含有复合蘑菇菌丝体的认知功能或记忆力改善用组合物的制作方法

1.本发明涉及一种含有白桦茸、灵芝以及桑黄等三种复合蘑菇菌丝体的认知功能或记忆力改善用组合物。


背景技术：

2.桑黄(phellinus linteus)也被称之为裂蹄木层孔菌，在东医宝鉴中以桑木耳为名记录于汤药篇中。桑黄生长在桑树的枝干上，除菌盖表面之外均为黄色。在初期貌似团成一团的泥块，而在长成之后变成从树桩上吐出的舌头形状，因此也被称之为树舌。自古以来，桑黄适用于如子宫出血、月经不调等症状的治疗，最近还有报告指出其具有优秀的肿瘤抑制、免疫力强化以及美白效果。
3.灵芝(ganoderma lucidum)在夏季生长于阔叶树的树根。灵芝还被称之为秦始皇的不老草，在本草纲目中还将其与人参同列于上等药材之列。灵芝具有如强身健体、镇咳、消肿等功效，对如呼吸系统疾病、神经衰弱、心脏病、高血压等症状有良好的治疗效果，还可以降低胆固醇且具有抗癌效果。
4.白桦茸(inonotus obliquus)是在生长于俄罗斯、加拿大、日本北海道等寒冷地区的桦树、赤杨树等中寄生的菌核。美国也将白桦茸分类为特殊天然物质并用于未来医药以及保健食品的开发。在韩国民间为胃癌患者以及糖尿病患者使用白桦茸的结果报告指出，其效果比其他蘑菇类更加优秀。除此之外，还有报告指出白桦茸具有增加身体抵抗力、抑制肿瘤生长以及美白等效果。
5.此外，为了将所述蘑菇类适用于医药品、功能性食品的混合原材料，需要采摘子实体的蘑菇进行使用，但是蘑菇本身在自然状态下并不易于繁殖，而且还会因为过度采摘而导致资源枯竭以及生态系统破坏的问题。为了实现产业应用级别的原材料供应，需要消耗大量的生产设施以及经费，因此并不能满足大批量生产的需求。如上所述，虽然所述蘑菇类作为抗癌剂或免疫强化剂具有一定的效果，但是因为其供应比较有限且大批量生产以及快速生产困难而难以得到普遍应用。因此，对于所述蘑菇，最近正在积极开展可以呈现出与蘑菇菌的子实体同等效果的菌丝体的大批量培养方法相关研究。
6.在大韩民国注册专利第10-922311号中公开了一种对白桦茸、桑黄、灵芝、绣球菌以及冬虫夏草菌丝体进行复合培养的方法，在大韩民国注册专利第10-135648号中公开了一种白桦茸、桑黄以及灵芝的复合培养方法，在大韩民国注册专利第10-1652035号中公开了一种白桦茸、桑黄以及绣球菌的复合蘑菇菌丝体的培养方法。但是，复合培养菌丝体会因为其培养条件而在菌丝体所具有的自身酶活性或β葡聚糖含量等方面出现差异，而且在利用其加工食品时也会呈现出各不相同的味道和风味等。
7.在韩国，伴随着人口的快速老龄化，痴呆症的患病率也在迅速上升，而且有调查结果表明，虽然对痴呆症的警惕性较高，但是对痴呆症症状的认知度却低于世界平均水平。尤其是因为痴呆症的症状进展缓慢，因此只要可以及早到医院就诊并获得准确的诊断就有足够的可能性得到好转，但是很多人因为错过最佳治疗时期而在短时间内发展成严重的痴呆
症，从而不仅会导致生活品质的急剧下降，而且还会对家人造成严重的影响，所以这已经发展成为了严重的社会问题。因此，痴呆症的早期诊断是至关重要的元素。
8.大脑由数百亿个神经细胞构成且占据着体重的大约2％，也是消耗体内的氧气中的20％以及葡萄糖中的25％的器官。神经细胞是已经被高度分化的细胞，因此受损之后的再生能力非常有限，而且非常容易受到氧化应激损伤。这是因为大脑中具有抗氧化功能的谷胱甘肽的含量较低，而且在神经细胞的细胞膜中含有很多如二十二碳六烯酸(dha)或花生四烯酸等不饱和脂肪酸，因此是很容易受到因为过氧化而导致的氧化应激损伤的器官。
9.痴呆症是一种因为多种原因而诱发大脑功能的损伤的疾病，会导致包括记忆力在内的方向辨别能力、语言能力以及判断能力等认知功能的下降并因此导致日常生活以及社会生活困难，痴呆症大体上可以分为三种类型且分别因为不同的原因而诱发。
