一种六堡茶种苗组织培养方法

1.本发明属于植物繁殖技术领域，尤其涉及一种六堡茶种苗组织培养方法。


背景技术：

2.六堡茶(camellia nitidissima cv.liubaocha)山茶科山茶属常绿灌木或小乔木，原产于我国广西梧州的六堡镇及其周边地区，是中国黑茶代表之一，六堡茶中发酵工艺上可归类于后发酵茶，因其原产于广西梧州市苍梧县六堡镇而得名，以“红、浓、陈、醇”的品质特征为世人称道。其生产历史可追溯到1500年前。主要含74种和80种挥发性香气组分等成分，其中zn、cu、 sr、ni、se含量较高，我国传统食疗中利用六堡茶药食同源产品。
3.目前国内市场上六堡茶原料90％以上来自广西，它以六堡镇核心产区。因此，采用人工繁殖育苗的方法对保护野生六堡茶资源和满足规模化生产的需要显得十分必要。六堡茶树浑身是宝，除了六堡茶的根茎叶药用价值外，六堡茶还是石山区和荒地治理及林业生产的经济价值极高的树种。然而，六堡茶育苗是抑制中国六堡茶产业的瓶颈，因六堡茶属扦插较难生根树种之一，普通扦插较难生根和种子萌发率低等问题限制了其应用推广。
4.目前，中国六堡茶的种植栽培主要是采用种子实生苗进行育苗，由于茶树经常摘芽，结实极少，常规的田间种子萌发率《4％，生长周期长，占地面积大，难以实现高效快速的大规模工业化种植栽培。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于：针对上述存在的问题，为解决优选良种、保持良种性状稳定、繁育高效、规模生产等问题，提供一种六堡茶种苗组织培养方法，本培养方法包括丛生芽诱导培养和不定根诱导培养，并经过数轮继代培养后，芽生长正常，炼苗成活率达到90％以上，可以显著提高六堡茶的种苗存活率；并可以解决现有中国六堡茶种子实生苗不能高效快速的大规模工业化种植栽培的问题。
6.为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
7.一种六堡茶种苗组织培养方法，包括预处理、丛生芽诱导培养、不定根诱导培养、炼苗驯化以及移栽种植；所述组织培养方法包括如下步骤：
8.(1)预处理：将六堡茶的种子、顶芽或腋芽，经过无菌处理后接种在盛放有萌发培养基的试管或培养瓶中进行萌发培养，每试管或培养瓶中接种一颗种子或顶芽或腋芽，然后置于培养室中；
9.(2)丛生芽诱导培养：将萌发培养基中培养得到的萌发小苗转入盛放有丛生芽诱导培养基中进行培养，5-6周后进行扩培继代培养，得到无根苗；
10.(3)不定根诱导培养：将无根苗转入不定根诱导培养基，培养5-7周；
11.(4)炼苗驯化：将不定根诱导培养得到的根长为0.4-1.5cm的种苗移出培养室，半打开瓶盖后，放置遮阳的大棚中5-10d后移栽至泥炭 珍珠岩混合基质中，培养1-5周，待植株发育3-5张功能叶后，将其植入营养杯中放室外苗场继续培养；
12.(5)移栽种植：待团根和二级根系附泥结实后，在春夏季或冬春季种植到茶产区种植，挖坎，种植时去除营养杯，覆土回填，提根后轻压泥土，天旱时浇定根水，后视茶种植区干旱情况决定是否浇水或打开滴灌保水。
13.较佳地，在步骤(1)，所述无菌处理为：用软毛刷醮加入了少量洗洁精的水液轻擦种子或枝条及其腋芽处，用无菌水洗3-4次，在超净工作台中，用体积分数浓度为65-75％的酒精灭菌20-40s，再用无菌水冲洗3-4次，再经质量分数浓度为0.1-0.2％的升汞灭菌10-18min，无菌水冲洗3-5次。
14.较佳地，在步骤(1)，所述萌发培养基为：ms基础培养基 6-ba2.0mg
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l-1
naa 0.2mg
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l-1
蔗糖30g
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l-1
琼脂粉5.3g
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l-1
，ph 5.8-7.0；或所述萌发培养基为ms基础培养基 6-ba 2.0mg
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l-1
ga 5-30mg
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l-1
蔗糖 20g
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l-1
琼脂粉5.3g
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l-1
，ph 5.8-7.0。
15.较佳地，在步骤(2)，所述丛生芽诱导培养基为：ms基础培养基 6-ba1.0-2.5mg
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l-1
naa 0.1-0.5mg
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l-1
tdz 0.1-4mg
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l-1
蔗糖30g
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l-1
琼脂5.3g
