哌嗪的分离和测定是目前行业类亟需解决的问题。
3.lc-ms/ms方法是将经过第一次质谱检测的离子以某种方式碎裂后再进行质谱检测，已经运用于诸多主药与杂质的分离测定中，但目前还未有lc-ms/ms方法分离测定利福平及1-甲基-4-亚硝基哌嗪含量的报道。现有问题中，1-甲基-4-亚硝基哌嗪会造成基线漂移和假阳性结果；另外，利福平中含有抗氧剂甲醛次硫酸氢钠，该物质含有甲醛次硫酸根，在离子源中会引起阳离子抑制，导致1-甲基-4-亚硝基哌嗪响应降低，因此，目前利用lc-ms/ms法分离测定利福平及1-甲基-4-亚硝基哌嗪含量存在一定的困难。
4.综上，目前亟需一种lc-ms/ms方法分离测定利福平及1-甲基-4-亚硝基哌嗪含量的方法，通过对实验条件的创造性改良，更好的分离和测定出1-甲基-4-亚硝基哌嗪含量。


技术实现要素：

5.本发明为了解决上述问题，提供了一种lc-ms/ms方法分离测定利福平及1-甲基-4-亚硝基哌嗪含量的方法，具体技术方案如下：
6.一种lc-ms/ms方法分离测定利福平及1-甲基-4-亚硝基哌嗪含量的方法，用稀释剂稀释样品，所述方法中采用丙基酰胺键合硅胶为色谱柱填充剂，0.01％甲酸水为流动相a，乙腈为流动相b，按照一定洗脱梯度进行质谱检测，得到色谱图，按内标法计算1-甲基-4-亚硝基哌嗪的含量，所述洗脱梯度为：
[0007][0008]
进一步地，所述流动相流速为1.0ml/min。
[0009]
进一步地，所述方法中色谱柱柱温为35℃。
[0010]
进一步地，所述稀释剂为97％乙腈水溶液。
[0011]
进一步地，所述方法具体步骤如下：
[0012]
(1)利福平加稀释剂稀释得到内标溶液；
[0013]
(2)取供试样品，加入1-甲基-4-亚硝基哌嗪-d4和内标溶液后再加稀释剂稀释，得供试品溶液；
[0014]
(3)稀释剂稀释1-甲基-4-亚硝基哌嗪，得到对照品溶液；
[0015]
(4)分别取对照品溶液与供试品溶液在液相色谱仪中进样，采用串联质谱检测器检测，记录色谱图，按内标法计算1-甲基-4-亚硝基哌嗪的含量。
[0016]
进一步地，所述内标溶液为20ng/ml的1-甲基-4-亚硝基哌嗪-d4溶液；所述供试品溶液为含有2mg/ml利福平和0.5ng/ml的1-甲基-4-亚硝基哌嗪-d4溶液；所述对照品溶液为含有1ng/ml的1-甲基-4-亚硝基哌嗪和0.5ng/ml的1-甲基-4-亚硝基哌嗪-d4溶液。
[0017]
进一步地，步骤(4)之前灵敏度溶液质谱检测中杂质峰信噪比需大于10，所述灵敏度溶液为对照品溶液用稀释剂稀释后的1-甲基-4-亚硝基哌嗪溶液。
[0018]
进一步地，所述灵敏度溶液为含有0.1ng/ml的1-甲基-4-亚硝基哌嗪和0.5ng/ml的1-甲基-4-亚硝基哌嗪-d4溶液。
[0019]
进一步地，步骤(4)采用电喷雾离子源(esi)正离子模式进行质谱检测。
[0020]
进一步地，采用质荷比(m/z)130.1
→
100.1作为检测离子对，质荷比(m/z)134.1
→
104.1作为内标离子对。
[0021]
本发明的有益之处在于：采用lc-msms(三重四极杆质谱)检测利福平及注射用利福平中1-甲基-4-亚硝基哌嗪的方法，并且检测限度达到了0.05ng/ml的极低浓度。
[0022]
通过筛选色谱柱(特殊的agela venusil hilic)，流动相比例、加入0.01％甲酸，调整1-甲基-4-亚硝基哌嗪和杂质保留时间避免共流出，过高的酸浓度会影响灵敏度，不加酸基线不平；流动相梯度排除高浓度利福平的干扰，由于这根特殊的色谱柱平衡时间长，会影响分析时间和造成响应信号的偏离，因此选择了氘代内标排除干扰。
附图说明
[0023]
图1为本发明的1-甲基-4-亚硝基哌嗪浓度的线性方程图。
[0024]
图2为本发明的1-甲基-4-亚硝基哌嗪的一级质谱图。
[0025]
图3为本发明的1-甲基-4-亚硝基哌嗪的二级质谱图。
[0026]
图4为本发明的空白溶剂色谱图。
[0027]
图5为本发明的对照品溶液色谱图。
[0028]
图6为本发明的注射用利福平供试品溶液色谱图。
[0029]
图7为本发明的利福平供试品溶液色谱图。
[0030]
图8为本发明的lod色谱图(0.05ng/ml)。
[0031]
图9为本发明的loq色谱图(0.1ng/ml)。
[0032]
图10为本发明的注射用利福平低浓度准确度溶液(1ng/ml)。
[0033]
图11为本发明的利福平低浓度准确度溶液(0.5ng/ml)。
具体实施方式
[0034]
下面通过实施例和附图，对本发明进行进一步详细说明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的结构思路、使用范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0035]
实施例1
[0036]
(1)实验条件
[0037][0038][0039]
(2)具体操作方法
[0040]
