潜阳育阴颗粒的质量检测方法与流程

1.本发明属于中药检测技术领域，具体地说，涉及一种潜阳育阴颗粒的质量检测方法。


背景技术：

2.潜阳育阴颗粒是江苏省中医院的特色院内制剂，由方祝元教授继承名老中医唐蜀华先生的学术经验，结合多年临床实践，依据清肝补肾，化瘀通络法，精选鬼针草、制首乌、酒萸肉、玄参、川牛膝、泽泻六味药物制成。潜阳育阴颗粒成分复杂，依靠单一检测方法，无法全面客观的检测其质量。为了充分控制其临床有效性与安全性，维护患者利益，很有必要在现有技术的基础之上，研究设计出能全面准确检测潜阳育阴颗粒的有效成分，继而确保其质量的检测方法。中药指纹图谱作为一种综合的、可量化的鉴定手段，能够反映中药多成分特点，同时对其中多种有效成分定量检测，可用于评价中药制剂质量的真实性、有效性和稳定性，全面准确的控制中药复方制剂的质量。
3.建立潜阳育阴颗粒hplc指纹图谱检测方法，指认主要成分，可以为全面评价和控制潜阳育阴颗粒质量及临床应用提供参考依据。


技术实现要素：

4.发明目的：本发明的目的是为了克服现有技术的不足，开发一种关于潜阳育阴颗粒的质量检测方法，通过本发明的方法可以客观，正确，有效的控制潜阳育阴颗粒的质量，对确保其安全性与有效性，保证临床质量具有重要的指导意义。
5.技术方案：为实现以上目的，本发明采用的技术方案为：
6.一种潜阳育阴颗粒的质量检测方法，它包括以下步骤：
7.步骤1：潜阳育阴颗粒供试品溶液的制备
8.取不同批次的潜阳育阴颗粒研磨成粉，过三号筛，精密称定，加入甲醇溶液，超声提取，静置沉淀，取上清液过0.22μm滤膜即得；
9.步骤2：混合对照品溶液的制备
10.分别取莫诺苷、马钱苷、阿魏酸、金丝桃苷、二苯乙烯苷、杯苋甾酮、哈巴俄苷、肉桂酸、大黄素对照品适量加甲醇溶解，得到混合对照品溶液，0.22μm滤膜滤过即得；
11.步骤3、分别吸取步骤1的供试品溶液和步骤2的混合对照品溶液，注入uplc得到供试品溶液的色谱图和混合对照品溶液的色谱图；
12.步骤4、将步骤3中获得的潜阳育阴颗粒供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004a；选择不同批次潜阳育阴颗粒供试品溶液的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用中位数计算法生成潜阳育阴颗粒供试品溶液的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；并根据混合对照品溶液色谱图的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分。
13.作为优选方案，以上所述的一种潜阳育阴颗粒的质量检测方法，步骤1、潜阳育阴
颗粒供试品溶液的制备方法为：
14.取不同批次的潜阳育阴颗粒研磨成粉，过三号筛，精密称定约1g粉末，加入70％的甲醇溶液，超声提取20min，静置沉淀，取上清液过0.22μm滤膜即得；
15.作为优选方案，以上所述的一种潜阳育阴颗粒的质量检测方法，步骤2、混合对照品溶液的制备方法为：
16.分别取莫诺苷、马钱苷、阿魏酸、金丝桃苷、二苯乙烯苷、杯苋甾酮、哈巴俄苷、肉桂酸、大黄素对照品适量加甲醇溶解，得到质量浓度为0.267mg
·
ml-1
、0.105mg
·
ml-1
、0.361mg
·
ml-1
、0.221mg
·
ml-1
、0.249mg
·
ml-1
、0.040mg
·
ml-1
、0.092mg
·
ml-1
、0.228mg
·
ml-1
、0.339mg
·
ml-1
的混合对照品溶液，0.22μm滤膜滤过即得。
17.作为优选方案，以上所述的一种潜阳育阴颗粒的质量检测方法，步骤3和步骤4色谱条件为：watersacquity uplc beh c18色谱柱，100mm
×
3.0mm，1.7μm，流动相为乙腈为a相，含0.1％磷酸的水溶液为b相，梯度洗脱，检测波长250nm；流速0.3ml