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l-1
，ph 5.8-7.0。
16.较佳地，在步骤(3)，所述不定根诱导培养基为：1/2ms基础培养基 6-ba1.0-2.5mg
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l-1
naa 0.1-0.5mg
·
l-1
ibak 0.1-0.2mg
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l-1
蔗糖30g
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l-1
琼脂5.3g
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l-1
，ph 5.8-7.0。
17.较佳地，所述萌发培养的条件为温度23-27℃，光照时间12-14h/d，光照强度1500-20001ux；丛生芽诱导培养的条件为温度23-27℃，光照时间 14-16h/d，光照强度1500-20001ux；不定根诱导培养条件为温度23-27℃，光照时间10-12h/d，光照强度2000-25001ux。
18.较佳地，在步骤(2)，萌发小苗的苗高为2.0-6.0cm，将其剪成10-20mm 长度的一芽带叶茎段后，再转入丛生芽诱导培养基中进行诱导培养。
19.综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
20.(1)本发明以中国六堡茶核心产区的优质六堡茶种子或顶芽或腋芽为外植体，经过培养基的筛选，制成了诱导的专用培养基，成功地建立了中国六堡茶组织培养育苗的全套体系，为中国六堡茶大量组织培养快速繁殖提供了一条可靠的技术和方法。
21.(2)本发明通过采用组织培养方法，繁殖系数达6-7倍，在短期内能提供大量的优质种苗，加快了六堡茶推广应用的速度；经过诱导增殖，大多数六堡茶不定芽叶片肥厚，茎干粗大，经过数轮继代培养后，芽生长正常。
22.(3)本发明与同类方法相比具有很大优势，如扦插育苗虽然比较容易操作，但是枝条扦插繁殖生根困难，成活率低；种子育苗方法中由于六堡茶种子较小，种皮坚硬，常规田间发芽率不足4％，造成种子的大量浪费和造林中六堡茶种苗的缺乏；本发明采用组织培养法繁育种苗，实现高效栽培管理技术，可实现一年种树，第二年见成效，为大规模六堡茶育种提供了快速有效途径，在工厂规模化育苗生产中具有很强的实用意义。
23.(4)本发明的六堡茶组培苗叶片肥厚，茎干粗大，具有变异率低、增殖系数高的优点，炼苗成活率达到90％以上，适用于提供中国六堡茶种植的种苗；本发明通过无性繁育，保持亲本优良特质，成本低，污染小，四季可生产，适合大规模无性育苗。
具体实施方式
24.为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下举出优选实施例，对本发
明进一步详细说明。然而，需要说明的是，说明书中列出的许多细节仅仅是为了使读者对本发明的一个或多个方面有一个透彻的理解，即便没有这些特定的细节也可以实现本发明的这些方面。
25.本发明中：6-ba为6-苄氨基腺嘌呤，naa为α-萘乙酸，ibak为吲哚丁酸钾盐，ga为赤霉素，tdz为n-苯基-n-1,2,3-噻二唑-5-脲。
26.实施例1
27.一种六堡茶种苗组织培养方法，包括如下步骤：
28.(1)预处理：取采来的健康饱满的中国六堡茶顶芽或腋芽材料，用软毛刷醮加入了少量洗洁精的水液轻擦种子或枝条及其腋芽处，自来水冲洗1h，在超净工作台中，体积分数浓度为70％酒精灭菌20s，无菌水冲洗4次，质量分数浓度为0.1％的升汞灭菌18min，无菌水冲洗5次；经表面灭菌处理好的材料接种在盛放有萌发培养基的试管中进行萌发培养，每试管中接种一颗顶芽或腋芽，然后置于培养室中，萌发培养基为：ms基础培养基 6-ba2.0mg
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l-1
naa0.2mg
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l-1
蔗糖30g
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l-1
琼脂粉5.3g
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，ph5.8；在温度25℃，光照时间12h/d，光照强度15001ux条件下培养5周，期间清除污染材料；
29.(2)丛生芽诱导培养：取苗高5.0cm的萌发小苗，剪成15mm长度的带腋芽的茎段，转入丛生芽诱导培养基上进行诱导培养，丛生芽诱导培养基为：ms基础培养基 6-ba1.0mg
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l-1
naa0.3mg
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l-1
tdz0.1mg
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蔗糖30g
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l-1
琼脂5.3g
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l-1
