红龙果胚珠萃取物用于制备抑制胶原蛋白醣化的组合物的用途的制作方法

红龙果胚珠萃取物用于制备抑制胶原蛋白醣化的组合物的用途
1.本技术为申请人根据母案申请(申请号：201910008320.4，发明名称：红龙果胚珠萃取物用于制备推迟皮肤老化的组合物的用途)所提出的分案申请。
技术领域
2.本发明是关于一种植物萃取物的用途，特别是关于一种红龙果胚珠萃取物用于制备抑制胶原蛋白醣化的组合物的用途。


背景技术：

3.胶原蛋白是哺乳动物体内含量最多的蛋白质，在人体内约占总蛋白质的三分之一，广泛存在于人体的皮肤、软骨、角膜、血管壁、内脏器官等。其主要存在于结缔组织的细胞外间质中，能提供结缔组织所需的力学支撑与强度。人体内的胶原蛋白由于多胜肽组成的差异可分为不同类型，其中，与皮肤构造最相关的是第一型、第三型、与第四型胶原蛋白。真皮层中含有纤维状的第一型与第三型胶原蛋白，上皮组织下方的基底膜中非纤维状的含有第四型胶原蛋白。目前研究指出，个体老化及环境不利因素(例如紫外光照射)皆会导致皮肤纤维母细胞生成胶原蛋白的能力降低。此外，醣化作用(glycation)亦是破坏皮肤中胶原蛋白的主要原因之一。当胶原蛋白损失的速度大于其生成的速度，皮肤便会产生皱纹、松弛等现象。
4.醣化作用是指在无酵素的情况下，糖分子附加至蛋白质或脂质的缓慢化学反应，其最终生成醣化终产物(advanced glycated end products，ages)。醣化作用会影响胶原蛋白聚集形成纤维，而且醣化的胶原蛋白纤维变得僵硬而易脆。此外，醣化终产物累积于皮肤内细胞外间质会干扰周围细胞的增生、分化、移动、或基因表现，甚至会促进可分解胶原蛋白与弹力蛋白(elastin)的基质金属蛋白酶生成以及可引起发炎反应的细胞因子分泌。这些因素最终促成皮肤老化。
5.因此，预防或减缓皮肤老化的方法之一即是补充胶原蛋白或提升细胞的胶原蛋白生成能力。同时，抑制胶原蛋白醣化能确保胶原蛋白纤维的弹性，不仅让皮肤保持紧致，更可预防因为醣化蛋白质累积而衍生的疾病，例如血管硬化。目前市售的胶原蛋白产品主要以直接补充胶原蛋白为要求，然而，胶原蛋白的分子量大，涂抹方式几乎无法使胶原蛋白穿透皮肤的角质层到达其所作用的真皮层；若是透过注射直接补充胶原蛋白，虽可立即减少皮肤的细纹，但注射至入体内的胶原蛋白易被体内的酵素分解，需定期的施打，过程繁复且成本高，而注射胶原蛋白可能产生的免疫排斥反应更是一大风险。若是以食用富含胶原蛋白的食品来补充胶原蛋白，由于蛋白质进入肠胃道后被消化为小分子多肽或胺基酸，身体固然会利用这些胺基酸合成蛋白质，但不限于胶原蛋白，因此，以食用方法补充胶原蛋白的效果有限。
6.有鉴于此，开发一种既提升皮肤纤维母细胞的胶原蛋白生成能力又抑制胶原蛋白醣化的新颖组合物，实有其必要。


技术实现要素：

7.缘此，本发明的一目的在提供一种红龙果(hylocereusundatus)胚珠萃取物用于制备推迟皮肤老化的组合物的用途，其中该红龙果胚珠萃取物是以一溶剂萃取一红龙果胚珠而获得。
8.在本发明的一实施例中，该溶剂与该红龙果胚珠的重量比范围为10：1至3：5，且该萃取是在50℃至100℃进行。
9.在本发明的一实施例中，该溶剂为水，且该红龙果胚珠萃取物的浓度为0.5mg/ml至8mg/ml。
10.在本发明的一实施例中，该红龙果胚珠萃取物促进胶原蛋白生成。在另一实施例中，该红龙果胚珠萃取物促进皮肤纤维母细胞增生。
11.在本发明的一实施例中，该红龙果胚珠萃取物抑制胶原蛋白醣化。
