微球-药物组合的制作方法

forcombinationwithnovelanticanceragents.cancertreatrev.2003oct；29(5):407–415)。6.许多肿瘤部位(例如前列腺)在解剖上是可进入的，并且因此是用于直接递送的合适靶标，特别是随着腹腔镜和机器人技术的出现。然而，多西他赛直接递送至前列腺的模型表明它不太可能有效，这是因为由于具有高流体传导性的组织区域，因而直接递送输注容易进入尿道(raghavanr,bradyml,sampsonjh.deliveringtherapytotarget:improvingtheoddsforsuccessfuldrugdevelopment.therdeliv.2016jul；7(7):457–481)。7.为了实现局部靶向递送并且减轻与全身性递送化学治疗剂相关的不期望的副作用，已经研究了多种基于聚合物的药物递送系统，目的是在恶性疾病部位实现高治疗浓度的化学治疗。这些包括聚合物纳米颗粒、脂质体、树状聚合物和纳米管。然而，迄今为止设计用于抗癌药物递送的许多纳米级材料依赖于静脉内施用，并因此需要以治疗浓度将药物靶向至肿瘤组织。此外，它们进入体循环很可能导致被网状内皮系统除去和隔离以及脱靶组织积累，这两者都是在开发纳米级范围材料时需要解决的重要问题。8.当植入至肿瘤内或邻近肿瘤时，本发明可以提供局部受控的和持续的药物释放，从而提高临床效力的可能性并降低脱靶的附属组织损伤。用于辅助治疗的新方法允许在肿瘤切除时施用药物递送贮库系统。该系统旨在破坏肿瘤切除之后剩余的残留癌细胞的关键属性包括：(i)通过合适规格(gauge)的针或递送口(deliveryport)能够微创递送；(ii)与肿瘤切除之后产生的组织腔的形状相适应，以使药用产品在极靠近残留肿瘤细胞处的表面积最大化；(iii)持续递送治疗剂量；(iv)将产品保留在靶部位；以及(v)在短的时间范围内理想地可转化用于临床使用。9.因此，本发明涉及新的控释药物递送贮库系统，该系统通过将api与现有的、临床批准的、生物可降解的、通过热致相分离(thermallyinducedphaseseparation，tips)制成的可被递送的高度多孔微球结合来满足这些靶标属性并且将符合肿瘤切除之后立即产生的组织腔的形状。本发明的微球还可以充当支架以促进手术之后的组织修复过程。本发明的方法还提供了新的、容易且稳健的负载方案，其实现了与在手术时微创递送相容的负载至tips微球上的一致量的api，以及其次，api-tips微球组合产物的体外效力。10.发明概述11.根据本发明的第一方面，提供了用于将不溶性活性药物成分(api)连接至通过热致相分离(tips)产生的微球的方法，其包括：12.i)将所述微球与水溶液混合以形成第一组合物；13.ii)将所述不溶性api溶解在第一溶剂中，并且随后将溶解在所述第一溶剂中的所述不溶性api添加至所述第一组合物中以形成第二组合物；以及14.iii)混合所述第二组合物。15.这种简易且稳健的方法被用于用不溶性api来负载tips微球。该方法提供了优于其他微球药物-装置制造技术(例如用于产生现有技术的微球的溶剂乳液蒸发过程)的优势，其包括在制造过程期间避免所述api暴露于溶剂，并且能够实现高药物负载效率。此外，所述方法允许在使用之前立即制备所述药物-装置组合，并允许plgatips微球以干燥形式储存，从而通过避免降解来增加其保质期。16.根据本发明的第二方面，提供了通过热致相分离产生的微球，其具有结合至其表面的不溶性api。17.根据本发明的第三方面，提供了包含本发明的微球的组合物，其用于治疗。18.根据本发明的第四方面，提供了包含本发明的微球的组合物，其用于治疗癌症。19.根据本发明的第五方面，提供了包含本发明的微球的组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。20.根据本发明的第六方面，提供了治疗癌症的方法，其包括向需要这样的治疗的对象施用包含本发明的微球的组合物。21.根据本发明的第七方面，提供了用于治疗癌症的药盒，其包含：22.i)在密封容器中提供的tips微球；23.ii)溶解在第一溶剂中的不溶性api；和24.iii)载体载剂。25.本发明的tips微球在需要的部位提供api的局部递送和持续释放制剂，并允许在肿瘤部位提高api的局部浓度，从而通过破坏残留的肿瘤细胞而降低由肿瘤切除不完全引起的疾病复发风险。此外，这样的局部递送系统降低了循环内api损失的风险和与使用常规全身性递送途径递送的化学治疗剂相关的脱靶毒性，例如中性粒细胞减少症、白细胞减少症、神经毒性作用、腹泻、脱发、无力和恶心。26.发明详述27.根据本发明的第一方面，提供了用于将不溶性活性药物成分(api)连接至通过热致相分离(tips)产生的微球的方法，其包括：28.i)将所述微球与水溶液混合以形成第一组合物；29.ii)将所述不溶性api溶解在第一溶剂中，并且随后将溶解在所述第一溶剂中的所述不溶性api添加至所述第一组合物中以形成第二组合物；以及30.iii)混合所述第二组合物。31.本方法允许用不溶性api负载tips微球。如上概述，所述方法在制造过程期间避免api药剂暴露于溶剂，并且能够实现高药物负载效率。32.本文中使用的术语“连接”涵盖任何形式的连接，但优选地是指被动连接。优选地，不溶性api沉淀在微球的表面。不溶性api可通过物理吸附黏附至微球。优选地，不溶性api以结晶形式沉淀在微球的表面。[0033]“不溶性”意指api不溶于水溶液。[0034]本文中使用的术语api意指可以用于成品药品中并旨在提供药理活性或以其他方式对疾病的诊断、治愈、缓解、治疗或预防具有直接作用或对人类的生理功能的恢复、校正或改变具有直接作用。[0035]术语“微球”是指基本上球形的颗粒的制剂之一。所述术语在本领域中是公知的。微球可含有多种径向孔。这意指孔从微球的中心部分向表面延伸，优选基本上平行于微球的半径。孔优选为管状且相互连通。径向孔为微球提供机械强度水平。[0036]所述结构是通过热致相分离产生的。特别地，所述结构可以通过在wo2008/155558中所公开的任何方法产生，其公开内容通过引用整体并入。[0037]所述方法包括将微球与水溶液混合以形成第一组合物。优选地，水溶液包含水、盐水或林格溶液(ringer’ssolution)，或其混合物。如果使用水，水还可包含氯化钠和/或右旋糖。混合可以通过任何合适的方式进行，例如摇动、旋转、滚动或涡旋。优选地，通过涡旋适当的时间段例如2、5、10、15或秒进行混合。优选地，涡旋进行约10秒。[0038]在一个实施方案中，将微球与水溶液混合以在容器中形成第一组合物。容器可以是本领域技术人员已知的任何合适的容器，例如烧杯、烧瓶、瓶、罐、试管、圆筒、离心管、微量离心管或小瓶。优选地，容器是小瓶。容器可以由api不吸附的任何合适的材料制成，例如塑料或玻璃。