生物标志物在制备用于诊断、辅助诊断或预测多囊卵巢综合征的产品应用的制作方法

1.本发明涉及生物检测领域，尤其涉及一种生物标志物在制备用于诊断、辅助诊断或预测多囊卵巢综合征的的试剂盒、试纸、芯片或检测仪器中的应用、用于诊断、辅助诊断或预测多囊卵巢综合征的试剂盒及用于预测或评估患有多囊卵巢综合征的检测系统。


背景技术：

2.多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome，pcos)是一种生育年龄妇女常见的复杂内分泌及代谢异常疾病，患有该疾病的女性表现为受孕困难。我国将近5～10％的育龄女性患有多囊卵巢综合征，且患病率呈逐年增加趋势。然而，目前pcos的发病机制仍不清楚，一直缺乏病因学治疗手段。已知，pcos人群普遍较为肥胖，且伴随高胰岛素、高血糖及肥胖等症状，体内存在慢性炎症。因此，开展此研究的目的是：明确健康人群与pcos人群的肠道微生态差异，筛选出生物标志物作为诊断pcos疾病的辅助方法。


技术实现要素：

3.技术问题
4.有鉴于此，本发明提供一种生物标志物在制备用于诊断、辅助诊断或预测多囊卵巢综合征的的试剂盒、试纸、芯片或检测仪器中的应用、用于诊断、辅助诊断或预测多囊卵巢综合征的试剂盒及用于预测或评估患有多囊卵巢综合征的检测系统。
5.本发明通过检测受试体生物样本中存在的生物标志物的表达水平，可以结合临床指标，诊断或辅助诊断受试体多囊卵巢综合征。
6.解决方案
7.为解决以上技术问题，本发明提供如下技术方案：
8.一方面，本发明提供一种生物标志物在制备用于诊断、辅助诊断或预测多囊卵巢综合征的试剂盒、试纸、芯片或检测仪器中的应用，其特征在于，所述生物标志物包括6-羟基烟酸和哌可酸。
9.进一步地，所述生物标志物还包括n-乙酰腐胺、植物鞘氨醇、3-甲氧基-4-羟基苯乙醛、8-异前列烷、n-甲基酪胺和5-s-甲基-5-硫代肌苷中的一种或几种。
10.进一步地，所述生物标志物还包括硫酸脱氢表雄酮和硫酸雌酮中的一种或两种。
11.进一步地，所述生物标志物的检测样本为粪便样本。
12.另一方面，提供一种用于诊断、辅助诊断或预测多囊卵巢综合征的试剂盒，包括定量检测生物标志物表达水平的检测试剂，所述生物标志物包括6-羟基烟酸和哌可酸。
13.进一步地，所述生物标志物还包括n-乙酰腐胺、植物鞘氨醇、3-甲氧基-4-羟基苯乙醛、8-异前列烷、n-甲基酪胺和5-s-甲基-5-硫代肌苷中的一种或几种；
14.和/或，所述生物标志物还包括硫酸脱氢表雄酮和硫酸雌酮中的一种或两种。
15.进一步地，所述检测试剂用于粪便样本的检测；可选地，检测试剂包括2-氯苯丙氨
酸-甲醇溶液，可选地，检测试剂包括4ppm的2-氯苯丙氨酸-甲醇溶液。
16.所述试剂盒的使用方法为利用液谱-质谱仪对受试者粪便悬浮液中的生物标志物水平进行相对定量检测。
17.在一种实施方案中，本发明生物标志物指受试体生物样本中存在的代谢物成分，受试体可以是人类或哺乳动物。生物样本可选自来源于受试体的粪便或粪便悬浮液。优选的，所述生物样本为粪便悬浮液。
18.再一方面，提供一种用于预测或评估患有多囊卵巢综合征的检测系统，所述系统包括生物标志物的相对含量检测系统和分析系统；
19.所述生物标志物包括6-羟基烟酸和哌可酸；
20.所述分析系统包括logist回归模型。
21.进一步地，所述生物标志物还包括n-乙酰腐胺、植物鞘氨醇、3-甲氧基-4-羟基苯乙醛、8-异前列烷、n-甲基酪胺和5-s-甲基-5-硫代肌苷中的一种或几种。
22.进一步地，所述生物标志物还包括硫酸脱氢表雄酮和硫酸雌酮中的一种或两种。
23.进一步地，生物标志物的检测样本为粪便样本。
24.进一步地，所述分析系统用于以检测的生物标志物相对含量为输入变量并输出预测值以评估患多囊卵巢综合征的概率。
25.还一方面，提供一种调节肠道生物标志物表达量的制剂在改善多囊卵巢综合征肠道微生态的产品中的应用，所述制剂为多囊卵巢综合征患者服用制剂后粪便标志物发生变化的制剂，可选地，所述粪便标志物变化包括：粪便内6-羟基烟酸的含量降低，粪便内哌可酸的含量提高。
26.可选地，所述粪便标志物变化包括：服用制剂后降低多囊卵巢综合征患者粪便内的如下生物标志物的含量：硫酸脱氢表雄酮、n-乙酰腐胺、硫酸雌酮、植物鞘氨醇、棕榈酸、3-甲氧基-4-羟基苯基乙二醇醛和5-s-甲基-5-硫代肌苷；
27.可选地，所述粪便标志物变化包括：服用制剂后提高多囊卵巢综合征患者粪便内的如下生物标志物的含量：8-异前列烷和n-甲基酪胺。
28.有益效果
29.本发明所述的生物标志物具有用于制备诊断或检测受试体多囊卵巢综合征的试剂盒的用途，所述试剂盒的使用方法包括，可通过测试受试体粪便或粪便悬浮液中代谢物的水平，任选地结合临床指标，诊断或检测受试体多囊卵巢综合征。