12.本发明红龙果胚珠萃取物不仅红龙果胚珠萃取物不仅能透过促进皮肤纤维母细胞的增生而提升胶原蛋白分泌，亦能减少胶原蛋白醣化终产物生成。鉴于胶原蛋白是支撑皮肤结构的主要蛋白质之一，其稳定含量可维持皮肤的年轻状态，并且醣化胶原蛋白的累积与皮肤老化息息相关，前述红龙果胚珠萃取物促进胶原蛋白增生及抑制胶原蛋白醣化的作用使其具备推迟皮肤老化的效果。因此，本发明提供红龙果胚珠萃取物用于制备推迟皮肤老化的组合物的用途。该组合物可为粉末、颗粒、溶液、胶体或膏体，且可制成食品、饮品、医药品、或营养补充剂，藉由口服、皮肤涂抹等方式给予一个体。
13.以下将配合图式进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例是用以阐明本发明的发明特点及应用，而非以限定本发明的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。
附图说明
14.图1显示人类皮肤纤维母细胞在有或无本发明一实施例的红龙果胚珠萃取物处理后的胶原蛋白相对产量；
15.图2显示人类皮肤纤维母细胞在有或无本发明一实施例的红龙果胚珠萃取物处理后的增生情形；图中亦显示皮肤纤维母细胞以20％胎牛血清处理后的增生情形以作为正控制组；
16.图3显示本发明一实施例的红龙果胚珠萃取物对胶原蛋白醣化终产物生成的作用效果。
具体实施方式
17.本发明提供一种红龙果胚珠萃取物用于制备推迟皮肤老化的组合物的用途。本发明的红龙果胚珠萃取物是以一溶剂萃取一红龙果胚珠而获得，其中，该溶剂较佳为水，该溶剂与该红龙果胚珠的重量比为10：1至3：5，且该萃取是在50℃至100℃进行。该红龙果胚珠萃取物的施用经下列实施例证实能促进人类皮肤纤维母细胞的增生及胶原蛋白分泌。此外，该红龙果胚珠萃取物尚可抑制胶原蛋白醣化。
18.定义
19.本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在20％的范围内，较佳为在10％的范围内，最佳为在5％的范围内。
20.本文中所谓「皮肤老化」是包括皮肤外观随年龄增长而出现皱纹、细纹、松弛、凹陷等变化，及皮肤内部的纤维母细胞生长缓慢、胶原蛋白含量下降、醣化胶原蛋白增加等变化。前述变化可藉由一般习知技术予以评估。
21.材料与方法
22.材料
23.含有earle’s平衡盐溶液(gibco earle’s balanced salt solution，hbss)的eagle’s最低基本培养基(gibco eagle’s minimum essential medium，mem)、胎牛血清(fetal bovine serum，fbs)、丙酮酸钠、青霉素/链霉素(penicillin/streptomycin)、及磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline，pbs)是购自thermo fischer scientific公司。
24.细胞培养
25.以下实施例使用购自美国典型培养物保存中心(american type culture collection，atcc)的人类皮肤纤维母细胞(human skin fibroblast)ccd-966sk(atcc crl-1881)进行实验。该细胞是在37℃、5％二氧化碳的条件下培养于添加10％fbs、1mm丙酮酸钠、及1％青霉素/链霉素的mem培养基，以下称细胞培养基。
26.胶原蛋白分泌试验
