一种铁死亡抑制剂及其应用的制作方法

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1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种铁死亡抑制剂及其应用。


背景技术：

2.铁死亡(ferroptosis)是一种铁依赖性的，区别于细胞凋亡、细胞坏死、细胞自噬的新型的细胞程序性死亡方式。铁死亡已在神经退行性疾病、肿瘤、心血管疾病等多种疾病发展过程中得到验证。铁死亡与脂质过氧化(lipidperoxidation)密切相关，且取决于活性氧(reactive oxygen species,ros)水平和铁代谢。形态学上，铁死亡主要表现为线粒体收缩、膜密度增加、线粒体嵴减少或消失，因此，铁死亡是有别于其他细胞死亡模式的新生物学调控过程。
3.老年性黄斑变性(age-related macular degeneration,amd)是老年人不可逆的视力损伤、甚至致盲的重要眼底疾病。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题在于提供染料木素(genistein)作为铁死亡抑制剂的应用，不仅能够为amd的治疗提供重要的参考价值，同时可以作为治疗其他以铁死亡为靶点的疾病(如肿瘤、神经退行性疾病、心脑血管疾病等) 的新型抑制剂。
5.本发明所要解决的技术问题采用以下的技术方案来实现：
6.本发明的目的之一是提供染料木素作为铁死亡抑制剂的应用。
7.本发明的目的之二是提供染料木素在制备治疗老年性黄斑变性药物中的应用。
8.本发明的目的之三是提供染料木素在制备治疗以铁死亡为靶点的疾病药物中的应用。优选地，所述疾病包括糖尿病、神经退行性疾病、肿瘤、心血管疾病、呼吸系统疾病、帕金森病、缺血再灌注损伤。
9.所述治疗老年性黄斑变性或治疗以铁死亡为靶点的疾病的药物包含染料木素或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体和/或辅料。
10.所述药物的剂型为口服制剂、注射制剂、喷雾剂、眼用剂型。优选地，所述眼用剂型包括滴眼液、眼药膏、眼部喷剂、眼用凝胶、眼贴、眼内注射剂、眼用微球、眼部植入片、眼周注射剂、眼用缓释制剂
11.本发明利用naio3损伤rpe细胞建立amd模型：碘酸钠(naio3)是一种氧化剂，可选择性地作用于rpe细胞，抑制细胞中离子泵及ⅱ型碳酸酐酶的活性，增加膜的通透性，使细胞内线粒体、内质网等细胞器水肿，rpe细胞功能发生障碍，最终导致感光细胞功能异常，建立老年性黄斑变性细胞模型。
12.本发明的有益效果是：本发明采用染料木素作为新型铁死亡抑制剂，对由naio3损伤rpe细胞建立的amd模型具有保护作用，能够清除氧自由基，增强抗氧化能力，从而有效保护光感受器细胞免受naio3诱导的视网膜损伤；同时能够抑制ho-1表达，增加gpx4抗氧化信号通路，对铁死亡相关信号通路具有抑制作用，可用于治疗其他以铁死亡为靶点的疾病。
附图说明：
13.图1为amd模型中铁死亡标志物的表达；
14.图2为5mm碘酸钠处理组分别添加12种小分子化合物(10μm)作用24h 后的细胞活力数据；
15.图3为10mm碘酸钠处理组分别添加小分子化合物baicalein、genistein、 quercetin(10μm)作用24h后的细胞活力数据；
16.图4为20mm碘酸钠处理组分别添加小分子化合物baicalein、genistein、 quercetin(10μm)作用24h后的细胞活力数据；
17.图5为铁死亡抑制剂或genistein处理后rpe细胞铁死亡标志物的表达。
具体实施方式：