10.第一，阿尔茨海默痴呆症是最常见的痴呆症(占据大约70％)，是因为渐进地发生大脑的退行性变化而导致包括记忆力在内的大脑的整体认知功能下降的疾病。虽然目前还难以根治疾病，但是已经开发出了可以改善并延缓症状的药剂。伴随着大量研究的开展，发现了参与阿尔茨海默症的蛋白质，但是其发病原因目前还没有得到明确。但是，对患者病故之后的脑组织进行分析的结果报告指出，有因为在神经细胞之间蓄积β-淀粉样肽而形成的淀粉样蛋白斑(amyloid plaques)以及因为神经细胞内的过磷酸化的微管相关蛋白丝而形成的神经纤维缠结(neurofibrillary tangles)存在。β-淀粉样肽由36～43个氨基酸构成，且β-淀粉样肽的蓄积是早于脑损伤和神经纤维缠结发展的一种早期病因，目前已经被认定为一种定论，因此正在积极开展与此相关的研究活动，最近作为阿尔茨海默症的治疗方法，正在开展与β-淀粉样肽的生成抑制或去除方法相关的研究活动。
11.血管性痴呆症是因为脑血管疾病造成的脑组织损伤而导致的痴呆症，常发生于患有如高血压、糖尿病、高血脂以及心脏病等脑卒中危险因子的患者。只要认真地对危险因子进行管理，就可以进行预防，而且只要在早期进行治疗，就可以防止其进一步发生恶化。其他痴呆症包括因为药物中毒、脑肿瘤等多种原因而导致的其他未经分类的痴呆症。
12.此外，即使不是痴呆症，呈现出认知功能下降的症状但不会对日常生活造成影响的程度的症状被称之为轻度认知功能障碍，而在这个阶段会呈现出如不进一步恶化、逐渐恶化以及逐渐恢复等多种不同的形态。尤其是目前已经得知韩国65岁以上人口中的25％具有轻度认知功能障碍症状。在如上所述的情况下，可以最有效地帮助抑制可早期发现以及治疗的认知功能的下降。
13.为此，本发明人确认了通过复合培养发获得的三种蘑菇的菌丝体以及利用所述菌丝体的组合物具有增强记忆力、改善痴呆症症状等认知改善功效，从而将其作为所述症状的治疗或改善用组合物提供并完成了本发明。
14.先行技术文献
15.专利文献
16.(专利文献1)大韩民国注册专利第10-1923408号(发明的名称：白桦茸、灵芝以及桑黄菌丝体的复合培养方法，申请人：株式会社giunchan，注册日期：2018年11月23日)
17.(专利文献2)大韩民国注册专利第10-1652035号(发明的名称：白桦茸、桑黄以及绣球菌的复合蘑菇菌丝体的生产方法，申请人：株式会社giunchan，注册日期：2016年08月23日)
18.(专利文献3)大韩民国注册专利第10-1358648号(发明的名称：利用蘑菇提取物的白桦茸、桑黄以及灵芝的复合培养方法，申请人：leetaebong，注册日期：2014年01月28日)
19.(专利文献4)大韩民国注册专利第10-1269410号(发明的名称：利用蘑菇培养基的白桦茸、桑黄、灵芝、绣球菌以及冬虫夏草的复合培养方法，申请人：leetaebong，注册日期：2013年05月24日)
20.(专利文献5)大韩民国注册专利第10-0922311号(发明的名称：生成包含活性化的糖相关化合物的白桦茸、桑黄、灵芝、绣球菌以及冬虫夏草的复式培养方法，申请人：leetaebong，注册日期：2009年10月12日)


技术实现要素：

21.本发明的目的在于提供一种含有白桦茸、灵芝以及桑黄等三种复合蘑菇菌丝体的认知功能或记忆力改善用组合物。
22.本发明涉及一种含有白桦茸、灵芝以及桑黄等三种复合蘑菇菌丝体或所述之提取物的认知功能或记忆力改善用组合物。
23.所述组合物可以作为痴呆症的预防或治疗用药学组合物使用。此外，所述组合物也可以作为痴呆症的预防或改善用保健功能食品提供。
24.所述复合蘑菇菌丝体的培养步骤，可以包括：(第一步骤)在将白桦茸、灵芝以及桑黄的子实体组织分别接种到马铃薯葡萄糖琼脂(pda，potato dextrose agar)并进行单独培养而使得各个蘑菇达到菌丝体状态的步骤；
25.(第二步骤)将在第一步骤中培养出的各个白桦茸、灵芝以及桑黄的三种菌丝体混合接种到马铃薯葡萄糖培养液(pdb，potato dextrose broth)中的步骤；
26.(第三步骤)通过对接种到马铃薯葡萄糖培养液(pdb，potato dextrose broth)中的三种菌丝体进行4～6周的液体培养而获得复合培养菌丝体的步骤；以及，
27.(第四步骤)将通过第三步骤的培养获得的复合培养菌丝体接种到青稞培养基并进行培养的步骤.(培养的菌丝体进行4～7周的追加培养而获得复合蘑菇菌丝体的步骤。)