优选地，容器由玻璃制成，例如硼硅酸盐玻璃。优选地，容器是玻璃小瓶、冷冻干燥小瓶或硅化小瓶，更优选地是硼硅酸盐玻璃小瓶。[0039]水溶液的体积可以是适合于所使用的容器的任何体积。例如，当容器是20ml小瓶时，水的体积可以是0.5至5ml，优选1.5至4.5ml，更优选3至4.5ml。[0040]优选地，容器在混合期间通过本领域技术人员已知的任何合适的方式密封。这样的方式包括盖、帽、瓶塞(bung)、塞(stopper)或封口膜。优选地容器用塞密封。优选的塞的一个实例是丁基注射塞。[0041]不溶性api溶解在第一溶剂中。第一溶剂可以选自本领域技术人员已知的q3c——行业指导表格与列表(q3c—tablesandlistguidanceforindustry)，(http://academy.gmp-compliance.org/guidemgr/files/ucm073395.pdf)。优选地，溶剂选自3类溶剂。[0042]第一溶剂可以选自乙酸、丙酮、硝基甲烷、二氧六环、四氢呋喃、吡啶、甲基乙基酮、dmso、乙酸甲酯、卤代烃、甘油、甲苯、甲酰胺、丙二醇、聚乙二醇、低级醇及其混合物。卤代烃包括但不限于二氯甲烷、氯仿、四氯乙烷和三氯乙烷。低级醇包括但不限于异丙醇、甲醇和乙醇。[0043]优选地，溶剂是低级醇，并且最优选地溶剂是乙醇。优选地，乙醇是45％至100％的乙醇，更优选地是95％或100％的乙醇。[0044]优选地，将第一溶剂以这样的体积添加至不溶性api，以导致在第二组合物中的最终浓度为1％v/v至30％v/v，优选10％v/v至30％v/v，更优选10％v/v至20％v/v，以及最优选10％v/v。在第二组合物中的浓度在30％v/v以上时，微球可聚集在一起。[0045]在不溶性api溶解在第一溶剂中之后，将溶解在第一溶剂中的不溶性api添加至第一组合物以形成第二组合物。优选地，在该步骤期间，将包含微球和水溶液的容器倒置，使得微球远离密封小瓶开口的橡胶塞。将第一溶剂在存在于第一组合物中的水溶液中稀释以阻止微球直接接触第一溶剂(其可导致微球聚集)。[0046]优选地，将溶解在第一溶剂中的不溶性api通过针添加至第一组合物中。优选地，带有针的注射器用于在小瓶倒置时刺穿密封该小瓶的橡胶塞。[0047]然后混合第二组合物。混合可以通过任何合适的方式进行，例如摇动、旋转(rotating)、滚动(rolling)或涡旋。优选地，通过涡旋持续适当的时间段例如2、5、10、15或秒进行混合。优选地涡旋进行约10秒。优选地，涡旋之后是一段时间的旋转或滚动，例如持续5分钟至24小时，优选持续30分钟至60分钟。[0048]热致相分离优选地包括：[0049]i)将聚合物溶解在第二溶剂中以形成溶液；[0050]ii)在淬灭流体中淬灭溶液的液滴；以及[0051]iii)冷冻干燥所得球体，优选地其中使用注射器、振动针或雾化器将溶液引入该淬灭中，并且更优选地还包括对溶液进行超声处理的步骤。[0052]可以使用任何疏水性聚合物，但聚合物优选是可药用的并且完全可溶于溶剂中。聚合物可以是可降解的或不可降解的。它可以是合成的或非合成的。可以使用聚合物的组合，例如，合成聚合物与非合成聚合物组合使用。示例性聚合物包括聚(丙交酯-共-乙交酯)(plga)、聚(α-羟基酯)、聚酐、聚原酸酯、聚膦嗪、聚丙烯延胡索酸酯、聚(丙烯延胡索酸酯-共-乙二醇)、聚环氧乙烷、聚羟基丁酸酯(phb)和聚羟基戊酸酯(phv)。也可以使用两种或更多种聚合物(特别是phb和phv)的共聚物。其他的包括聚(α-羟基酯)-共-peg共聚物，或包括聚乙二醇化药物的共聚物。可以使用的天然聚合物包括纤维蛋白。优选地聚合物不是壳聚糖。[0053]聚合物的类型(例如永久的或可降解的，天然的或合成的)、孔隙率、机械强度和尺寸可以根据微球的用途或选择的递送部位进行选择。例如，在组织来自递送部位的情况下，可降解材料可以是优选的，以替代结构的临时支架功能。最优选地，聚合物是聚(丙交酯-共-乙交酯)(plga)。[0054]第二溶剂被选择为具有高于淬灭流体的温度的更高的冷冻温度。示例性第二溶剂包括碳酸二甲酯、氯仿、丙酮、二甲基氯、四氢呋喃和超临界二氧化碳。优选地第二溶剂是碳酸二甲酯。[0055]优选地，所述方法还包括对溶液进行超声处理的步骤。[0056]用于形成微球的淬灭流体可以是液体或气体。实例淬灭流体包括液氮、液氧、液态co2、氟里昂、水、乙醇、甲醇。优选地淬灭流体是液氮。[0057]可以使用任何合适的方法将溶液引入至淬灭流体中。例如，可以使用注射器或振动针产生液滴。或者，可以使用例如气溶胶推进或泵送系统将溶液通过雾化器喷射，或者使用静电力或同轴气流(coaxialairstream)将溶液拉入淬灭流体中。[0058]优选地，不溶性api是化学治疗剂。“化学治疗剂”意指该药剂选择性地破坏恶性细胞和恶性组织。化学治疗剂的非详尽实例是烷化剂，例如苯丁酸氮芥、美法仑(melphalan)、达卡巴嗪(dacarbazine)和替莫唑胺(temozolomide)；蒽环类，例如伊达比星(idarubicin)和戊柔比星(valrubicin)；组蛋白脱乙酰酶抑制剂，例如伏立诺他(vorinostat)和罗米地辛(romidepsin)；拓扑异构酶抑制剂，例如依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)和他氟泊苷(tafluposide)；激酶抑制剂，例如硼替佐米(bortezomib)、厄洛替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、伊马替尼(imatinib)、维罗非尼(vemurafenib)和维莫德吉(vismodegib)；核苷酸类似物和前体类似物，例如阿扎胞苷(azacitidine)、硫唑嘌呤、氟尿嘧啶、巯基嘌呤、甲氨蝶呤和硫鸟嘌呤；基于铂的药剂，例如卡铂、顺铂和奥沙利铂；类视黄醇，例如维甲酸、阿利维a酸和贝沙罗汀(bexarotene)；长春花生物碱及衍生物，例如长春碱和长春地辛，以及紫杉烷，例如卡巴他赛(cabazitaxel)、紫杉醇和多西他赛。[0059]优选地，化学治疗剂是紫杉烷，更优选地是卡巴他赛、紫杉醇或多西他赛，甚至更优选地是多西他赛。[0060]任何未与微球结合的不溶性api可以通过在水溶液中洗涤而从第二组合物中被除去。优选地，水溶液包括水、盐水、林格溶液或其混合物。如果使用水，则水还可包含氯化钠和/或右旋糖。洗涤程序的非限制性实例可包括：(i)除去溶解在第一溶剂中的api；(ii)添加等体积的水溶液；以及(iii)通过任何合适的方式洗涤，例如摇动、旋转、滚动或涡旋。优选地，洗涤通过涡旋持续合适的时间段(例如10秒至5分钟)来进行。优选地，涡旋进行约2分钟。在该步骤之后，水溶液可以被除去。优选地除去通过抽吸进行。