30.上述说明仅为本发明技术方案的概述，为了能够更清楚地了解本发明的技术手段并可依据说明书的内容予以实施，同时为了使本发明的上述和其他目的、技术特征以及优点更加易懂，以下列举一个或多个优选实施例，并配合附图详细说明如下。
附图说明
31.一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定，附图中具有相同参考数字标号的元件表示为类似的元件，除非有特别申明，附图中的图不构成比例限制。
32.图1是本发明的lc-ms检测流程；
33.图2是本发明的pcos组和对照组con女性粪便的非靶向代谢组opls-da图；
34.图3是本发明的pcos组和对照组con女性粪便的非靶向代谢组opls-da的置换检验图。
具体实施方式
35.以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
36.实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如教科书和实验指南中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
37.实施例1
38.1.研究对象及样本采集
39.(1)纳入标准：
40.在排除其他高雄激素血症和(或)排卵功能障碍(库欣综合征，21-羟化酶缺乏症，甲状腺疾病，雄激素分泌性肿瘤，先天性肾上腺增生和高催乳素血症)的病因后，对pcos进行诊断。pcos的诊断标准：根据2003年鹿特丹标准，至少满足以下标准中的两项：
①
稀发排卵/无排卵；
②
有高雄激素的临床表现和(或)高雄激素生化指标；
③
卵巢多囊改变：超声提示一侧或者双侧卵巢有≥12个直径为2～9mm的卵泡，和(或)卵巢体积≥10ml。所有pcos患者均为首次就诊患者，未接受过pcos相关治疗。对照组来月经周期规律、卵巢形态和激素水平均正常的女性。
41.(2)排除标准：
42.排除在过去一年内母乳喂养或怀孕或在过去3个月内服用过药物的妇女。近1个月服用抗生素、益生菌或益生元、规律吸烟、饮酒、精神类疾病不能正确回答问题或不愿进行问卷调查者不纳入本研究；减肥手术史；不能依从膳食推荐；乳糖不耐受；牛奶蛋白过敏。
43.(3)粪便样本采集：
44.排空膀胱后，才可以采集便样，防止尿便混合。
①
在便盆底部垫一些干净的卫生纸；
②
排便后，拧开便管，用便勺取粪便中段内部，2个蚕豆大小的粪便至便管内，装3管，拧好管盖，放到试管架上；
③
将剩余便样倾倒至便池内，将一次性便盆和尿杯放至指定垃圾袋内；
④
将所有粪便样本，交收集样本处，登记。
45.2.液相色谱-质谱联合检测样本非靶向代谢组
46.(1)主要仪器与试剂，如表1、2、3。
47.表1代谢组学检测主要试剂
48.[0049][0050]
表2代谢物提取仪器及设备
[0051][0052]
表3代谢组学检测仪器lc-ms
[0053][0054]
(2)检测方法：
[0055]
1)代谢物提取：a.精确称量样本100mg(
±
1％)于2ml ep管中，准确加入0.6ml 4ppm 2-氯苯丙氨酸-甲醇溶液(-20℃)配制，涡旋振荡30s；b.加入100mg玻璃珠，放入高通量组织研磨仪中，60hz研磨90s；c.室温超声10min；12000rpm 4℃离心10min，取上清液300μl过0.22μm膜过滤，过滤液加入到检测瓶中；d.自每个待测样本各取20μl混合成qc样本(qc：quality control，用来校正混合样品分析结果的偏差以及由于分析仪器自身原因所造成的失误)；e.用剩余待测样本进行lc-ms检测。
[0056]
2)上机检测:
[0057]
a.色谱条件
[0058]
仪器采用thermo ultimate 3000，使用acquityhss t3 1.8μm(2.1
×
150mm)色谱柱，自动进样器温度设为8℃，以0.25ml/min的流速，40℃的柱温，进样2μl进行梯度洗脱，流动相为正离子0.1％甲酸水(d)-0.1％甲酸乙腈(c)；负离子5mm甲酸铵水(b)-乙腈(a)。梯度洗脱程序为0～1min，2％a/c；1～9min，2％～50％a/c；9～12min，50％～98％a/c；12～13.5min，98％a/c；13.5～14min，98％～2％a/c；14～20min，2％c-正模式(14～17min，2％a-负模式)。
[0059]
b.质谱条件
[0060]