27.皮肤纤维母细胞的胶原蛋白分泌量是利用可溶性胶原蛋白分析套组(sircol soluble collagen assay kit；bicolor)依据厂商使用说明而测定，其步骤简述如下。自经过指定处理的细胞培养物中收取1000μl细胞培养基与200μl胶原蛋白分离/浓缩试剂混合，于4℃下放置隔夜后，以12000rpm的转速离心该混合液10分钟，移除上清液约1000μl。其次，将余下沉淀与1000μlsircol染剂混合30分钟，再以12000rpm的转速离心该染剂混合液10分钟以形成胶原蛋白沉淀物。待移除上清液，先以750μl酸性盐溶液清洗该胶原蛋白沉淀物并移除多余液体，添加250μl碱性试剂以溶解该胶原蛋白沉淀物，再使用elisa读盘机(enzyme-linked immunosorbent assay reader；biotek)测量该胶原蛋白溶液在波长555nm的吸光值。对照水溶性胶原蛋白标准品的标准曲线，可计算得待测细胞培养基中的胶原蛋白含量。统计分析是使用excel软件的学生t检定予以判定。
28.细胞增生试验
29.皮肤纤维母细胞的增生是利用细胞增殖酵素连结免疫吸附分析套组(cell proliferation elisa,brdu；sigma-aldrich)依据厂商使用说明而测定，其步骤简述如下。将溴化脱氧尿苷(bromodeoxyuridine，brdu)染液(100μm)依10μl/孔加入96孔盘中经过指定处理的细胞，在37℃培养24小时后，移除上清液并添加200μl/孔的固定溶液，于室温反应30分钟。其后，以pbs溶液清洗细胞，使用100μl/孔的过氧化酶(peroxidase)结合抗brdu抗体溶液于室温处理细胞90分钟，再移除该抗体溶液及以清洗溶液润洗细胞三次。最终，将100μl/孔的受质溶液加入该96孔盘并在室温下反应5至30分钟，再添加25μl/孔的1m硫酸及震荡(300rpm)反应约1分钟，即可测量各孔于450nm的吸光值。统计分析是使用excel软件的学生t检定予以判定。
30.实施例1
31.红龙果胚珠萃取物的制备
32.红龙果又名火龙果(dragon fruit)或仙人掌果，是仙人掌科三角柱属植物，原产于中美洲，现于中国台湾广为种植。该植物果实富含膳食纤维而可刺激肠胃蠕动，可用于预防便秘。
33.为取得红龙果胚珠萃取物，在本发明一实施例中，首先自未授粉的红龙果花的子房中收集胚珠，将其洗净及利用均质机磨碎。其后，以水为溶剂对红龙果胚珠均质物进行萃取，其中，该溶剂与该红龙果胚珠均质物的重量比为10：1至3：5。萃取温度为介于50℃至100℃，较佳为80℃至90℃。以下实施例2-4中的红龙果胚珠萃取物皆为以含1％柠檬酸的水溶液萃取，萃取时间为0.5至3小时。
34.经上述萃取步骤所得红龙果胚珠萃取物冷却至室温后，可以400目(mesh)的滤网过滤，以移除残余固体物。该过滤后的红龙果胚珠萃取物可进一步在45℃至60℃进行减压浓缩而获得一浓缩产物。为获得固态的红龙果胚珠萃取物，可将前述经浓缩的红龙果胚珠萃取物以例如冷冻干燥、喷雾干燥等干燥方式去除溶剂，因此获得粉末状红龙果胚珠萃取物。
35.实施例2
36.红龙果胚珠萃取物促进胶原蛋白分泌
37.为检验本发明的红龙果胚珠萃取物对皮肤细胞的胶原蛋白产量的影响，本实施例以胶原蛋白分泌试验测定人类皮肤纤维母细胞ccd-966sk经过实施例1所述红龙果胚珠萃取物处理后，其胶原蛋白产出量的变化。简言之，将ccd-966sk细胞依2
×
104细胞/孔接种于24孔盘，各孔含有500μl细胞培养基。在37℃培养细胞24小时后，移除细胞培养基并以pbs溶液清洗细胞。其次，将500μl的8mg/ml红龙果胚珠萃取物与500μl不含fbs的细胞培养基添加至各孔细胞(实验组)，并以500μl不含fbs的细胞培养基处理细胞以作为空白对照组。前述二组细胞在37℃下培养48小时后，收集细胞培养基及测定其中胶原蛋白含量。