[0061]本发明的第二方面涉及通过热致相分离产生的微球，其具有结合至其表面的不溶性api。[0062]优选地，所述不溶性api通过上述方法与微球结合。[0063]优选地，所述热致相分离包括：[0064]i)将聚合物溶解在溶剂中以形成溶液；[0065]ii)在淬灭流体中淬灭所述溶液的液滴；以及[0066]iii)冷冻干燥所得球体，优选地其中使用注射器、振动针或雾化器将所述溶液引入淬灭中，并且更优选地还包括对所述溶液进行超声处理的步骤。[0067]本发明该实施方案中的溶剂是上述方法中所述的第二溶剂。[0068]优选地，聚合物是plga，溶剂是碳酸二甲酯，和/或淬灭流体是液氮。[0069]上文定义的和本文使用的术语“微球”可涵盖尺寸适合用于连接不溶性api的基本上球形的颗粒。优选地，如通过电子显微术(例如扫描电子显微术)所表征的微球的直径为约10至900μm。优选地，微球的直径可以为约50至450μm，更优选地直径为约100至400μm，甚至更优选地直径为250至350μm。[0070]优选的250至350μm的尺寸范围使得微球可以通过微创方法通过合适规格的针或递送口容易地递送给患者，同时在填充的微球之间提供足够大的间隙以增加用于药物释放的表面积并允许在紧密填充的微球之间的组织浸润。[0071]微球的孔径还可以根据预期用途和需要的机械强度进行选择，并且可以根据微球的直径进行选择。此外，孔的尺寸优选为规则的。也就是说，孔优选为基本上同一直径的孔，即孔的直径优选相差10％或更小。多孔微球由于孔的性质而具有良好的机械强度。[0072]本发明的第三方面涉及包含本发明的微球的组合物，其用于治疗。[0073]根据本发明的第四方面，提供了包含本发明的微球的组合物，其用于治疗癌症。[0074]当癌症被“治疗”时，这意指癌症的一种或更多种临床表现被改善。这并不意指癌症的症状得到完全解决，使得它们不再存在于患者体内，但是在某些方法中可以是该情况。“治疗”使得癌症的一种或更多种症状不如治疗之前严重。例如，肿瘤可以被缩小尺寸或完全根除。[0075]癌症可以是任何类型的癌症，优选癌、肉瘤或淋巴瘤。优选地，癌症选自前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、结直肠癌、甲状腺癌、口腔癌、肺癌、肾癌、子宫癌或卵巢癌。更优选地，癌症是前列腺癌。在一个特别优选的实施方案中，患有前列腺癌的患者已进行了根治性前列腺切除术。[0076]可以将包含本发明的微球的组合物直接施用至在肿瘤切除或例如根治性前列腺切除术之后产生的组织腔中。除了将化学治疗剂直接递送至需要的部位之外，tips微球可以作为手术之后的适合的组织支架。微球可以通过微创方法通过合适规格的针或递送口容易地递送，同时在填充的微球之间提供足够大的间隙以增加用于药物释放的表面积并允许在紧密填充的微球之间的组织浸润。[0077]根据本发明的第五方面，提供了包含本发明的微球的组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。[0078]根据本发明的第六方面，提供了治疗癌症的方法，其包括向需要这样的治疗的对象施用包含本发明的微球的组合物。[0079]根据本发明的第七方面，提供了用于治疗癌症的药盒，其包含：[0080]i)在密封容器中提供的tips微球；[0081]ii)溶解在第一溶剂中的不溶性api；和[0082]iii)载体载剂。[0083]容器可以是本领域技术人员已知的任何合适的容器，例如烧杯、烧瓶、瓶、罐、试管、圆筒、离心管、微量离心管或小瓶。优选地，容器是小瓶。容器可以由api不吸附的任何合适的材料制成，例如塑料或玻璃。优选地，容器由玻璃制成，例如硼硅酸盐玻璃。优选地，容器是玻璃小瓶、冷冻干燥小瓶或硅化小瓶，更优选地是硼硅酸盐玻璃小瓶。[0084]优选地，容器在真空下被密封。干燥的tips微球在这样的条件下具有超过六年的保质期。[0085]不溶性api和第一溶剂如上所述。[0086]载体载剂可包含合适的一种或更多种合适的赋形剂。用于治疗用途的可接受的赋形剂在制药领域是公知的，并且描述于例如remington'spharmaceuticalsciences,mackpublishingco.(a.r.gennaroedit.1985)中。载剂可包含任何合适的结合剂、润滑剂、助悬剂、涂层剂或增溶剂作为赋形剂或包含除其之外的作为赋形剂。在一个实施方案中，载体载剂可包含水凝胶。[0087]药盒还可包含适合于以可注射形式递送的水溶液。水溶液可包含水、盐水或林格溶液，或其混合物。在水溶液是水的情况下，水还可以包含氯化钠和/或右旋糖。[0088]药盒还可包含合适规格的注射器、针和/或套管(例如16g至30g)，用于将载体载剂中的微球递送至患者。[0089]本领域技术人员将理解本发明的所有方面，无论它们是否涉及例如连接方法、微球、微球用途或治疗方法，都同样适用于本发明的所有其他方面。特别地，例如连接方法的方面可以比本发明的其他方面(例如微球的用途)更详细地描述，然而，本领域技术人员将理解，在对于本发明的特定方面已经给出了更详细的信息的情况下，该信息通常同样适用于本发明的其他方面。[0090]现在通过仅实例的方式参照附图更详细地描述本发明，其中：[0091]图1举例说明了将dtx负载至tips微球上的一个实例。[0092](i)5mg的plgatips微球在20ml透明1b型硼硅酸盐玻璃小瓶中并用丁基注射塞密封。(ii)将4.5ml超纯水添加至小瓶。(iii)将小瓶涡旋10秒。(iv)使用带有25g针的1ml注射器通过橡胶塞添加0.5ml的在乙醇中的0.1％(w/v)多西他赛，同时倒置小瓶。(v)然后将小瓶涡旋10秒并置于辊式混合器(rollermixer)(roller6digital；60rpm)上，在室温下进行预定的时间。[0093]图2示出了紫杉烷在plgatips微球上的固定。(a)负载至微球上的dtx的量通过计算在负载阶段期间的不同时间点的在溶液中剩余的dtx的量(通过uv吸收测量)来间接量化。(b)未负载的对照tips微球的代表性扫描电子显微术(scanningelectronmicroscopy，sem)图像和(c)负载有500μgdtx的dtx-tips微球的代表性扫描电子显微术(sem)图像。(d)显示dtx向tips微球的表面的时间依赖性吸附的sem图像。(e)在对照tips微球或dtx-tips微球的表面获得的氮的xps高能分辨率谱(n1s)。(f)示出了干燥的tipsplga微球、“预湿的”tipsplga微球和plga聚合物固体微粒的dtx负载。(g)tips微球通过抗溶剂沉淀负载有多西他赛、紫杉醇和卡巴他赛。微球的扫描电子显微术显示出与未负载的对照tips微球相比，在紫杉醇或卡巴他赛溶液中孵育的微球的表面上存在结晶物质。(h)与卡巴他赛相比，多西他赛显示出负载至微球上的更快的速率。