仪器使用thermo q exactive focus，电喷雾离子源(esi)，正负离子电离模式，正离子喷雾电压为3.50kv，负离子喷雾电压为2.50kv，鞘气30arb，辅助气10arb。毛细管温度325℃，以分辨率70 000进行全扫描，扫描范围81～1 000，并采用hcd进行二级裂解，碰撞电压为30ev，同时采用动态排除去除无必要的ms/ms信息。
[0061]
3)lc-ms检测进样顺序，如图1所示。
[0062]
3.筛选可用于pcos诊断的生物标记物
[0063]
3.1入组志愿者的基础临床数据，如表4。
[0064]
表4入组女性的基础临床数据表
[0065][0066]
n表示每组的入组志愿者人数。
[0067]
3.2 lc-ms确定pcos中显著差异的标记物
[0068]
bmi指数在18.5～23.9范围内的pcos患者和健康女性的粪便进行非靶代谢组检测，筛选差异代谢物，如pca图(图2)所示，nor_pcos和nor_con组两组女性显著分离，说明两组有显著差异。
[0069]
通过多元统计分析方法筛选与pcos发生密切相关的代谢物。正交偏最小二乘判别分析(opls-da)是一种新型多元统计方法，由johan tryggde等人于2002年首次提出，opls-da最大的特点是可以滤除自变量中与分类变量无关的数据变异，使分类信息主要集中在一个主成分中，从而使模型变得简单和易于解释，提高了模型的解析能力和有效性。我们利用opls-da方法建立了代谢物与pcos疾病分组关系之间的模型，通过得分图可以看出该模型可以将pcos和对照组很好的区分开(图2)，为了验证opls-da图是否存在过拟合，通过置换检验图(图3)进行了模型验证评判，模型验证结果显示其预测能力较好(模型验证评判标准为，满足以下任意一个可以认为没有发生过拟合：(1)所有q2点均低于最右的原始q2点；(2)q2点的回归线在纵坐标的交叉点小于等于0)。结合模型系数和vip值分析，取主成分与代谢物的相关系数》0.5(即vip》1)为显著自变量的标准，筛选与pcos发病密切相关的一组代谢标记物(图2)。
[0070]
具体的差异显著代谢物如表5所示，发现nor_pcos组粪便内比对照组nor_con显著高的代谢物有：硫酸脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone sulfate)、n-乙酰腐胺(n-acetylputrescine)、硫酸雌酮(estrone sulfate)、植物鞘氨醇(phytosphingosine)、棕榈酸(palmitic acid)、6-羟基烟酸(6-hydroxynicotinic acid)、3-甲氧基-4-羟基苯乙醛(3-methoxy-4-hydroxyphenyl glycolaldehyde)和5-s-甲基-5-硫代肌苷(5-s-methyl-5-thioinosine)，发现nor_pcos组粪便内比对照组nor_con显著降低的代谢物有：8-异前列烷(8-isoprostane)、n-甲基酪胺(n-methyltyramine)、和哌可酸(pipecolic acid)。
[0071]
表5 pcos组和对照组女性粪便差异代谢物
[0072]
[0073][0074]
1&2.nor_con和nor_pcos两组的差异代谢物平均值都是基于非靶向代谢组测得的相对表达量。
[0075]
3.3建立基于非靶向代谢组差异标记物的pcos发生的预测模型
[0076]
我们选择表4中pcos组与con组差异显著且丰度较高的差异标记物，纳入logist回归，分析方法选择进入，基于这组差异代谢物指标计算受试者发生pcos的预测概率。logist回归分析模型显著的综合检验p＜0.001,表示该模型总体有意义；hosmer and lemeshow test(检验模型的拟合优度)p＝0.808(＞0.05)，表明当前数据中的信息已被充分提取，模型拟合优度较高。表5分析结果列出了纳入模型的非靶向代谢组中差异代谢物及其参数。
[0077][0078][0079]
表6基于粪便差异代谢物的pcos发生的logist回归分析
[0080]
根据上述回归结果可以写出每个受试者根据这2种差异代谢物水平预测pcos是否发生的危险得分logit(p):
[0081]
logit(p)＝17.663 5.59*6-羟基烟酸level-6.345*哌可酸level
[0082]
并可以按照以下公式(i)计算得到每一个受试者发生pcos的预测概率：
[0083]
[0084]
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。针对上述示例性实施方案所做的任何简单修改、等同变化与修饰，都应落入本发明的保护范围。