·
min-1
；柱温35℃。
18.作为优选方案，以上所述的一种潜阳育阴颗粒的质量检测方法，步骤3和4的梯度洗脱程序如下：
19.时间/mina/％b/％03975892113070208020219552395523.539730397。
20.作为优选方案，以上所述的一种潜阳育阴颗粒的质量检测方法，步骤4对照指纹图谱共有18个共有峰，其中以7号马钱苷峰作为参照峰，经过与混合对照品溶液色谱图对比分析，1号峰来源于泽泻，3号峰来源于制首乌、酒萸肉，2～8、10号峰主要来源于酒萸肉，9、11号峰主要来源于鬼针草，12号峰来源于制首乌，13、14号峰主要来源于川牛膝，15号峰来源于泽泻，16、17号峰来源于玄参，18号峰来源于制首乌、泽泻；其中6号峰为莫诺苷、7号峰为马钱苷、11号峰为金丝桃苷、12号峰为二苯乙烯苷、13号峰为阿魏酸、14号峰为杯苋甾酮、16号峰为哈巴俄苷、17号峰为肉桂酸、18号峰为大黄素。
21.本发明提供的潜阳育阴颗粒的质量检测方法，还包括含量测定方法，具体包括以下步骤：
22.步骤1：潜阳育阴颗粒供试品溶液的制备
23.取不同批次的潜阳育阴颗粒研磨成粉，过三号筛，精密称定，加入甲醇溶液，超声提取，静置沉淀，取上清液过0.22μm滤膜即得；
24.步骤2：混合对照品溶液的制备
25.精密称取哈巴苷、哈巴俄苷、莫诺苷、马钱苷、阿魏酸、杯苋甾酮适量，加甲醇制成混合对照品溶液；另精密称取二苯乙烯苷适量，加甲醇制成二苯乙烯苷对照品溶液；
26.步骤3：标准曲线的建立
27.取步骤2混合对照品溶液和二苯乙烯苷对照品溶液，加甲醇依次稀释得到5个不同浓度的混合对照品溶液，然后注入uplc，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标建立标准曲线方程；
28.步骤4：取步骤1的供试品溶液注入uplc，将色谱图的峰面积代入步骤3的标准曲线方程，计算供试品中对应的有效成分含量。
29.作为优选方案，以上所述的一种潜阳育阴颗粒的质量检测方法，所述的步骤3和步骤4的色谱条件为：
30.以watersacquityuplc beh c18，规格100mm
×
3.0mm，1.7μm为色谱柱，流动相为：乙腈为a相-含0.1％磷酸的水为b相，梯度洗脱；检测波长：阿魏酸和二苯乙烯苷为320nm、莫诺苷、杯苋甾酮、马钱苷为250nm、哈巴苷、哈巴俄苷为202nm；流速为0.3ml/min；柱温为35℃；进样量为2μl；所述的梯度洗脱程序为：
31.时间/mina/％b/％059515158530307040802042955。
32.作为优选，以上步骤2：混合对照品溶液的制备方法为：
33.精密称取哈巴苷、哈巴俄苷、莫诺苷、马钱苷、阿魏酸、杯苋甾酮适量，加甲醇制成浓度分别为0.0194、0.0114、0.0174、0.0134、0.0005、0.0052mg/ml的混合对照品溶液；另精密称取二苯乙烯苷适量，加甲醇制成浓度为0.2730mg/ml的对照品溶液。
34.以上潜阳育阴颗粒的制备方法为：取鬼针草810g，制何首乌180g，酒萸肉108g，玄参180g，泽泻180g，川牛膝270g，加水煎煮2次，滤过，合并滤液，减压浓缩至适量，离心，上清液浓缩至60℃相对密度为1.20的清膏，加入药学上可接受的辅料，即得。
35.指纹图谱检测条件的优化
36.1、检测波长的选择
37.对混合对照品进行全波长扫描，发现目标成分在250nm左右均有较好吸收，峰形较好。选择250nm为检测波长。
38.2、流动相的选择
39.本研究考察不同流动相(乙腈-0.2％磷酸水溶液，甲醇-0.1％磷酸水溶液，乙腈-0.1％甲酸水溶液)，结果采用乙腈-0.1％磷酸水系统，分离效果及峰形良好，基线较为平稳，故选择其作为流动相。
40.3、柱温及流速的选择
41.本研究考察不同的柱温(25，30，35，40℃)以及流速(0.2、0.3、0.4ml
·
min-1
)对色谱峰的影响，结果表明在250nm波长下，柱温为35℃、流速为0.3ml