在开始混合的60分钟内，大约80％的多西他赛从溶液负载至微球上。在同一时间点，大约60％的卡巴他赛从溶液负载至微球上。在负载阶段期间超过60分钟未检测到多西他赛负载的进一步增加。[0094]图3示出了在注射用紫杉醇制剂(例如)中存在的赋形剂干扰抗溶剂沉淀过程并阻止药物负载至微球的表面上。微球的扫描电子显微术显示出与用未添加赋形剂的多西他赛和紫杉醇的纯制剂孵育的tips微球相比，在多西他赛和紫杉醇的注射制剂中孵育的微球的表面上存在较少的结晶物质。[0095]图4示出了(a)在由吐温80和乙醇的1:1共混物构成的载剂中配制注射用多西他赛(例如)，其在施用之前在盐水中被进一步稀释。(b)在由cremophorel和乙醇的1:1共混物构成的载剂中配制注射用紫杉醇(例如)，其在施用之前在盐水中稀释5至20倍。在注射制剂中存在的赋形剂会干扰抗溶剂沉淀过程并阻止药物负载至微球的表面上。[0096]图5示出了微球的扫描电子显微术，其显示出结晶物质在“湿的”和“干燥的”微球的表面上的分布相似。[0097]图6示出了在起始的72小时内，多西他赛的累积释放对于“湿的”和“干燥的”负载多西他赛的tips微球显示出相似的释放速率趋势。[0098]图7示出了与球体的起始尺寸和在相同时间点测量的对照组中的球体相比，从获得的图像中计算的球体的直径显示出尺寸显著减小，与从“湿的”和“干燥的”负载多西他赛的tips微球中收集的灌注液产生了相似的作用。[0099]图8示出了sem成像，其确认了在储存1个月之后，在tips微球的表面上存在相当量的多西他赛。[0100]图9示出了(a)使用229nm处的uv吸收测量dtx从dtx-tips微球的累积释放。(b)通过用在12天的时期内以每天间隔从dtx-tips微球中收集的灌注液将pc3细胞孵育48小时进行集落形成测定。将暴露于从不同时间点收集的灌注液的细胞重新平板接种至培养皿中并孵育2周，然后计数染色的集落。(c)用在第1天、第5天和第10天从dtx-tips微球中收集的灌注液孵育pc3细胞持续48小时之后，对显示与凋亡相关的形态学变化的细胞进行量化。在孵育之后48小时以及在新鲜完全培养基中孵育之后第5天和第10天评估细胞形态。[0101]图10示出了(a)pc3细胞的3d球体培养物在从dtx-tips或未负载的对照tips微球中收集的灌注液中孵育12天。将培养基用在相应时间点收集的灌注液替代。球体的直径和体积是从在整个孵育期获得的图像中计算出的。用来自dtx-tips的灌注液孵育的球体在尺寸上随着时间而缩小。(b)在组织培养孔中以2d培养的pc3细胞以相同的方式进行处理并表现出细胞毒性的形态学特征。(c)使用染色(钙黄绿素am-活细胞；和乙锭同型二聚体-1(ethd-1)，死细胞)分析在第12天在用灌注液孵育的球体中细胞的生存力，比例尺200μm。(d)在用来自dtx-tips微球的灌注液孵育并在第12天转移至组织培养板的球体中的pc3细胞未能从球体迁移并且显示不能存活，而来自用对照微球孵育的球体中的细胞能存活并且从球体迁移(比例尺200μm。数据表示n＝20的平均值±标准偏差。***：在对照和dtx处理的样品之间p《0.001)。[0102]图11示出了dtx-tips在体内抑制肿瘤生长而无全身性毒性。(a)接受ivdtx的小鼠表现出逐渐显著的体重减轻，其表明全身性毒性。(b)在接受对照tips微球或iv盐水的小鼠中，肿瘤体积在研究期间内逐渐增加。(c)在接受ivdtx的小鼠中，在第14天，在接受dtxiv和dtx-tips的小鼠之间的肿瘤尺寸的增加无显著差异，其表明dtx-tips在阻止肿瘤生长同样有效。[0103]图12示出了从非荷瘤balb/canncrl小鼠收集的血浆中dtx的测量结果。仅在dtx-tips微球递送之后的1小时和24小时时，血浆中可检测到低水平的dtx。i.v.dtx施用之后1小时和24小时时检测到更高水平的dtx，同时在第48小时和第72小时以及在第10天(240小时)和第15天(360小时)时dtx仍具有可检测水平。[0104]图13示出了经切除的pc3异种移植肿瘤(t)的组织学。肿瘤周围植入的dtx-tips微球(*)在第35天仍保留在递送部位。微球被松散的结缔组织包围。更高的放大倍数(插图)显示出微球在植入之后保持完整。[0105]图14示出了(a)在接受i.v.盐水或对照tips微球的组中观察到肿瘤体积的最大增加。在接受i.v.dtx的组中未观察到肿瘤体积增加。接受dtx-tips的组的肿瘤体积增加变得滞缓。(b)代表性经切除的pc3前列腺癌异种移植肿瘤的宏观图像，其说明肿瘤体积的差异与不同的处理组相关。(c)处理之后的nsgtm免疫缺陷小鼠的体重变化。在接受i.v.dtx的小鼠中观察到体重逐渐减轻。在接受dtx-tips的小鼠中未观察到显著不同的体重变化。(****p《0.0001)。实施例[0106]实施例1[0107]材料和方法[0108]tips微球的制备[0109]如先前所述制备由聚(d,l-丙交酯-共-乙交酯)(plga)构成的tips微球(ahmadir,mordann,forbesa,dayrm.enhancedattachment,growthandmigrationofsmoothmusclecellsonmicrocarriersproducedusingthermallyinducedphaseseparation.actabiomater.2011apr；7(4):1542–1549)。使用磁力搅拌将plgapurasorb7507(75:25)聚合物(corbion,amsterdam,netherlands)溶解在碳酸二甲酯(sigmaaldrich,dorset,uk)中过夜，以产生10％(w/v)的聚合物溶液。然后通过注射器泵(harvardapparatus,kent,uk)以2ml/分钟的恒定流量将聚合物溶液进给至nisco封装器单元(niscoengineering,zurich,switzerland；频率:2.75khz,振幅:70％)中。使用100μm蓝宝石喷嘴形成聚合物液滴并将其收集在液氮中。通过冻干从冷冻的聚合物液滴中除去残留溶剂持续48小时。将干燥的plgatips微球筛分为250至350μm的尺寸范围，并且在室温下在真空中储存在橡胶塞玻璃小瓶中。[0110]用tips微球负载紫杉烷[0111]开发了通过抗溶剂沉淀将dtx和其他紫杉烷(例如紫杉醇和卡巴他赛)负载至tips微球上的简易方法(图1)。将5mg的plgatips微球转移至20ml透明1b型硼硅酸盐玻璃小瓶中并用丁基注射塞密封。将4.5ml超纯水添加至小瓶并涡旋10秒。当小瓶倒置时，使用带有25g针的1ml注射器通过橡胶塞添加0.5ml的在乙醇中的0.1％(w/v)紫杉烷或符合或的多西他赛或紫杉醇制剂。然后将小瓶涡旋10秒并放置在滚轴混合器(roller6digital；60rpm)上在室温下持续预定的时间段(5、15、30、60、120分钟)。