28.所述第三步骤中的菌丝体液体培养，是在10～30％的相对湿度、25～30℃下执行为宜。此外，在初始的1～2周之内进行静置培养但以每天1～2次每次1～5分钟的周期进行搅拌为宜，接下来在以50～150rpm进行搅拌的同时进行振荡培养将有利于菌丝体的培养。
29.所述第四步骤中的青稞培养基，可以通过在对青稞进行4～8小时的水浸之后再进行脱水，接下来在以所脱水的青稞100重量份为基准添加碳酸钙0.5～2重量份之后在120～125℃下进行30～2小时的灭菌处理而获得。
30.所述第三步骤中的菌丝体液体培养，是在40～60％的相对湿度、25～30℃下执行为宜，且在静置培养的同时以一天为周期进行1～2次、1～5分钟的搅拌为宜。
31.在本发明中用于蘑菇菌丝体培养的马铃薯葡萄糖琼脂(pda，potato dextrose agar)，可以通过对以总体积1l为基准包含马铃薯淀粉3～5g、葡萄糖10～30g，琼脂糖10～30g的混合物进行灭菌而制造。此时，可以加水至总体积达到1l。
32.所述灭菌至少在1.3～1.7大气压、120～125℃下执行15～20分钟为宜，而且可以相同地适用于所有培养基的灭菌条件。
33.作为马铃薯葡萄糖琼脂(pda，potato dextrose agar)的最佳制造条件，可以通过
在向马铃薯淀粉4g、葡萄糖20g以及琼脂糖15g加水至总体积达到1l之后进行灭菌而获得。
34.此外，在本发明中用于蘑菇菌丝体培养的马铃薯葡萄糖培养液(pdb，potato dextrose broth)，可以通过在马铃薯葡萄糖琼脂(pda，potato dextrose agar)的制造条件中利用水替代琼脂糖而制造。作为马铃薯葡萄糖培养液(pdb，potato dextrose broth)的最佳制造条件，可以通过在向马铃薯淀粉4g以及葡萄糖20g加水至总体积达到1l之后进行灭菌而获得。
35.在所述第一步骤中对各蘑菇子实体进行单独培养时，在将各个蘑菇子实体碎片分别接种到马铃薯葡萄糖琼脂(pda，potato dextrose agar)之后再在25～30℃下进行1～3周培养为宜，此时的培养期间，可以根据蘑菇子实体个体所具有的生长能力在1～3周范围内进行适当的调节。此外，在所述条件下进行培养时的相对湿度为10～60％为宜。当湿度未满10％或超过60％时，可能会减缓菌丝体的生长速度。
36.但是，当培养期间未满1周时菌丝体可能无法生长到可在日后对液体培养进行活性化的程度，而且当超过3周时也可能导致在日后的液体培养时无法有效培养菌丝体的问题。此外，当培养温度未满25℃或超过30℃时，同样可能会对液体培养时的菌丝体培养造成不良影响。
37.在所述第二步骤中将三种菌丝体复合接种到马铃薯葡萄糖培养液(pdb，potato dextrose broth)中时，只要将第一步骤中所培养的各个蘑菇的菌丝体以大致类似的量进行接种即可，但较佳地，在将各个所培养出的菌丝体切割成0.5～2mm2之后以各个蘑菇菌丝体3～7片的的量将三种菌丝体复合接种到马铃薯葡萄糖培养液(pdb，potato dextrose broth)中为宜。
38.在所述第三步骤中，在25～30℃下执行菌丝体的培养为宜，尤其是，当培养温度未满25℃时可能会导致菌丝体无法有效生长的问题，而当超过30℃时同样可能会导致菌丝体的培养缓慢的问题。此外，在初始的1～2周之内进行静置培养但以每天1～2次每次1～5分钟的周期进行搅拌为宜，接下来在以50～150rpm进行搅拌的同时进行振荡培养将有利于菌丝体的培养。
39.此外，在所述条件下进行培养时的相对湿度并不受到严格限制，但较佳地将相对湿度控制在10～30％为宜。
40.在所述第四步骤中，可以在青稞培养基中将通过第三步骤的培养获得的菌丝体以培养液状态各接种1～10ml。此时，如果所接种的菌丝体培养液未满1ml，可能会因为菌丝体的量过少而导致追加培养不良的问题，而如果所接种的培养液超过10ml，也可能会导致培养的活性化程度过低的问题。