·
min-1
，所得的色谱峰峰形、数目及分离度等均表现良好。
42.本发明的有益效果是：
43.(1)本发明通过大量实验筛选出最佳的供试品制备方法与对照品的制备方法和最佳的色谱分析条件，建立的潜阳育阴颗粒指纹图谱和含量测定方法，不但能有效地表征潜阳育阴颗粒的质量，有利于全面监控潜阳育阴颗粒药物的质量。
44.(2)本发明方法具有稳定性好、精密度高、准确度高、重现性好等的优点。可以全面、客观准确的评价和控制潜阳育阴颗粒的质量。
附图说明
45.图1为混合对照品溶液的uplc的色谱图。
46.图2为15批潜阳育阴颗粒的uplc叠加指纹图谱和对照指纹图谱。
具体实施方式
47.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
48.以下实施例药品及试剂：
49.潜阳育阴颗粒(江苏省中医院，批号2101001、2101003、2102033、2103009、2103013、2104015、2104017、2104018、2105019、2105020、2106023、2107027、2107028、2108030、2109032，编号为s1～s15)均来自于江苏省中医院院内制剂，规格10g/袋。
50.哈巴苷对照品(批号111729-201707，纯度96.8％)购自中国食品药品检定研究院；哈巴俄苷对照品(批号must-18041504，纯度＞98％)、马钱苷对照品(批号must-17080704，纯度＞98％)、二苯乙烯苷对照品(批号must-18051611，纯度＞98％)、金丝桃苷对照品(批号must-17101605，纯度＞98％)均购自成都曼思特生物科技有限公司；大黄素对照品(批号200148-200904，纯度＞98％)、杯苋甾酮对照品(批号200471-200903，纯度91％)、莫诺苷对照品(批号200514-200704，纯度92.5％)、阿魏酸对照品(批号200418-170912，纯度97.3％)均购自泰州丹鼎生物科技有限公司；肉桂酸对照品(批号b21082，纯度＞98％)购自上海源叶生物科技有限公司；甲醇、乙腈、磷酸为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。
51.实施例1
52.1、一种潜阳育阴颗粒的质量检测方法，它包括以下步骤：
53.步骤1：供试品溶液配的制备
54.取以上s1～s15共15批次的潜阳育阴颗粒研磨成粉，过三号筛，精密称定约1g粉末，加入70％的甲醇溶液，超声提取20min(功率100w，频率40khz)，放冷，再次称重，70％甲醇补足重量，摇匀后静置，取上清液过0.22μm滤膜即得。
55.步骤2：混合对照品溶液的制备
56.分别取莫诺苷、马钱苷、阿魏酸、金丝桃苷、二苯乙烯苷、杯苋甾酮、哈巴俄苷、肉桂酸、大黄素对照品适量加甲醇溶解，得到质量浓度为0.267mg
·
ml-1
、0.105mg
·
ml-1
、0.361mg
·
ml-1
、0.221mg
·
ml-1
、0.249mg
·
ml-1
、0.040mg
·
ml-1
、0.092mg
·
ml-1
、0.228mg
·
ml-1
、0.339mg
·
ml-1
的混合对照品溶液，0.22μm滤膜滤过即得。
57.步骤3、分别吸取步骤1的供试品溶液和步骤2的混合对照品溶液，注入uplc得到供试品溶液的色谱图和混合对照品溶液的色谱图；