[0112]根据等式1计算在每个时间点的紫杉烷(例如dtx)在tips微球上的药物负载效率(drugloadingefficiency，dle)。溶液中剩余的游离紫杉烷的量使用nanodrop2000c分光光度计(thermoscientific,waltham,ma,usa)在229nm波长处通过uv光谱术来测得。[0113][0114]使用扫描电子显微术研究在负载紫杉烷之后的tips微球的表面的形态学变化。通过用5ml超纯水洗涤三次，相对于微球而除去未结合的紫杉烷，然后在真空下干燥。使用q150res金涂覆器(quorumtechnologies,oxford,uk)将经干燥颗粒的样品用金涂覆60秒。使用hitachis3400n扫描电子显微镜对样品进行成像。[0115]使用thermoscientifick-α光电子能谱仪使用单色alkα辐射进行x射线光电子能谱术(x-rayphotoelectronspectroscopy，xps)。在50ev的通过能量下记录n(1s)、c(1s)的主峰的更高分辨率扫描。[0116]用于将api负载至plgatips微球上的方法的比较[0117]1.干燥的tipsplga微球(尺寸范围为250至350μm)：如上直接所述，将多西他赛负载至5mg的plgatips微球上。通过将经洗涤的微球置于干燥器中至少7天或通过冻干法(“冷冻干燥”)除去多余的水来制备干燥的经负载的tips微球。[0118]2.“预湿的”tipsplga微球：将5mg的plgatips微球与完全培养基(补充有10％(v/v)胎牛血清(foetalbovineserum，fbs)和1％抗生素的ham’sf12-k培养基(kaighn’s改良)(invitrogen,21127-022))混合，随后添加乙醇至浓度为7％(v/v)。[0119]3.将与5mg干燥的tipsplga微球中的微球量等量的固体plga微球(尺寸范围为250至350μm)转移至20ml透明1b型硼硅酸盐玻璃小瓶中并将其用丁基注射塞密封。将4.5ml超纯水添加至小瓶并涡旋10秒。当小瓶倒置时，使用带有25g针的1ml注射器通过橡胶塞添加0.5ml的在乙醇中的0.1％多西他赛(w/v)。然后将小瓶涡旋10秒并在室温下置于滚轴混合器(roller6digital；60rpm)上持续预定的时间段(5、15、30、60、120分钟)。[0120]4.根据等式1计算每个时间点多西他赛(dtx)在tips微球上的药物负载效率(dle)。溶液中剩余的游离多西他赛的量使用nanodrop2000c分光光度计(thermoscientific,waltham,ma,usa)在229nm波长处通过uv光谱术来测得。[0121]多西他赛从dtx-tips微球组合产物的释放[0122]使用动态灌注系统研究dtx从tips微球中的释放曲线，以模拟在根治性前列腺切除术之后临床使用时药物-装置组合在生理环境中的组织灌注。因此，将灌注系统置于37℃的培养箱内，并将生理模拟培养基(磷酸盐缓冲盐水(phosphatebuffedsaline，pbs)；ph7.4)用作灌注液。将负载dtx的微球与在超纯水中稀释的100μl的70％(v/v)(convatec,uk)混合，并将混合物置于两张25mm圆形滤纸(定性纤维素滤纸，1级)之间，它们的位置由swin-loktm塑料膜过滤器保持器保持。将连接过滤器保持器出口的皮下注射针(18g×40mm)插入通过50ml聚丙烯容器的盖以收集灌注液。通过蠕动泵(harvardapparatus)以0.01ml/分钟的流量泵送pbs通过过滤器保持器。将条件灌注液以指定的间隔取样并用于进一步的实验。[0123]使用预定的标准曲线确定灌注液中释放的dtx的量。在每次测量时，将收集在聚丙烯容器中的释放介质中的dtx浓度如上所述在229nm处通过uv光谱术确定，以根据等式2计算累积的dtx释放。[0124][0125]从dtx-tips微球组合产物释放的多西他赛的体外效力[0126]将人前列腺癌细胞(pc3，美国典型培养物保藏中心(americantypeculturecollection))用于测试从dtx-tips微球释放的多西他赛的活性。将pc3细胞维持在补充有10％(v/v)胎牛血清(fbs)和1％抗生素的ham’sf12-k培养基(kaighn’s改良)(invitrogen,21127-022)(以下称为完全培养基)中。将细胞在加湿培养箱中在37℃下、5％co2气氛中培养。[0127]如上概述，将在6孔板中培养的pc3细胞在从负载至灌注系统中的dtx-tips微球收集的2ml灌注液(条件完全培养基)中孵育48小时。如先前所述进行集落形成测定(frankennap,rodermondhm,stapj,havemanj,vanbreec.clonogenicassayofcellsinvitro.natprotoc.2006；1(5):2315–2319)。将暴露于灌注液的pc3细胞使用胰蛋白酶-edta溶液(0.5g/l猪胰蛋白酶和0.2g/ledta.4na，在含酚红的hank's平衡盐溶液中；sigma-aldrich)从6孔板中分离出来，在新鲜的完全培养基中进行洗涤以产生单一细胞悬液，在新鲜的完全培养基中重悬，并以每皿400个细胞的密度重新平板接种至9cm直径的培养皿中。平板接种之后，将培养皿在加湿培养箱中在37℃下、5％co2气氛中孵育2周以允许形成集落。将集落用甲醇固定20分钟，并用在蒸馏水中的0.5％结晶紫(sigmaaldrich,dorset,uk)染色2小时。将集落在imagej中使用“集落计数器”插件(处理参数：尺寸100至30,000；圆形度0.5至1)(https://imagej.nih.gov/ij/plugins/colony-counter.html)计数。[0128]通过将经计数的集落数除以最初接种的细胞数来评价平板接种效率(platingefficiency，pe)。在计算存活分数(survivingfraction，sf)时将该数字用于归一化。[0129][0130]2d培养中的凋亡的形态学检测[0131]暴露于灌注液条件完全培养基之后，评估了指示凋亡的pc3细胞的形态学变化，包括收缩和分裂形成膜结合的凋亡小体。将细胞在以24小时间隔在12天内收集的灌注液条件完全培养基中孵育24小时。使用相衬显微术使用zeissprimovert显微镜获得细胞形态学图像，并分析每组中至少100个细胞以计算显示出核碎裂(nuclearfragmentation)的每个图像中的细胞数。[0132]肿瘤球体的效力研究[0133]如先前所述通过使用甲基纤维素作为支架生成pc3细胞的3d球体(korfft.(2004)three-dimensionalspheroidcultureofendothelialcells.in:augustinh.g.