41.所述第四步骤中的青稞培养基，可以通过在对青稞进行4～8小时的水浸之后再进行脱水，接下来在以所脱水的青稞100重量份为基准添加碳酸钙0.5～2重量份之后在120～125℃下进行30～2小时的灭菌处理而获得。此时，如果使用没有被水充分浸泡的水浸时间未满4小时的青稞，会因为菌丝体培养时的水分不足而导致无法有效地将青稞作为营养源使用的问题，而如果水浸时间超过8小时，因为青稞并不能吸收更多的水分而只会导致制造时间延长的问题。
42.在所述第四步骤中，在25～30℃下执行培养为宜。当培养温度未满25℃时可能会导致菌丝体无法有效生长的问题，而当超过30℃时同样可能会导致菌丝体的培养缓慢的问
题。此外，在所述条件下进行培养时的相对湿度为40～60％为宜。当湿度未满40％或超过60％时，可能会减缓菌丝体的生长速度。
43.所述三种复合蘑菇菌丝体提取物可以将水、c1～c4醇或所述之混合溶液作为溶剂对三种复合蘑菇菌丝体进行提取，所述c1～c4醇可以从由甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇以及异丁醇构成的组中选择。较佳地，可以使用水作为溶剂并在相对于三种复合蘑菇菌丝体的重量添加5～20倍重量的70～75℃的热水进行8～15小时的提取之后对液相进行冻结干燥。
44.作为制造所述三种复合蘑菇菌丝体提取物时所使用的水、c1～c4醇或所述之混合溶液，可以使用以三种复合蘑菇使用重量为基准的1～40倍体积(以1kg为基准时为l～40l)，较佳地可以使用5～40倍体积。所述三种复合蘑菇菌丝体提取物的提取条件可以是20～100℃以及1分钟～48小时。所述过程可以重复1～4次。
45.此外，作为本领域的常规方法，可以在将所述三种复合蘑菇菌丝体的水、c1～c4醇或所述之混合溶液提取物溶解到水中之后，利用从由正己烷、二氯甲烷、丙酮、氯仿、乙酸乙酯以及正丁醇构成的组中选择的一种以上的溶剂追加分馏而制造出分馏物。
46.作为又一种方法，可以在向通过将三种复合蘑菇菌丝体利用水、c1～c4醇或所述之混合溶剂提取浓缩而获得的三种复合蘑菇菌丝体提取物添加水进行悬浮，较佳地在添加三种复合蘑菇菌丝体提取物重量的1～1000倍、更较佳地添加1～500倍、最较佳地添加1～50倍的水进行悬浮之后，制造出通过向所述悬浮物添加从由己烷、氯仿、乙酸乙酯以及丁醇构成的组中选择的溶剂而获得的所述三种复合蘑菇菌丝体分馏物较佳地，可以是在向通过将三种复合蘑菇菌丝体利用水、c1～c4醇或所述之混合溶剂提取浓缩而获得的三种复合蘑菇菌丝体提取物添加水进行悬浮之后与己烷进行混合而获得的己烷层的浓缩物、或通过向去除所述己烷层之后剩余的残渣(水层)混合氯仿而获得的氯仿层的浓缩物、或通过向去除所述氯仿层之后剩余的残渣(水层)混合乙酸乙酯而获得的乙酸乙酯层的浓缩物、或通过向去除所述乙酸乙酯层之后剩余的残渣(水层)混合丁醇而获得的丁醇层的浓缩物、或去除所述丁醇层之后剩余的残渣(水层)的浓缩物。此外，其他分馏条件并不受到特殊的限定，但是可以通过在向所述三种复合蘑菇菌丝体添加三种复合蘑菇菌丝体提取物的重量的1～50倍的水而制造出悬浮物之后，再添加与所述水等量的从由己烷、氯仿、乙酸乙酯以及丁醇构成的组中选择的溶剂的方式进行分馏。此外，在向去除己烷层之后剩余的残渣添加氯仿、向去除氯仿层之后剩余的残渣添加乙酸乙酯、向去除乙酸乙酯层之后剩余的残渣添加丁醇时，即按顺序逐步执行时，也可以通过依次添加与残渣等量的各个溶剂(氯仿、乙酸乙酯或丁醇)的方式进行分馏。
47.所述提取物或其分馏物的制造温度可以是20至100℃，但是并不限定于此。提取或分馏时间并不受到特殊的限定，但是在10分钟值2天之内进行提取为宜，而作为提取用容器可以使用常见的提取设备、超声波粉碎提取设备或分馏设备。通过如上所述的方式制造出的提取物或分馏物可以通过热风干燥、减压干燥或冻结干燥的方式去除溶剂。此外，所述提取物或分馏物可以在利用柱层析进行提纯之后使用。
48.所述提取物可以根据常规方法，单独使用利用有机溶剂(如乙醇、乙醚、丙酮等)的提取、己烷以及水的分配、利用柱层析的方法等、在植物体成分的分离提取中使用的公知方法或适当地组合使用如上所述的方法进行分馏或提纯之后使用。