临用新制或存放于2～6℃条件下6小时内使用。取本品(原料药)100mg，精密称定，置10ml量瓶中，加稀释剂(97％乙腈水溶液)溶解并稀释至刻度，摇匀，作为api供试品贮备液。取本品一瓶(制剂)，置于25ml量瓶中，用稀释剂(97％乙腈水溶液)溶解并稀释至刻度，
摇匀，作为制剂供试品贮备液。取1-甲基-4-亚硝基哌嗪-d4适量，用乙腈溶解并用稀释剂稀释制成每1ml约含20ng的溶液，作为内标溶液。取供试品贮备液和内标溶液适量，用稀释剂稀释制成每1ml约含2mg利福平和0.5ng 1-甲基-4-亚硝基哌嗪-d4的溶液，摇匀，作为供试品溶液；取1-甲基-4-亚硝基哌嗪杂质对照品适量，用稀释剂溶解并定量稀释制成每1ml中约含杂质1ng和0.5ng 1-甲基-4-亚硝基哌嗪-d4的溶液，作为对照品溶液，再用稀释剂稀释制成每1ml中约含杂质0.1ng和0.5ng 1-甲基-4-亚硝基哌嗪-d4的溶液，作为灵敏度溶液。照高效液相色谱-质谱法(中国药典2020年版四部通则0512和通则0431)测定，用丙基酰胺键合硅胶为填充剂(agela venusil hilic4.6mm
×
150mm，3μm，或性能相当的色谱柱)；以0.01％甲酸水为流动相a，乙腈为流动相b，梯度洗脱，柱温为35℃，流速为每分钟1.0ml；采用串联四极杆质谱作为检测器，电喷雾离子源(esi)正离子模式下多反应检测(mrm)，用质荷比(m/z)130.1
→
100.1作为检测离子对，质荷比(m/z)134.1
→
104.1作为内标离子对，选用适当的质谱条件，以使灵敏度溶液杂质峰信噪比大于10。取对照品溶液15μl，注入高效液相色谱-质谱联用仪，连续进样6次，杂质峰面积的相对标准偏差应不得过15.0％，取供试品溶液15μl，注入高效液相色谱-质谱联用仪，记录色谱图。按外标法法以峰面积比值计算，供试品溶液中含1-甲基-4-亚硝基哌嗪不得过0.00005％。
[0041]
(3)实验结果
[0042]
1、空白溶剂及样品基质不干扰1-甲基-4-亚硝基哌嗪的测定
[0043]
2、对照品溶液进样重复性良好。
[0044][0045][0046]
3、定量限
[0047]
1-甲基-4-亚硝基哌嗪的定量限浓度约为0.1ng/ml，相当于利福平的0.05ppm的杂质可以定量检出，信噪比大于10。
[0048][0049]
4、检测限
[0050]
1-甲基-4-亚硝基哌嗪的检测限浓度约为0.05ng/ml，相当于利福平的0.025ppm的杂质可以检出，信噪比大于10。
[0051][0052]
5、线性
[0053]
1-甲基-4-亚硝基哌嗪浓度在0.1ng/ml～10ng/ml(0.05ppm～5ppm)范围内线性关系良好，相关系数r大于0.99
[0054][0055]
如图1所示，方程及相关系数：y＝2.14x 0.0188，r＝0.9995。
[0056]
6、api准确度和精密度
[0057]
取本品(api)100mg，精密称定，置10ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，
作为供试品贮备液，平行配制9份，分别取供试品贮备液2ml和内标贮备液iii 0.25ml，再分别加入对照品贮备液iii 0.25ml、0.5ml和0.75ml，各三份，作为准确度低、中和高浓度供试品溶液。
[0058]
精密量取对照品贮备液iii 0.5ml，置10ml量瓶中，加内标贮备液iii 0.25ml，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。api准确度的精密度结果：
[0059][0060][0061]
7、制剂准确度和精密度
[0062]
取本品1瓶(规格：0.6g)，加稀释剂溶解并转移至25ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，平行制备9份样品，精密移取该溶液0.85ml，置10ml量瓶中，再分别加入对照品贮备液iii 0.5ml、1ml和1.5ml，各三份，加入内标贮备液iii 0.25ml，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为准确度低、中和高浓度供试品溶液。
[0063]
精密量取对照品贮备液iii 1ml，置10ml量瓶中，加内标贮备液iii 0.25ml，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
[0064]
制剂准确度和精密度结果：
[0065][0066]
8、溶液稳定性
[0067]
取对照品溶液和供试品溶液分别在进样器放置(控温：6℃)约0、1.5、3、4、16小时进样，计算每个时间点样品峰面积比值的rsd％
[0068][0069][0070]
结论：制剂供试品溶液中1-甲基-4-亚硝基哌嗪略微增大，因此供试品溶液需要临用新配或存放于2～6℃条件下6小时内使用。
[0071]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等均应包含在本发明的保护范围之内。