一种三个基因表达水平的检测试剂在制备卵巢癌样本干性鉴定试剂中的应用

1.本发明涉及医学和生命科学研究和生物制备领域，具体涉及一种检测3个基因表达水平的试剂在制备卵巢癌干细胞干性诊断试剂中的应用。


背景技术：

2.卵巢癌是发生在女性卵巢上的恶性肿瘤，其发病率在女性生殖系统恶性肿瘤中位于第三位，在宫颈癌和子宫内膜癌之后，但卵巢癌的死亡率却超过两者之和，高居妇科癌症首位.卵巢癌干细胞是卵巢癌恶性程度高的主要原因，卵巢癌干细胞指卵巢癌组织内具有干细胞特征和能力的一部分细胞。因此，研究卵巢癌干细胞和开发卵巢癌治疗方法的主要工作。所以，从卵巢癌样本中分离培养卵巢癌干细胞是进行卵巢癌研究的重要环节。另外，卵巢癌干细胞通过改造后可能成为未来的细胞工厂，因此，卵巢癌干细胞的分离提取也可能是未来生物制品生产的重要环节。
3.卵巢癌虽然恶性程度高，但并不是所有卵巢癌样本都能够成功的分离培养卵巢癌干细胞，具有一定的成功率，而该成功率会浪费技术人员的时间、财力、物力。因此，亟需一种检测方法在技术人员操作前鉴定卵巢癌样本的干性，以提高分离培养的成功率。是申请人在研究中发现notch2、cd9、tpo不仅在人类其它干细胞中可作为标志物使用，且与卵巢癌病人的生存成反比，可用于作为卵巢癌样本的干性标志物使用，因此，本发明提供了一种三个基因表达水平的检测试剂在制备卵巢癌样本干性鉴定试剂中的应用，用于提高科研和生产中分离培养卵巢癌干细胞的成功率。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供了一种三个基因表达水平的检测试剂在制备卵巢癌样本干性鉴定试剂中的应用。
5.为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
6.一种三个基因表达水平的检测试剂在制备卵巢癌样本干性鉴定试剂中的应用，所述3个基因为notch2、cd9、tpo。
7.本发明优选的，所述notch2全称为notch receptor 2，在pubmed数据库中的id为4853，在人类染色体中的位置为chromosome 1,nc_000001.11(119911553-120069662)。
8.本发明优选的，所述cd9全称为cd9 molecule，在pubmed数据库中的id为928，在人类染色体中的位置为chromosome 12,nc_000012.12(6199946-6238266)。
9.本发明优选的，所述tpo全称为thyroid peroxidase，在pubmed数据库中的id为7173，在人类染色体中的位置为chromosome 2,nc_000002.12(1374047-1543673)。
10.本发明优选的，所述表达水平指mrna表达量和蛋白表达量。
11.本发明优选的，所述mrna表达量检测试剂所采用的方法包括探针法、qrt-pcr法和/或测序法。
12.更优选的，所述方法为qrt-pcr法，所述qrt-pcr法的检测引物分别如seq id no.1与seq id no.2、seq id no.3与seq id no.4、seq id no.5与seq id no.6。
13.本发明优选的，所述蛋白表达检测试剂所采用的方法包括western blot、免疫组化和/或质谱。
14.本发明优选的，所述卵巢癌样本指原位卵巢癌组织、卵巢癌腹水中的卵巢癌细胞、卵巢癌腹膜上的卵巢癌组织、卵巢癌转移于其它人体部位的卵巢癌组织。
15.本发明优选的，所述卵巢癌样本干性指其分离的卵巢癌原代细胞在体外悬浮培养环境中具有强的成微球能力。
16.本发明优选的，所述卵巢癌样本干性指阳性样本对应的卵巢癌患者生存能力差。
17.更优选的，所述notch2、cd9和tpo三个基因表达水平判断标准为：δct
(notch2-gapdh)
≤7为notch2高表达，δct
(cd9-gapdh)
≤7为cd9高表达，δct
(tpo-gapdh)
≤7为tpo高表达。
18.本发明的有益效果在于：本发明首次公开了一种三个基因表达水平的检测试剂在制备卵巢癌样本干性鉴定试剂中的应用。通过本发明应用可准确鉴定卵巢癌样本干性，使以卵巢癌样本为材料分离培养卵巢癌干细胞的成功率提高。
附图说明
19.为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