49.所述柱层析可以从硅胶柱层析(silica gel column chromatography)、lh-20柱层析(lh-20 column chromatography)、离子交换树脂层析(ion exchange resin chromatography)、中压液相层析(medium pressure liquid chromatography)、薄层层析(tlc；thin layer chromatography)、硅胶真空液相层析(silica gel vacuum liquid chromatography)以及高效液相层析(high performance liquid chromatography)中选择。
50.本发明可以提供一种含有三种复合蘑菇菌丝体或所述之提取物以及药剂学赋形剂的认知功能或记忆力改善用药学组合物。此外，所述药学组合物还可以作为痴呆症预防或治疗用药学组合物使用。
51.所述药学组合物，可以分别通过一般的方法以如散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浊液、乳液、糖浆、气雾等经口剂型或外用剂、栓剂以及灭菌注射溶液的形态进行制剂化后使用。作为可包含于所述药学组合物中的载体、赋形剂以及稀释剂，包括如乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉，硬脂酸镁以及矿物油。在进行制剂化时，使用通常所使用的如填充剂、增量剂、结合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂等稀释剂或赋形剂进行调配。作为经口给药的固态制剂，包括如片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等，而如上所述的固态制剂是通过在适用本发明的复合蘑菇菌丝体中混合一种以上的如淀粉、碳酸钙、蔗糖或乳糖、明胶等赋形剂的方式进行制造。而且，除了单纯的赋形剂之外，还使用如硬脂酸镁、滑石粉等润滑剂。作为经口给药的液态制剂，包括如悬浊液、内溶液剂、乳剂、糖浆等，除了通常所使用的单纯稀释剂即水、液体石蜡之外，还可以包含如湿润剂、甜味剂、芳香基、保存剂等多种赋形剂。作为非经口给药的制剂，包括如灭菌水溶液、非水性溶剂、悬浊剂、乳剂、冻结干燥制剂、栓剂。作为非水性溶剂、悬浊剂，可以使用如丙二醇、聚乙二醇、橄榄油等植物性油以及如油酸乙酯等可注射的酯类等。作为栓剂的基剂，可以使用如混合脂肪酸甘油酯(witepsol)、聚乙二醇、吐温(tween)61、可可脂、月桂酸酯、甘油明胶等。
52.适用本发明的药学组合物的给药量，可能会根据治疗对象的年龄、性别、体重、治疗目标疾病或病理状态、疾病或病理状态的严重程度、给药路径以及处方医师的判断而有所不同。相关从业人员可以以上数因素为基础决定给药量，一般的给药量在0.01水浸/kg/天至2000水浸/kg/天的范围之内。更较佳的给药量为1水浸/kg/天至500水浸/kg/天。在给药时，可以每天进行一次给药，也可以分成数次进行给药。所述给药量在任何方面都不是对本发明的范围做出的限定。
53.适用本发明的药学组合物，可以通过多种途径给药至如老鼠、家畜、人类等哺乳动物。可以通过所有方式进行给药，例如可以通过经口、直肠或静脉、肌肉、皮下、子宫内膜或脑血管内注射的方式进行给药。适用本发明的复合培养菌丝体技术没有毒性以及副作用，因此是即使以预防为目的长时间服用时也可以安心使用的药剂。
54.此外，本发明提供一种含有三种复合蘑菇菌丝体或所述之提取物以及各种食品赋形剂的认知功能或记忆力改善用保健功能食品。此外，所述保健功能食品也可以作为痴呆症预防或改善用保健功能食品使用。上述菌丝体，可以在适用本发明的保健功能食品中以0.001～100重量％进行添加。适用本发明的保健功能食品，包括如片剂、胶囊剂、丸剂或液
剂等形态，作为可以添加适用本发明的提取物的食品，包括如各种饮料、肉类、香肠、面包、糖果类、快餐类、面类、冰激凌、乳制品、汤羹、离子饮料、饮用水、酒精饮料、口香糖、茶以及维生素复合剂等。