，ph5.8；培养条件为温度25℃，光照时间14h/d，光照强度20001ux；5周后进行扩培继代培养，得到无根苗；
30.(3)不定根诱导培养：将无根苗转入不定根诱导培养基，不定根诱导培养基为：1/2ms基础培养基 6-ba1.0mg
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l-1
naa0.3mg
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l-1
ibak0.2mg
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l-1
蔗糖30g
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l-1
琼脂5.3g
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l-1
，ph5.8；在温度25℃，光照时间10h/d，光照强度20001ux，培养6周；
31.(4)炼苗驯化：将不定根诱导培养得到的根长为1.0cm的种苗移出培养室，半打开瓶盖后，放置遮阳的大棚中8d后移栽至泥炭 珍珠岩混合基质中，在温度20℃，湿度65％，自然光照的条件下培养3周，待植株发育4张功能叶后，将其植入9*12cm的营养杯中放室外苗场继续培养4周，植株成活率可达95％，待植株发育4张功能叶后，将其植入营养杯中放室外苗场继续培养；
32.(5)移栽种植：待团根和二级根系附泥结实后，在春夏季或冬春季种植到茶产区种植，按20*20*15cm挖坎，种植时去除营养杯，覆土回填，提根后轻压泥土，天旱时浇定根水，后视茶种植区干旱情况决定是否浇水或打开滴灌保水。
33.实施例2
34.一种六堡茶种苗组织培养方法，包括如下步骤：
35.(1)预处理：取采来的健康饱满的六堡茶种子材料，去掉外种皮，在超净工作台上，用体积分数浓度为65％的酒精灭菌40s，无菌水冲洗3次，质量分数浓度为0.2％升汞灭菌10min，无菌水冲洗3次；经表面灭菌处理好的材料接种在盛放有萌发培养基的培养瓶中进行萌发培养，每培养瓶中接种一颗种子，然后置于培养室中，萌发培养基为：ms基础培养基 6-ba2.0mg
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l-1
naa0.1mg
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l-1
蔗糖20g
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l-1
琼脂粉5.3g
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l-1
，ph7.0的萌发培养基上，置于培养室中进行暗培养，培养5周，以长出幼叶为萌发标准统计萌芽率；
36.(2)丛生芽诱导培养：取苗高2.0cm的萌发小苗，剪成10mm长度的带腋芽和叶的茎
段，转入丛生芽诱导培养基进行诱导培养，丛生芽诱导培养基为：ms基础培养基 6-ba2.5mg
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naa0.1mg
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tdz4mg
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蔗糖30g
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琼脂5.3g
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，ph7.0；培养条件为温度27℃，光照时间16h/d，光照强度15001ux，6周后进行扩培继代培养，得到无根苗；
37.(3)不定根诱导培养：将无根苗转入不定根诱导培养基，不定根诱导培养基为：1/2ms基础培养基 6-ba2.5mg
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naa0.1mg
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ibak0.2mg
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活性炭0.5g/l 蔗糖30g
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琼脂5.3g
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，ph7.0；在温度27℃，光照时间12h/d，光照强度25001ux，培养7周；
38.(4)炼苗驯化：将不定根诱导培养得到的根长为0.4cm的种苗移出培养室，半打开瓶盖后，放置遮阳的大棚中10d后移栽至泥炭 珍珠岩混合基质中，在温度16℃，湿度60％，自然光照的条件下培养5周，植株成活率可达92％；待植株发育3张功能叶后，将其植入营养杯中放室外苗场继续培养；
39.(5)移栽种植：待团根和二级根系附泥结实后，在春夏季或冬春季种植到茶产区种植，按20*20*15cm挖坎，种植时去除营养杯，覆土回填，提根后轻压泥土，天旱时浇定根水，后视茶种植区干旱情况决定是否浇水或打开滴灌保水。