(eds)methodsinendothelialcellbiology.springerlabmanuals.springer,berlin,heidelberg)。将pc3以2×104个细胞/200μl含有20％wt甲基纤维素的完全培养基的浓度接种在96孔超低吸附u型底平板中。将细胞在加湿培养箱中在37℃下、5％co2气氛中孵育2天，直到形成球体。将培养基用200μl灌注液条件完全培养基替代，后者在12或14天内的相应时间点，每天被从灌注液体系收集的培养基替代。[0134]在培养的每一天都获得了球体的图像。使用imagej测量成像球体的维度。将feret’s直径用于评估球体的平均直径并针对时间作图(graphpadprism软件)。[0135]体内前列腺肿瘤的形成[0136]将五百万的人前列腺癌细胞(pc3，美国典型培养物保藏中心)皮下注射至雌性nsgtm(nodscidγ)免疫缺陷小鼠(6至7周龄)的胁部。2周之后，形成了测量为约20mm3的可触及肿瘤。每周记录3次每个肿瘤的尺寸和每只动物的体重。[0137]肿瘤处理[0138]将小鼠分配至四个处理组之一(dtx-tips微球n＝7；对照tips微球n＝7；天然dtxn＝7；盐水n＝4)并接受以下处理方案：[0139]1.dtx-tips微球的肿瘤周围递送：将负载有500μgdtx溶液的5mgplgatips微球(如实施例1中所述)混合至100μlgranugel中。[0140]2.对照tips微球的肿瘤周围递送：将5mgplgatips微球混合至100μlgranugel中。[0141]3.尾静脉注射溶解在乙醇和吐温80中的10mgdtx以产生10mg/ml溶液，然后在盐水中稀释至1mg/ml。小鼠接受10mg/kg；每周一次，持续3周。[0142]4.尾静脉注射盐水(10μl/g)；每周一次，持续3周。[0143]在生命期结束时，将动物人道地处死。在组织学分析之前将肿瘤切除并称重。[0144]对在体内从dtx-tips微球释放的dtx的测量[0145]如上概述，负载多西他赛的tips微球通过抗溶剂沉淀制备。为了确定在处理之后的循环中存在的dtx浓度，将dtx-tips微球在100μl的70％(v/v)granugel中混合成均匀混悬液，并使用1ml注射器和16g针通过1×100μl贮库皮下植入至非荷瘤balb/canncrl小鼠(n＝5)(7至8周，17至20g，charlesriver)中。对照动物通过尾静脉递送接受对照tips微球(n＝5)或i.v.dtx10mg/kg，每周一次持续三周(n＝5)。为了测量血浆中的循环dtx，在第0天(给药之前)和第1、2、3、7、10天通过尾静脉收集血液样品，然后每5天收集一次，直到第35天(紧接生命期结束之前)。将血液样品收集至含有肝素钠(hirschmann,eberstadt,germany)的10μl毛细管中，并置于2ml深孔板的孔中，其在-80℃下储存直至提取。[0146]在提取当天，将校准曲线和样品板解冻。将125μl的70:30的水:含有0.4％血液的乙腈添加至空白、校准曲线和qc。将125μl的70:30的水:含有0.4％dmso的乙腈添加至所有样品。取40μl的各血液:水:乙腈样品，并用含有dtx-d9(25nm)的120μl乙腈沉淀蛋白质。将样品混合并离心。取上清液并用在乙酸铵(10mm，ph5)中的0.5％乙酸钠(20μm)以40:60稀释。[0147]将液相色谱-质谱分析用waters(milford,ma)h-classacquity溶剂管理器和样品管理器在watersacquityhsspfp柱(1.8μm,50mm×2.1mmid)上进行，梯度由10mm乙酸铵(ph5.0)和乙腈流动相组成。流量为0.6ml/分钟，并且运行时间为5.6分钟。在阳离子模式下使用电喷雾电离对分析物和内标进行离子化。在多反应监测(multiplereactionmonitoring，mrm)模式下通过使用watersxevotq-s质谱仪的串联质谱(ms/ms)检测分析物。对于dtx和dtx-d9(is)，分别监测了转变m/z830.4–248.1/304.2和m/z839.4–313.0。校准曲线在1至10,000nm浓度范围内呈线性。[0148]体内肿瘤生长抑制活性[0149]使6至7周龄且体重18至20g的雌性nsgtm免疫缺陷小鼠(nod.cg-prkdcscidil2rgtm1wjl/szj；charlesriver)适应1周，随后注射肿瘤细胞。将pc3细胞(100μl磷酸盐缓冲盐水[phosphatebufferedsaline，pbs]中的5.0×106个细胞)皮下注射至每只小鼠的右胁。使用数字卡尺每周测量3次肿瘤的尺寸，并使用下式计算肿瘤体积：[0150][0151]在细胞注射之后第14天，将小鼠随机分为四组：组1静脉内(intravenous，i.v.)dtx(通过尾静脉递送10mg/kg，每周一次，持续三周；n＝7)；组2肿瘤周围注射dtx-tips微球(n＝7)；组3肿瘤周围注射对照tips微球(n＝7)；组4i.v.盐水(10μl/g体重；n＝4)。组2和组3中的小鼠在将tips微球在100μl的70％(v/v)granugel中混合成均匀混悬液之后接受tips微球( /-dtx)。将tips微球在granugel中的混悬液使用1ml注射器和16g针在肿瘤周围通过1×100μl贮库皮下递送。在研究期间监测小鼠的毒性迹象(体重减轻、身体状况和不协调的运动)。如果体重减轻超过起始体重的15％或者它们表现出过度的毒性迹象，则对小鼠实施安乐死。[0152]在生命期结束时(处理之后的第1、10和35天)，通过过量的co2对小鼠实施安乐死，之后进行颈椎脱位并收集器官(心脏、肝、肾、肺和脾)，称重并立即在液氮中冷冻，然后在-80℃下储存直到进一步分析。在使用precellys24均化器(bertintechnologies,montigny-le-bretonneux,france)以3ml/g(脾5ml/g)10mmpbs进行均质化后，对多西他赛浓度的评价在组织中通过液相色谱串联质谱进行。在45μl组织匀浆中加入5μldmso，混合样品并用含有dtx-d9(25nm)作为内标的150μl乙腈沉淀蛋白质。将样品混合并离心。取上清液并用在乙酸铵(10mm，ph5)中的0.5％乙酸钠(20μm)以40:60稀释。使用从同一小鼠品系(nsg)获得的组织如上制备空白、校准曲线和qc，并向其分别加入dmso、工作校准标准品和工作qc。空白由仅用乙腈沉淀的蛋白质组成，空白 、标准品和qc是用含有dtx-d9的乙腈沉淀的蛋白质。[0153]将肿瘤移出并处理以用于组织学。将组织在10％福尔马林中固定，脱水并包埋在低熔点蜡(paraplastsigma)中。