38.图1显示前述二组皮肤纤维母细胞的胶原蛋白相对产量；图中***表示与空白对照组相比，p＜0.001。依据图1，相较于空白对照组，施予红龙果胚珠萃取物明显提升细胞培养基中的胶原蛋白含量达约68％。此结果显示红龙果胚珠萃取物具有促进皮肤纤维母细胞生产胶原蛋白的功效。
39.实施例3
40.红龙果胚珠萃取物促进皮肤纤维母细胞增生
41.为测试本发明的红龙果胚珠萃取物是否促进人类皮肤纤维母细胞增生，本实施例利用细胞增生试验测定ccd-966sk细胞经过实施例1所述红龙果胚珠萃取物处理后的增生状况。简言之，将ccd-966sk细胞依3000个细胞/孔接种于96孔盘，各孔含有添加0.1mm非必需胺基酸、1.5g/l碳酸氢钠、1mm丙酮酸钠、及10％fbs的mem培养基。在37℃培养细胞2小时后，移除培养基，并以下列方式处理各孔细胞：(a)施以100μl不含fbs的前述培养基(空白对照组)；(b)施以100μl含20％fbs的前述培养基(正控制组)；或(c)施以100μl不含fbs、但添加1mg/ml红龙果胚珠萃取物的前述培养基(实验组)。其后，各组细胞依细胞增生试验的步骤于37℃培养24小时，并以elisa分析测定于450nm的吸光值，该数值随细胞增生而增加。
42.图2显示前述各组皮肤纤维母细胞相对于空白对照组的吸光值倍数；图中
**
表示与空白对照组相比，p《0.01。依据图2，相较于空白对照组，正控制组(20％fbs)表现出约4倍的
细胞增生，而单纯红龙果胚珠萃取物的处理更显著促进细胞增生达约4.8倍。此结果说明红龙果胚珠萃取物促进胶原蛋白分泌的效果是部分源于其可促进皮肤纤维母细胞增生。
43.实施例4
44.红龙果胚珠萃取物抑制胶原蛋白醣化
45.为探讨本发明的红龙果胚珠萃取物对胶原蛋白醣化的影响，以抗醣化分析测定0.5mg红龙果胚珠萃取物对猪胶原蛋白醣化反应的抑制作用。在本发明一实施例中，利用200mm磷酸盐缓冲溶液(ph 7.4)配制60mg/ml胶原蛋白溶液(含0.06％迭氮化钠)及1.5m果糖溶液。为进行胶原蛋白醣化反应，将0.2ml胶原蛋白溶液与0.2ml果糖溶液的混合物与0.2ml的0.5mg/ml红龙果胚珠萃取物样品或去离子水(空白对照组)均匀混合，于50℃反应24小时，再添加胺基胍(aminoguanidine，ag，购自sigma)以中止醣化反应。使用分光荧光计(spectrofluorometer，flx 800，biotek)测量前述反应液(0.1ml)在0小时与24小时的荧光强度(激发波长360nm，侦测波长460nm)，并依下列公式计算胶原蛋白醣化终产物生成率：[(样品荧光强度
24小时-样品荧光强度
0小时
)/(空白对照组荧光强度
24小时-空白对照组荧光强度
0小时
)]
×
100％。
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图3显示红龙果胚珠萃取物对胶原蛋白醣化终产物生成的作用效果。依据该图，相较于空白对照组，红龙果胚珠萃取物的处理显著降低胶原蛋白醣化终产物生成量达约43％，显示红龙果胚珠萃取物可抑制体内胶原蛋白的醣化反应，进而推迟肌肤老化。
[0047]
综上所述，红龙果胚珠萃取物不仅能透过促进皮肤纤维母细胞的增生而提升胶原蛋白分泌，亦能减少胶原蛋白醣化终产物生成。因此，红龙果胚珠萃取物有助于抑制皮肤老化而能用于制备推迟皮肤老化的组合物。该组合物可为粉末、颗粒、溶液、胶体或膏体，且可制成食品、饮品、医药品、或营养补充剂，藉由口服、皮肤涂抹等方式给予一个体。