58.步骤4、将步骤3中获得的潜阳育阴颗粒供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012a；选择不同批次潜阳育阴颗粒供试品溶液的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成潜阳育阴颗粒供试品溶液的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；并根据混合对照品溶液色谱图的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分。潜阳育阴颗粒在250nm下共有18个共有峰，其中以7号马钱苷峰作为参照峰，经过对比分析1号峰来源于泽泻，3号峰来源于制首乌、酒萸肉，2～8、10号峰主要来源于酒萸肉，9、11号峰主要来源于鬼针草，12号峰来源于制首乌，13、14号峰主要来源于川牛膝，15号峰来源于泽泻，16、17号峰来源于玄参，18号峰来源于制首乌、泽泻；其中6号峰为莫诺苷、7号峰为马钱苷、11号峰为金丝桃苷、12号峰为二苯乙烯苷、13号峰为阿魏酸、14号峰为杯苋甾酮、16号峰为哈巴俄苷、17号峰为肉桂酸、18号峰为大黄素。
59.以上步骤3的色谱条件为：
60.waters acquityuplc beh c18色谱柱(100mm
×
3.0mm，1.7μm)，流动相为乙腈(a)-水(b，含0.1％磷酸)，梯度洗脱程序见表1，检测波长250nm；流速0.3ml
·
min-1；柱温35℃。
61.表1梯度洗脱程序
62.时间/mina/％b/％03975892113070208020219552395523.539730397
63.步骤5：相似度评价
64.将15批次的潜阳育阴颗粒供试品溶液按进样，记录色谱图，导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012a版)进行分析，结果表明15批潜阳育阴颗粒样品相似度均＞0.96，如表2相似度良好。
65.表2 15批潜阳育阴颗粒相似度
[0066][0067]
2、指纹图谱方法学考察：
[0068]
(1)精密度试验
[0069]
取潜阳育阴颗粒样品(编号s1)，按以上步骤1方法制备供试品溶液，再按以上色谱条件连续进样测定6次，以马钱苷为参照，计算得各共有峰相对保留时间的rsd均小于0.50％(n＝6)，相对峰面积的rsd均小于4.60％(n＝6)，表明该方法的精密度良好。
[0070]
(2)稳定性试验
[0071]
取潜阳育阴颗粒样品(编号s1)，按以上步骤1方法制备供试品溶液，分别在室温下放置0、2、4、8、12、24h，按以上色谱条件进样测定，以马钱苷为参照，计算得各共有峰相对峰面积的rsd均小于4.70％(n＝6)，相对保留时间的rsd均小于2.90％(n＝6)，表明供试品溶液在室温下24h内稳定性良好。
[0072]
(3)重复性试验
[0073]
取潜阳育阴颗粒样品(编号s1)6份，按以上步骤1方法制备供试品溶液，再按以上色谱条件进样测定，以马钱苷为参照，计算得各共有峰相对峰面积的rsd均小于1.90％(n＝6)，相对保留时间的rsd均小于0.09％(n＝6)，表明该方法重复性良好。
[0074]
实施例2
[0075]
1、潜阳育阴颗粒的质量检测方法，还包括含量测定方法，具体包括以下步骤：
[0076]
步骤1：潜阳育阴颗粒供试品溶液的制备
[0077]
取以上s1～s15共15批次的潜阳育阴颗粒研磨成粉，过三号筛，精密称定约1g粉末，加入70％的甲醇溶液，超声提取20min(功率100w，频率40khz)，放冷，再次称重，70％甲醇补足重量，摇匀后静置，取上清液过0.22μm滤膜即得。
[0078]
步骤2：混合对照品溶液的制备
[0079]
精密称取哈巴苷、哈巴俄苷、莫诺苷、马钱苷、阿魏酸、杯苋甾酮适量，加甲醇制成浓度分别为0.0194mg/ml、0.0114mg/ml、0.0174mg/ml、0.0134mg/ml、0.0005mg/ml、0.0052mg/ml的混合对照品溶液；另精密称取二苯乙烯苷适量，加甲醇制成浓度为0.2730mg/ml的对照品溶液。
[0080]
步骤3：标准曲线的建立
[0081]
取步骤2混合对照品溶液加甲醇依次稀释0倍、2倍、5倍、10倍、20倍，得到5个不同