18.为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例和图示，进一步阐述本发明。
19.本发明采用以下小分子化合物进行抑制剂筛选，包括baicalein(黄芩素)、 genistein(染料木素)、deferoxamine(去铁胺)、apigenin(芹菜素)、bazedoxifene (巴多昔芬)、puerarin(葛根素)、gsh-mee(谷胱甘肽乙酯)、quercetin(槲皮素)、epigallocatechin(表没食子儿茶素)、acetylcysteine(乙酰半胱氨酸)、 curcumin(姜黄素)、pinocembrin(乔松素)。
20.实施例1：amd模型中细胞发生铁死亡
21.培养arpe-19细胞，提前一天在100mm细胞培养皿中种1
×
106个/10ml培养基的细胞，细胞分为2组，分别是对照组和naio3组。待第二天细胞状态良好且细胞密度达到80％左右，对照组更换新的10ml细胞培养基，naio3组更换为含10mm naio3的培养基溶液。恒温培养箱培养24h后，消化细胞收集细胞并利用蛋白裂解液进行消化，提取蛋白。
22.western blot操作步骤：
23.(1)上样及电泳：提前配制1
×
电泳液＝900ml dd h2o 100ml 10
×
电泳液。将蛋白变性样品从-80℃冰箱取出后在冰上解冻，向电泳槽中加入500ml 的1
×
电泳缓冲液，将配好的凝胶放入电泳槽中并固定。随后将玻璃板中梳子垂直、缓慢向上拔出，第一孔中加入5μl蛋白marker，再将变性的蛋白样品按顺序加入孔中(20μl/孔)。缓慢加样，避免蛋白样品溢出及气泡产生。上样完毕后在电泳槽中补充足够量的电泳液，按照正负极连接电泳槽盖，接通电源，将电压调至恒压120v，待marker以及蛋白跑至下层胶底端时停止电泳，关闭电源，整个过程约1.5h。
24.(2)转膜：提前配制1l转膜液＝1
×
转膜缓冲液100ml 无水甲醇200ml dd h2o 700ml预冷备用；准备滤纸、海绵垫、1张pvdf膜，pvdf膜修剪成与凝胶大小基本吻合，pvdf膜用无水甲醇浸泡约1-2min进行激活，将海绵垫和滤纸放入转膜缓冲液中浸泡，使其充分平衡。将胶从玻璃板中轻轻分离出来，转膜夹白色面朝上，黑色夹板与白色夹板之间，整齐排好海绵与三层滤纸，凝胶，pvdf膜，三层滤纸与海绵，组装转膜夹，排净各层气泡，夹紧转膜夹。置于转膜槽，浸泡于冰盒降温的转膜缓冲液中，加满转膜液盖上转膜槽盖子，插好电源，冰盒放在转膜槽周围降温，打开电源，设定电流为250ma 恒流，大约转膜60-80min。
25.(3)封闭：转膜结束后镊子夹出pvdf膜，充分浸泡于配制好的5％脱脂牛奶(1g脱脂
奶粉 20ml tbst)中，倾斜摇床上，室温条件下缓慢封闭约1h。
26.(4)一抗孵育：提前取适量一抗用封闭液按照1:1000稀释(一抗稀释液 /5％脱脂奶粉溶液)后加入抗体孵育盒中，并做好标记。转膜结束后取出pvdf 膜，裁剪后，分别置于对应的抗体孵育盒中，4℃缓慢摇晃过夜孵育(12-16h)。
27.(5)二抗孵育：第二天取出抗体孵育盒，一抗稀释液回收于-20℃冻存，加入1
×
tbst在水平摇床快速洗膜，每遍10min，重复3次。取适量二抗用封闭液按照1:5000进行稀释(二抗稀释液/5％脱脂奶粉溶液)后加入抗体孵育盒，水平摇床室温条件下孵育1h。孵育结束后，去掉二抗稀释液，加入1
×
tbst 水平摇床快速洗膜，每遍10min，反复3次。
28.(6)显影：pvdf膜用1
×
tbst浸泡，避免pvdf膜干燥过度。提前打开并曝光凝胶成像系统，按照说明书在暗室下将surpersignal west pico plus化学发光底物a液和b液按1:1配制，将pvdf膜置于凝胶成像分析仪上，取适量a液 b液混合液避光均匀覆盖于pvdf膜表面后曝光显影成像，设置曝光时间，选取合适的曝光成像，保存图片。实验结果至少重复三次。