40.实施例3
41.一种六堡茶种苗组织培养方法，包括如下步骤：
42.(1)预处理：取采来的健康饱满的中国六堡茶顶芽或腋芽材料，用软毛刷醮加入了少量洗洁精的水液轻擦枝条及其腋芽处，自来水冲洗1.5h，在超净工作台中，体积分数浓度为75％的酒精灭菌30s，无菌水冲洗4次，质量分数浓度为0.2％的升汞灭菌8min，无菌水冲洗5次；经表面灭菌处理好的材料接种在盛放有萌发培养基的试管中进行萌发培养，每试管中接种一颗顶芽
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或腋芽，然后置于培养室中，萌发培养基为：ms基础培养基 6-ba2.0mg
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naa0.2mg
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蔗糖30g
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l-1
琼脂粉5.3g
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，ph5.8；在温度27℃，光照时间16h/d，光照强度20001ux条件下培养5周，期间清除污染材料；
43.(2)丛生芽诱导培养：取苗高6.0cm的萌发小苗，剪成20mm长度的带腋芽的茎段，转入丛生芽诱导培养基上进行诱导培养，丛生芽诱导培养基为：ms基础培养基 6-ba1.0mg
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naa0.2mg
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tdz0.1mg
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蔗糖30g
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l-1
琼脂5.3g
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，ph7.0；培养条件为温度27℃，光照时间16h/d，光照强度15001ux；5周后进行扩培继代培养，得到无根苗；
44.(3)不定根诱导培养：将无根苗转入不定根诱导培养基，不定根诱导培养基为：1/2ms基础培养基 6-ba1.0mg
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naa0.2mg
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ibak0.2mg
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l-1
蔗糖30g
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l-1
琼脂5.3g/l，ph5.8；在温度25℃，光照时间10h/d，光照强度20001ux，培养6周；
45.(4)炼苗驯化：将不定根诱导培养得到的根长为1.5cm的种苗移出培养室，半打开瓶盖后，放置遮阳的大棚中10d后移栽至泥炭 珍珠岩混合基质中，在温度25℃，湿度70％，自然光照的条件下培养5周，植株成活率可达93％；待植株发育5张功能叶后，将其植入10*12cm的营养杯中放室外苗场继续培养。
46.(5)移栽种植：待团根和二级根系附泥结实后，在春夏季或冬春季种植到茶产区种植，按20*20*15cm规格挖坎，种植时去除营养杯，覆土回填，提根后轻压泥土，天旱时浇定根水，后视茶种植区干旱情况决定是否浇水或打开滴灌保水。
47.实施例4
48.本实施例其他工艺参数与实施例1保持一致，不同之处在于：萌发培养基为：ms基础培养基 6-ba 2.0mg
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ga 5mg
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蔗糖30g
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琼脂粉 5.3g
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l-1
，ph 5.8。
49.本实施例炼苗驯化后，植株成活率可达92％。
50.实施例5
51.本实施例其他工艺参数与实施例1保持一致，不同之处在于：萌发培养基为：ms基础培养基 6-ba 2.0mg
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l-1
ga 30mg
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l-1
蔗糖30g
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l-1
琼脂粉5.3g
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，ph 7.0。
52.本实施例炼苗驯化后，植株成活率可达90％。
53.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。