浓度的混合对照品溶液，取步骤2二苯乙烯苷对照品溶液加甲醇制成5个浓度分别为273.000、μg/ml182.000μg/ml、91.000μg/ml、36.400μg/ml、18.200μg/ml的对照品溶液，然后注入uplc，以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标建立标准曲线方程如下表3：
[0082]
表3回归方程、相关系数(r)及线性范围
[0083]
待测成分回归方程r线性范围/(μg/ml)哈巴苷y＝6
×
109x－222.990.99970.968～19.360哈巴俄苷y＝1
×
10
10
x 208.620.99990.568～11.350莫诺苷y＝1
×
10
10
x 10980.99990.870～17.390马钱苷y＝7
×
109x 360.270.99970.670～13.400二苯乙烯苷y＝8
×
10
12
x－1149040.999018.200～273.000阿魏酸y＝3
×
10
10
x－1.95230.99980.025～0.490杯苋甾酮y＝8
×
109x 62.9440.99990.259～5.187
[0084]
该步骤3的色谱条件为：
[0085]
以watersacquityuplc beh c18，规格100mm
×
3.0mm，1.7μm为色谱柱，流动相为：乙腈为a相-含0.1％磷酸的水为b相，梯度洗脱；检测波长：阿魏酸和二苯乙烯苷为320nm、莫诺苷、杯苋甾酮、马钱苷为250nm、哈巴苷、哈巴俄苷为202nm；流速为0.3ml/min；柱温为35℃；进样量为2μl；所述的梯度洗脱程序为：
[0086]
时间/mina/％b/％059515158530307040802042955
[0087]
步骤4：取步骤1的各供试品溶液注入uplc，将色谱图的峰面积代入步骤3的标准曲线方程，计算供试品中对应的有效成分含量如表4所示。
[0088]
表4 15批样品中7个成分含量(mg/g)
[0089][0090]
2、含量测定的方法学考察：
[0091]
1、精密度实验
[0092]
取以上同一混合对照品溶液进样6次，记录峰面积。哈巴苷、莫诺苷、马钱苷、二苯乙烯苷、哈巴俄苷、阿魏酸、杯苋甾酮的rsd分别为3.70％、3.36％、3.67％、2.85％、3.88％、3.05％、3.22％，表明仪器精密度良好。
[0093]
2、稳定性实验
[0094]
按照以上方法制备潜阳育阴颗粒供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24h进样，记录峰面积。哈巴苷、哈巴俄苷、莫诺苷、马钱苷、二苯乙烯苷、阿魏酸、杯苋甾酮的rsd分别为2.6％、1.7％、0.3％、3.3％、1.2％、1.9％、2.3％，结果表明该方法稳定性良好。
[0095]
3、重复性实验
[0096]
取同一批号的潜阳育阴颗粒6份，按照以上方法制备供试品溶液进样，记录峰面积。结果显示，哈巴苷、莫诺苷、马钱苷、二苯乙烯苷、哈巴俄苷、阿魏酸、杯苋甾酮含量的rsd分别为3.59％、3.66％、4.07％、4.89％、4.71％、4.70％、3.96％(n＝6)，表明该方法重复性良好。
[0097]
4、加样回收率实验
[0098]
取已知含量的同批号潜阳育阴颗粒6份，精密加入哈巴苷、哈巴俄苷、莫诺苷、马钱苷、二苯乙烯苷、阿魏酸、杯苋甾酮0.1250、0.0667、0.2100、0.1320、0.1738、0.0058、0.0570mg，并按以上含量测定方法制备供试品溶液，再以上含量测定色谱条件进样测定，测得平均加样回收率分别为105.55％、95.00％、101.32％、101.43％、97.79％、105.17％、102.28％，rsd分别为2.90％、2.53％、2.47％、4.11％、4.83％、2.07％、4.13％(n＝6)，表明该方法准确度良好。由以上实验结果表明，本发明建立的潜阳育阴颗粒指纹图谱检测方法，精密度、稳定性和重复性好，能有效地表征潜阳育阴颗粒的质量，有利于全面监控其质量。