55.本发明涉及一种含有复合蘑菇菌丝体的认知功能改善用组合物的制造方法。因为所述复合蘑菇菌丝体的增强记忆力、改善空间认知能力、抑制脑神经细胞中的炎症反应的功效优秀，因此可以作为包括血管性痴呆症、阿尔茨海默痴呆症在内的老年大脑疾病的改善效果优秀的药学组合物或保健功能食品进行提供。
附图说明
56.图1a至图1d是对在巴恩斯迷宫试验(barnes maze test)中的三种复合蘑菇菌丝体提取物的记忆力下降改善效果进行图示的结果图表。(图1a：移动距离，图1b：移动速度，图1c：避难处到达时间，图1d：动线分析)
57.图2a以及图2b是对三种复合蘑菇菌丝体提取物在痴呆症大鼠中对避难处探索以及停留时间造成的影响进行图示的结果图表。(图2a：避难处探索动线，图2b：避难处停留时间)
58.图3a以及图3b是对在y迷宫试验(y maze test)中的三种复合蘑菇菌丝体的记忆力恢复效果进行图示的结果图表。(图3a：自发更迭(spontaneous alternation)，图3b：总次数(total entries))
59.图4a以及图4b是对在被动回避试验(passive avoidance test)中的三种复合蘑菇菌丝体的记忆力恢复效果进行图示的结果图表。(图4a：步入潜伏期(step-through latency)，图4b：逃避潜伏期(escape latency))
60.图5a以及图5b是对三种复合蘑菇菌丝体的海马体ca1区域神经细胞杀灭抑制效果进行图示的结果图表。(图5a：海马体ca1区域染色，图5b：神经细胞数量)
61.图6a至图6d是对三种复合蘑菇菌丝体对bv2小神经胶质细胞炎症反应的抑制活性进行图示的结果图表。(图6a：生长(growth)，图6b：一氧化氮(no)，图6c：肿瘤坏死因子-阿尔法(tnf-α)，图6d：白介素-6(il-6))
具体实施方式
62.接下来，将对适用本发明的较佳实施例进行详细的说明。但是，本发明并不限定于在此说明的实施例，还可以以其他形态实现。在此说明的实施例只是为了更加彻底且完整地公开所介绍的内容，并向相关从业人员充分传递本发明的思想。
63.《实施例1.蘑菇菌丝体的复合培养》
64.在对白桦茸、灵芝以及桑黄的子实体组织进行分离并接种到马铃薯葡萄糖琼脂(pda)之后，在27～29℃下对各个蘑菇的菌丝体进行2周的培养。在准备以100ml为单位细分的马铃薯葡萄糖培养液(pdb)之后，利用解剖刀将在马铃薯葡萄糖琼脂(pda)中培养的各个蘑菇菌丝体切割成1mm2，然后向装有马铃薯葡萄糖培养液(pdb)的每个三角烧瓶分别混合接种所切割的三种菌丝体各五片。
65.将混合接种各个菌丝体的培养基在生物需氧量培养器(bodincubator，bio-oxygen demand培养器，低温培养器)中以27～28℃、湿度20％的条件进行1周的静置培养，
且在培养期间内每天搅拌约1分钟左右。在1周之后将复合接种并进行培养的烧瓶移动到振荡培养器中并在27℃、100rpm条件下进行4周的培养，从而制造出三种复合蘑菇菌丝体培养液。
66.在对青稞进行6小时的水浸之后再进行8小时的脱水，接下来以经过脱水的青稞100g为基准添加1g的碳酸钙并均匀混合，然后利用高压灭菌器在121℃下进行1小时的灭菌而制造出青稞培养基。在完成灭菌之后冷却至25℃的青稞培养基每1kg中，将经过5周培养的复合蘑菇菌丝体培养液分株接种各5ml。在完成接种之后，在温度维持26～28℃且湿度维持45～50％的培养室中进行30天的培养。对于完成培养的复合蘑菇菌丝体，在包含青稞的状态下利用干燥器在57～60℃下进行24小时的干燥并利用针磨粉碎器进行粉碎而制造成粉末。
67.其中，本发明发与在大韩民国注册专利第10-1923408号的实施例1种公开的方法相同。
68.《比较例1至比较例8.比较条件蘑菇的培养》
69.比较例1
70.在实施例1的方法中没有复合接种三种蘑菇的菌丝体，而是仅将白桦茸菌丝体单一接种到马铃薯葡萄糖培养液(pdb)中，而接下来按照相同的过程进行培养。
71.比较例2
72.在实施例1的方法中并没有复合接种三种蘑菇的菌丝体，而是仅将灵芝菌丝体单一接种到马铃薯葡萄糖培养液(pdb)中，而接下来按照相同的过程进行培养。
73.比较例3