将从蜡包埋的组织切下的组织切片用苏木精和伊红染色。[0154]统计方法[0155]使用graphpadprism软件检验高斯分布并分析数据的统计学显著性。对于有高斯分布的数据集，除非图例中另有说明，否则统计学评价通过以下来进行：双因素anova以及dunnett’s检验，其用于多重比较。对于有非高斯分布的数据集，统计学评价通过friedman检验进行。[0156]实施例2[0157]将dtx固定至plgatips微球上[0158]plgatips微球的第二组合物最初浮在dtx溶液的顶部，但在负载阶段期间通过旋转玻璃小瓶不断与溶液混合。通过计算在负载阶段期间的不同时间点在溶液中剩余的dtx的量，间接地定量负载至微球上的dtx的量。从开始混合的60分钟内，大约80％的dtx从溶液负载至微球上(图2a)。在负载阶段超过60分钟未检测到负载的进一步增加。tips微球在一小时内的快速负载可能通过它们异常高的表面静电荷而增强。当使用生物可降解的装置时，这样的快速负载是有益的。与未负载的对照tips微球相比，微球的扫描电子显微术显示在dtx溶液中孵育的微球的表面上存在结晶物质(图2b和c)。结晶物质在孵育的1分钟内在微球的表面可见，并且随着孵育时间的持续而增加(图2d)。dtx(c43h53no14)的分子组成允许对氮进行x射线光电子能谱术(xps)分析以用于确认在微球的表面上的结晶物质的元素组成(图2e)。在负载dtx的微球上检测到强的氮信号，其是在未负载的对照微球中所不存在的。与由相同的plga聚合物构成的固体微球或在“预湿”tips微球之后负载的plgatips微球相比，用干燥的plgatips微球实现了显著地更快的药物负载速率(参见以上实施例1中用于将api负载至plgatips微球上的方法的比较，其中微球在添加乙醇之前浸没在培养基中)(图2f)。[0159]与未负载的对照tips微球相比，tips微球的扫描电子显微术还显示在紫杉醇或卡巴他赛溶液中孵育的tips微球的表面上存在结晶物质(图2g)。[0160]在tips微球的表面上存在紫杉烷晶体表明紫杉烷负载在表面上而不是被包封在颗粒中。在tips颗粒上观察到的紫杉烷晶体可能通过抗溶剂沉淀而形成以及在干燥过程期间由于溶剂蒸发而生长。plgatips微球的疏水和多孔的性质为紫杉烷沉淀提供了合适的表面，这是由于其促进了药物的成核并由此促进了在表面上的结晶，从而导致了约80％的高药物负载效率。不使用加热和冷却步骤，dtx在tips颗粒上的最大负载发生在60分钟内，这使得用于在护理点(pointofcare)制备药物-装置组合的时间范围可行。然而，值得注意的是，负载tips微球的抗溶剂沉淀率随紫杉烷的不同而不同。[0161]与卡巴他赛相比，多西他赛显示出负载至tips微球上的更快的速率。在开始混合的60分钟内，大约80％的多西他赛从溶液中负载至微球上(图2h)。在同一时间点，大约60％的卡巴他赛从溶液中负载至微球上。在负载阶段期间超过60分钟未检测到多西他赛负载的进一步增加。[0162]实施例3[0163]紫杉烷注射制剂中的赋形剂阻碍抗溶剂沉淀药物负载至tips微球上[0164]将注射用多西他赛(例如)在由吐温80和乙醇的1:1共混物构成的载剂中进行配制，其在施用之前在盐水中进一步稀释。将注射用紫杉醇(例如)在由cremophorel和乙醇1:1共混物构成的载剂中进行配制，其在施用之前在盐水中稀释5至20倍。使用含有赋形剂的紫杉烷注射制剂与将紫杉烷负载至tips微球上是不相容的。[0165]微球的扫描电子显微术显示，与用不添加赋形剂的多西他赛和紫杉醇的纯制剂孵育的tips微球相比，在多西他赛和紫杉醇的注射制剂中孵育的微球的表面上存在较少的结晶物质(图3)。[0166]与不添加赋形剂的多西他赛和紫杉醇的纯制剂相比，符合或的多西他赛或紫杉醇制剂显示出负载至微球上的药物少得多(图4)。在开始混合的3小时之后，大约《10％的多西他赛从溶液负载至微球上。在开始混合的4小时之后，大约《10％的紫杉醇从溶液负载至微球上。[0167]实施例4[0168]对通过抗溶剂沉淀负载药物的tips微球进行冻干不影响紫杉烷从tips微球释放[0169]在抗溶剂沉淀将药物负载至tips微球上之后，微球可以在最后的洗涤阶段(“湿”)之后立即使用，或随后进行干燥以使微球能够长期干燥储存。干燥储存很重要，这是因为微球由plga构成，plga是在暴露于水时会发生水解降解的聚合物。因此，在储存的成品中存在的任何残留的水都将导致微球降解。这将导致微球结构的损失和负载至微球的表面的药物的释放。[0170]微球的扫描电子显微术显示出结晶物质在“湿的”和“干燥的”微球的表面上的相似分布(图5)。[0171]多西他赛的累积释放图显示出在开始的72小时内，“湿的”和“干燥的”负载多西他赛的tips微球的相似的释放速率趋势(图6)。[0172]与球体的起始尺寸和在相同的时间点测量的对照组中的球体相比，从在整个实验获得的图像中计算出的球体直径显示出在尺寸上显著减小，从“湿的”和“干燥的”负载多西他赛的tips微球中收集的灌注液产生了相似的作用(图7)。[0173]实施例5[0174]当以不同温度干燥储存时负载紫杉烷的tips微球是稳定的[0175]负载多西他赛的tips微球的长期稳定性将使该产品能够在临床使用之前储存。确定使负载药物的微球稳定的气候条件很重要。sem成像证实在储存1个月之后在tips微球的表面上存在相当数量的多西他赛(图8)。[0176]实施例6[0177]dtx持续释放针对前列腺癌细胞的细胞毒活性[0178]当置于模拟组织灌注的动态系统中时，观察到从微球中的持续药物释放。使用被设计以模拟在药物-装置组合的预期临床使用期间的体内组织灌注的动态灌注系统研究dtx从tips微球的释放曲线。定期收集含有来自tips微球的dtx的灌注液，并使用紫外吸光度测量dtx的量。dtx的累积释放图显示在5天内释放了负载至tips微球上的dtx总量的大约95％，其中在前24小时期间释放了大约三分之一(图9a)。在超过5天的时间点释放的dtx的量低于用于紫外吸收的系统的检测阈值。因此，使用pc3前列腺癌细胞的两种基于细胞的测定被用于评估在灌注液中的从tips微球释放的dtx是否存在持续的细胞毒活性。集落形成测定显示从直到第10天的所有时间点收集的从tips微球释放到灌注液中的dtx持续对pc3细胞集落的形成具有抑制作用(图9b)。从第1天至第4天收集的灌注液中存在的dtx完全抑制了所有集落的形成。在第5至第8天之间收集的灌注液中进行孵育之后形成的集落少于在不含有dtx的对照组中建立的集落的数量的25％。在第10天形成的集落的数量为在不含有dtx的对照组中建立的集落的数量的约50％。进一步证实持续的细胞毒性作用是通过对最初在dtx-tips灌注液中孵育48小时然后在新鲜的完全培养基中孵育1、5或10天的细胞进行形态学分析而显示的(图9c)。