20.图1为notch2表达水平与卵巢癌患者生存的相关性分析结果；
21.图2为cd9表达水平与卵巢癌患者生存的相关性分析结果；
22.图3为tpo表达水平与卵巢癌患者生存的相关性分析结果；
23.图4为notch2、cd9、tpo为标志物的阳性和阴性卵巢癌样本分离培养卵巢癌干细胞成功率的比较分析。
具体实施方式
24.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，实施例中未注明具体条件实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。所举实施例不作为对本发明的限定。
25.实施例1、notch2在tcga数据库卵巢癌组织样本中的高表达预示卵巢癌患者低生存率
26.自tcga(the cancer genome atlas)数据库中下载卵巢癌患者mrna、mirna表达数据，从中提取notch2的表达数据和患者随访数据，进行数据清洗和处理后，根据notch2的表达水平将患者分为高表达组和低表达组，通过kaplan-meier方法分析notch2的表达与患者长期生存的相关性，结果如图1所示。结果显示，notch2的高表达预示患者的不良预后
27.实施例2、cd9在tcga数据库卵巢癌组织样本中的高表达预示卵巢癌患者低生存率
28.自tcga(the cancer genome atlas)数据库中下载卵巢癌患者mrna、mirna表达数据，从中提取cd9的表达数据和患者随访数据，进行数据清洗和处理，去除部分混杂因素后，根据cd9的表达水平将患者分为高表达组和低表达组，通过kaplan-meier方法分析notch2
的表达与患者长期生存的相关性，结果如图2所示。结果显示，cd9的高表达与患者的预后差相关
29.实施例3、tpo在tcga数据库卵巢癌组织样本中的高表达预示卵巢癌患者低生存率
30.自tcga(the cancer genome atlas)数据库中下载卵巢癌患者mrna、mirna表达数据，从中提取tpo的表达数据和患者随访数据，进行数据清洗和处理后，根据tpo的表达水平将患者分为高表达组和低表达组，通过kaplan-meier方法分析notch2的表达与患者长期生存的相关性，结果如图3所示，tpo的高表达与患者的预后差相关
31.实施例4、notch2、cd9、tpo为标志物的阳性和阴性卵巢癌样本分离培养卵巢癌干细胞成功率的比较分析
32.从异种移植小鼠模型中获取卵巢癌组织，通过qrt-pcr方法鉴定notch2、cd9、tpo的mrna表达水平，δct
(notch2-gapdh)
≤7为notch2高表达，δct
(cd9-gapdh)
≤7为cd9高表达，δct
(tpo-gapdh)
≤7为tpo高表达，通过培养成功样本数比总培养样本数计算成功率，结果如图4所示，均高表达组培养成功率比均低表达组培养成功率高5倍。表明notch2、cd9、tpo均高表达卵巢癌样本具有更高的干性，因此更容易成功分离到卵巢癌干细胞。
33.rt-pcr检测使用的引物如下：
34.notch2 f：5'-ccttccactgtgagtgtctga-3'(seq id no.1)；
35.notch2 r：5'-aggtagcatcattctggcagg-3'(seq id no.2)；
36.cd9 f：5'-cctgctgttcggatttaacttca-3'(seq id no.3)；
37.cd9 r:5'-tggtctgagagtcgaatcgga-3'(seq id no.4)；
38.tpo f：5'-ggagtcctcgtgtctctagcgt-3'(seq id no.5)；
39.tpo r：5'-ctctgcatcgtggcgtacat-3'(seq id no.6)；
40.gapdh f：5
’‑
ggagcgagatccctccaaaat-3’(seq id no.7)；
41.gapdh r：5
’‑
ggctgttgtcatacttctcatgg-3’(seq id no.8)。
42.以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。