29.如图1所示，铁死亡关键蛋白slc7a11和gpx4显著下降，而ho-1显著上调，说明细胞发生铁死亡。
30.实施例2：抵抗5mm naio3损伤的小分子抑制剂筛选
31.提前一天将视网膜arpe-19细胞用细胞培养基混成细胞悬液后计数(5000 个/100ul)并接种到96孔细胞培养板，每组设置5个复孔，每孔补充培养基100 μl，混匀后放入恒温培养箱培养。第二天，观察细胞状况，细胞密度达到80％左右且细胞状态良好时，进行实验。细胞分成3组：对照组、naio3处理组和抑制剂组。对照组：去掉培养基，加入新的100μl培养基；naio3处理组：加入100μl 5mm naio3溶液，放入恒温培养箱培养24h；抑制剂组：每孔加入 90μl配制好的抑制剂溶液，2h后加入10μl(50mm)naio3溶液，使抑制剂的终浓度为1um，naio3的终浓度为5mm，恒温培养箱培养24h，使用cck-8 检测细胞活性。
32.图2为5mm碘酸钠处理组分别添加12种小分子化合物(10μm)作用24h后的细胞活力数据，其中balcalein，genistein，quercetin，pinocembrin的添加使细胞活性仍然保持80％。
33.实施例3：抵抗10mm naio3损伤的铁死亡抑制剂筛选
34.将arpe-19细胞种板，24h后细胞状态良好后更换各组细胞培养基(将 naio3组和抑制剂组naio3浓度改为10mm，保证其余条件不变)，恒温培养箱培养24h后，采用cck-8法检测细胞增殖活性。
35.如图3所示，继续增大naio3浓度为10mm后，quercetin，genistein的添加使细胞活性仍然保持50％。
36.实施例4：抵抗20mm naio3损伤的铁死亡抑制剂筛选
37.将arpe-19细胞种板，24h后细胞状态良好后更换各组细胞培养基(将 naio3组和抑制剂组naio3浓度改为20mm，保证其余条件不变)，恒温培养箱培养24h后，采用cck-8法检测细胞增殖活性。
38.如图4所示，继续增大naio3浓度为20mm后，genistein的添加使细胞活性仍然保持50％。
39.实施例5：检测铁死亡相关蛋白的表达
40.提前一天在100mm细胞培养皿中种1
×
106个/10ml培养基的细胞，细胞分为四组，
分别是对照组，naio3组，铁死亡抑制剂组，genistein组。待第二天细胞状态良好且细胞密度达到80％左右，提前2小时对铁死亡抑制剂组， genistein组添加10um对应的药物处理。2小时后，对照组更换新的10ml细胞培养基，naio3组更换为含10mm naio3的培养基溶液。铁死亡抑制剂组， genistein组分别在原有培养基中添加naio3至10mm，恒温培养箱培养24h后，消化细胞收集细胞并利用蛋白裂解液进行消化，提取蛋白，进行western blot 检测。
41.如图5所示，naio3诱导的arpe-19损伤的amd模型中，铁死亡关键蛋白 slc7a11和gpx4显著下降，而ho-1显著上调，说明细胞发生铁死亡。铁死亡抑制剂组(ferrostatin-1)显示，与naio3相比，slc7a11和gpx4明显上升， ho-1明显下调，显示铁死亡抑制剂的作用。有趣的是，genistein组与铁死亡抑制剂组结果一致，说明genistein是通过抑制铁死亡相关基因抵抗naio3诱导的细胞死亡的，因此genistein属于潜在的铁死亡抑制剂。
42.以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。