相衬显微术显示出凋亡的特征性形态学特征，其包括核碎裂、由于收缩和胞质浓缩导致的细胞变圆(表明早期凋亡)和凋亡小体(表明晚期凋亡)。[0179]由于dtx负载至微球的表面，因此dtx的释放主要由dtx晶体溶解而控制，而不是通过plga聚合物的降解而控制。dtx晶体随时间缓慢地溶解，维持扩散的浓度梯度并且导致5天内的缓慢释放。这是有益的，因为药物-装置组合将被植入肿瘤切除部位，在该部位处其延长的局部释放将有助于根除在手术期间释放的残留或脱落的肿瘤细胞，使复发的可能性最小化。在dtx释放测定(模拟体内释放和局部活性)的前5天期间dtx释放至灌注液中的量足以在集落形成测定中实现针对pc3细胞的100％毒性，并且相当于大约95％的dtx从微球中释放出来。dtx从微球中的释放持续超过5天，而以每日间隔直至第10天收集的灌注液中存在的dtx的量持续显示有丝分裂阻滞，尽管其低于紫外谱的检测阈值。在较晚的时间点收集的灌注液中孵育的pc3前列腺癌细胞在数量上减少，并且显示出凋亡的典型表型特征。[0180]实施例7[0181]持续的dtx释放针对前列腺癌球体的细胞毒活性[0182]定期收集的从微球释放至灌注液中的药物抑制了集落形成，并且表现出在10天内针对pc3前列腺癌细胞的持续的细胞毒性。在更生理性的3d培养系统中，从dtx-tips组合释放的dtx的细胞毒性如下评估。由pc3细胞构成的3d球体用每天收集的灌注液在12天内进行孵育。含有球体的培养基按每天替代为在相应的天从灌注系统收集的灌注液。与球体的起始尺寸和在相同的时间点测量的对照组中的球体相比，从在整个实验获得的图像中计算的球体直径和体积显示出在尺寸上显著减小(图10a)。在组织培养孔中以2d培养pc3细胞，其暴露于在12天内每天收集的灌注液，表现出与集落形成测定中观察到的相似的细胞毒性的形态学特征(图10b)。用钙黄绿素am(被动进入并染色所有代谢活跃细胞的酶促荧光染料)和乙锭同型二聚体-1(ethd-1；在穿过死细胞的受损的膜之后通过与核酸结合而仅染色死细胞)的live/染色在用在12天期间内收集的灌注液进行孵育的球体上进行(图10c)。在dtx处理的球体和对照球体二者的球体中心都可见死细胞，其表明由于氧气和营养物的扩散限制而存在坏死核心。在第12天的灌注液中将球体暴露于dtx导致球体直径在尺寸上减小。在剩余球体中的pc3细胞对钙黄绿素am和ethd-1的染色呈阳性，但暴露于dtx的球体周围的ethd-1阳性细胞的比例与对照组相比增加。通过在第12天将球体转移至组织培养板，证实了从dtx-tips颗粒释放的dtx针对3d球体培养物的细胞毒性作用。在dtx处理的球体中未见从球体迁移的活细胞，而在对照组中可见细胞从球体迁移。[0183]实施例8[0184]dtx-tips抑制体内肿瘤生长而无全身性毒性[0185]接受ivdtx的小鼠(如在以上实施例1中所述的体内前列腺肿瘤形成和肿瘤治疗)表现出逐渐显著的体重减轻，其表明全身性毒性(图11a)。与接受iv盐水或对照tips微球的小鼠相比，接受dtx-tips的小鼠未观察到显著的体重变化，其表明无全身性毒性。[0186]在接受对照tips微球或iv盐水的小鼠中，肿瘤的体积在研究期间逐渐增加(图11b)。与盐水或对照微球组相比，接受dtx-tips的小鼠的肿瘤体积大幅减小。肿瘤生长抑制在接受ivdtx的小鼠中最为明显。[0187]在第14天，在接受dtxiv和dtx-tips的小鼠之间的肿瘤尺寸增加没有显著差异，其表明dtx-tips在阻止肿瘤生长方面同样有效(图11c)。与接受iv盐水的小鼠和接受对照tips微球的小鼠相比，接受dtx-tips的小鼠在肿瘤尺寸上的增加显著降低。[0188]实施例9[0189]通过抗溶剂沉淀制备的负载多西他赛的tips微球提供无毒性治疗量的dtx的局部和持续释放，其有效地阻止体内肿瘤生长[0190]在pc3异种移植肿瘤模型中，负载多西他赛的tips微球的效力在肿瘤周围注射之后在体内被证实，其中肿瘤生长抑制的水平与用静脉内递送dtx所达到的作用等同。然而，与静脉内递送dtx不同，植入dtx-tips微球不伴有毒性或在器官组织或血浆中升高的dtx全身性水平。[0191]在从非荷瘤balb/canncrl小鼠收集的血浆中研究对体内dtx释放谱的分析。在施用之后的1小时和24小时观察到从tips微球释放的可检测水平的dtx。此后在血浆中未检测到dtx。从每周一次接受i.v.dtx持续三周的组中收集的血浆样品在施用之后的1小时和24小时时含有与dtx-tips组相比显著更高水平的dtx，分别增加102倍和增加8倍(p《0.01)(图12)。施用i.v.dtx导致在48小时和72小时时以及第10天和第15天时的血浆中剩余可检测水平的dtx，其对应于在第7天和第14天递送的第二剂和第三剂i.v.dtx。[0192]在nsg小鼠中使用人前列腺肿瘤异种移植模型在体内研究dtx-tips微球的抗肿瘤活性和全身性毒性。将pc3细胞皮下移植至免疫缺陷的小鼠中。在细胞注射之后第14天，形成了可触及的肿瘤，其测量为0.03至0.05cm3。组织学证实了tips微球( /-dtx)的肿瘤周围递送和在植入部位的保留，以及微球在研究期间保持在原位(图13)。[0193]接受i.v.dtx的小鼠中的肿瘤体积测量值在研究期间没有增加(图14a)。与接受i.v.dtx的小鼠相比，在接受dtx-tips微球的小鼠中，肿瘤体积直到第21天都没有显著增加(p《0.05)。在该时间点，与在同一时间点仅用盐水处理的组相比，在用dtx-tips微球处理的组中的肿瘤体积的增加为大约6倍。与接受i.v.dtx的小鼠相比，在接受仅tips微球或iv盐水的小鼠中，肿瘤体积在第16天(p《0.05)和第14天(p《0.05)分别显著增加。在研究结束时对经切除的肿瘤的定性宏观评估显示了从用dtx处理的组中收集的明显更小的肿瘤(图14b)。[0194]显著毒性与dtx的i.v.递送相关，表现为与起始体重相比，从前面的第7天开始体重逐渐减轻，导致在第28天-7.0％±2.3％和在第35天-12.7％±3.5％(p《0.0001；在第35天，3/7的小鼠体重减轻超过》15％)。相反地，在接受dtx-tips微球、仅tips微球或iv盐水的组中未观察到显著的体重减轻(图14c)。[0195]按照下表1，在施用之后的第1、10和35天分析在移植器官(心脏、肾、肺、脾、肝)中dtx的组织水平。与施用dtx-tips相比，在i.v.施用dtx之后的所有时间点的所有器官中都检测到升高的dtx水平，但在第35天的肝和脾除外，其中任一处理组均未检测到dtx。[0196]表1-在施用dtx-tips微球或i.v.dtx之后的第1、第10和第35天，在来自经移植的器官的组织中测得的dtx浓度(每个时间点每组n＝5至6个样品)。[0197][0198]所有引用的参考文献均整体并入本文。当前第1页12当前第1页12