74.在实施例1的方法中并没有复合接种三种蘑菇的菌丝体，而是仅将桑黄菌丝体单一接种到马铃薯葡萄糖培养液(pdb)中，而接下来按照相同的过程进行培养。
75.比较例4
76.在实施例1的方法中省略马铃薯葡萄糖培养液(pdb)培养步骤，而是将三种蘑菇的菌丝体直接接种到青稞培养基中，同时将培养期间增加与马铃薯葡萄糖培养液(pdb)培养步骤相同的期间。
77.比较例5
78.在实施例1的方法中执行马铃薯葡萄糖培养液(pdb)培养步骤之后，再次接种到新的马铃薯葡萄糖培养液(pdb)中并追加执行30天的液体培养(省略在青稞培养基中进行培养的过程)。
79.比较例6
80.按照大韩民国注册专利第10-1652035号的制造例1以及实施例1中的方法制造出白桦茸、桑黄以及绣球菌的复合蘑菇菌素体。
81.比较例7
82.与比较例2相同，按照按照大韩民国注册专利第10-1652035号的制造例1以及实施例1中的方法制造出复合蘑菇菌素体，其中利用灵芝替代绣球菌制造出复合蘑菇菌丝体。
83.比较例8
84.按照大韩民国注册专利第10-1358648号的实施例1中的方法制造出白桦茸、灵芝以及桑黄菌丝体的复合蘑菇菌素体。
85.《试验例1.试验动物以及细胞的准备》
86.将sd大鼠(rat)(雄性，8周龄)分成每组7只，将三种蘑菇复合菌丝体5mg/kg(试料-l)或15mg/kg(试料-h)利用1ml的蒸馏水进行稀释，并按照1天1次的剂量经口给药共计3周。作为安慰剂(vehicle)使用了蒸馏水(vehicle)。在各个组的给药结束1天之后，通过双侧颈总动脉阻塞及血容量减少(bilateral common carotid artery occlusion and hypovolemia)(2vo/h)手术制造出血管性痴呆症大鼠(rat)模型，并在执行如下所述的试验之后与对照组(normal)的结果进行了比较。
87.此外，对三种复合蘑菇菌丝体对小神经胶质细胞即bv2细胞的炎症反应的抑制活性进行了测定。
88.《试验例2.巴恩斯迷宫试验(barnes maze test)》
89.准备从地面相距1.2m且穿孔形成20个圆形孔的巴恩斯(barnes)迷宫，并在圆形孔中的某一个的下侧形成了避难处(platform)。在迷宫上方安装了用于提供厌恶刺激的发光二极管(led)，而且利用连动的视频追踪系统(video-tracking system)对动线进行跟踪并对到达避难处的时间以及距离等进行了分析。
90.为了对避难处到达能力进行评估，将每天一次共计四天的最多2分钟之内从相同地点到避难处的移动内容用于分析。与此相反，为了对避难处探索能力进行评估，在四天的避难处到达能力评估结束之后立即暂时从原来形成有避难处的孔中移除避难处，接下来将2分钟之内在迷宫中查找避难处的移动内容用于分析。
91.与其相关的结果如图1a至图1d所示，在所有组中从第一天直至第四天，到达避难处所消耗的移动距离以及时间均逐渐缩短。
92.但是，通过手术诱发血管性痴呆症但没有进行特别处理的安慰剂组(vehicle)与其他组相比，其移动距离以及时间的缩短斜率相对较低。
93.与其相比，利用三种复合蘑菇菌丝体提取物进行给药的试料-l给药组以及试料-h给药组与安慰剂组(vehicle)相比，其移动距离以及时间均显著缩短，而且这种趋势依赖于给药浓度。
94.此外，在避难处探索能力试验中，对照组(normal)在原来形成有避难处的象限上停留50％以上进行探索活动，但是安慰剂组(vehicle)组与对照组(normal)相比，在目标象限上的停留时间明显缩短(图2a以及图2b)。即，因为诱导血管性痴呆症而导致的认知功能的下降，查找避难处并在其中停留的时间变短。与此相反，在利用三种复合蘑菇菌丝体提取物进行给药的试料-l以及试料h处理组中虽然没有认定浓度依赖性，但是与安慰剂组(vehicle)相比，在目标向线上的停留时间明显增加。
95.《试验例3.y迷宫试验(y maze test)》
96.在完成巴恩斯迷宫试验(barnes maze test)的第四天，将各个大鼠(rat)放置在利用y字形状的黑色塑料制作的迷宫中。对于各个大鼠(rat)，对8分钟之内移动到分别命名为a、b、c的三个臂(arm)的总次数(total entries；体现运动能力)以及交替地移动到三个臂(arm)的次数(自发更迭(spontaneous alternation)；体现记忆力)进行了分析。
97.分析结果表明，所有组在总次数(total entries)方面呈现出了相同的结果，表明在运动能力方面所有组几乎没有差异(图3b)。但是，在自发更迭(spontaneous alternation)方面，安慰剂组(vehicle)组与对照组(normal)相比呈现出了较低的数值，借
α(tnf-α，tumor necrosis factor-α)以及白介素-6(il-6，interleukin 6)等进行定量的方式进行了判定。
108.小神经胶质细胞是在大脑中诱导炎症并诱发如痴呆症等大脑病变的细胞，所述细胞的炎症反应抑制直接与痴呆症以及认知功能的改善相关。
109.对于利用脂多糖(lps)诱导的bv2小神经胶质细胞炎症反应，三种复合蘑菇菌丝体可以明显地抑制一氧化氮(no)、肿瘤坏死因子-α(tnf-α)以及细胞白介素-6(il-6)等炎症介质的生成(图6a至图6d)。通过所述结果可以证明，三种复合蘑菇菌丝体提取物的认知功能改善效果与小神经胶质细胞的炎症反应抑制相关。
110.《试验例7.β-淀粉样肽的凝聚阻碍活性确认》
111.通过荧光分析法(thioflavint assay)对实施例1的复合蘑菇菌丝体所具有的对退行性神经疾病诱发原因物质即β-淀粉样肽的凝聚缓解效果进行了测定。使用了5μm浓度的β-淀粉样肽(aβ1-42)，使用前在-80℃下进行保管。将各个提取物利用蒸馏水稀释成不同的试验浓度。为了确定aβ1-42凝聚抑制程度，向92.5μl的0.01m磷酸钠缓冲溶液分别添加5μl的各个试料提取物并添加2.5μl的5μm的aβ1-42之后在37℃下进行26小时的反应，然后添加2,000μl的5μm的硫黄素t并利用荧光分光分析仪进行了测定。此时，所处理的各个试料的最终浓度为1μg/ml。
112.在表1中，以未处理组的凝聚值为基准对比显示了相关的结果，可以确认实施例1的菌丝体的提取物对β-淀粉样肽的凝聚阻碍效果最为优秀。
113.【表1】
114.各个菌丝体提取物淀粉样肽凝聚抑制率实施例195.38比较例123.20比较例233.21比较例331.25比较例434.24比较例545.28比较例651.34比较例753.12比较例854.12
115.《制剂例1.药学制剂》
116.制剂例1-1.片剂的制造
117.将200g的本发明实施例1的复合蘑菇菌丝体与175.9g的乳糖、180g的土豆淀粉以及32g的胶体硅酸进行混合。在向所述混合物添加10％的明胶溶液之后进行粉碎并使其通过14目筛子。利用在对其进行干燥之后添加160g的土豆淀粉、50g的滑石以及5g的硬脂酸镁而获得的混合物制造出片剂。
118.《制剂例2.食品制造》
119.制剂例2-1.烹饪用调味料的制造
120.将本发明实施例1的复合蘑菇菌丝体以1重量％添加到烹饪用调味料中，从而制造出了保健功能性烹饪用调味料。
121.制剂例2-2.面粉食品的制造
122.在本发明实施例1的复合蘑菇菌丝体以0.1重量％添加到面粉中，并利用所述混合物制造出面包、蛋糕、曲奇、饼干以及面条而制造出了保健功能性食品。
123.制剂例2-3.汤汁以及肉汁(gravies)的制造
124.将本发明实施例1的复合蘑菇菌丝体以1重量％添加到汤汁以及肉汁中，从而制造出了保健功能性汤汁以及肉汁。
125.制剂例2-4.乳制品(dairy products)的制造
126.将本发明实施例1的复合蘑菇菌丝体以0.1重量％添加到牛奶中，并利用所述牛奶制造出了如奶酪以及冰淇淋等多种乳制品。
127.制剂例2-5.蔬菜汁的制造
128.将0.5g的本发明实施例1的复合蘑菇菌丝体添加到1,000ml的番茄汁或胡萝卜汁中，从而制造出了保健功能性蔬菜汁。
129.制剂例2-6.果汁的制造
130.将0.1g的本发明实施例1的复合蘑菇菌丝体添加到1,000ml的苹果汁或葡萄汁中，从而制造出了保健功能性果汁。