兼抗四种植物病毒的6种黄瓜花叶病毒RNA2突变型质粒及其应用

兼抗四种植物病毒的6种黄瓜花叶病毒rna2突变型质粒及其应用
技术领域
1.本发明涉及植物病毒学和分子生物学技术领域，具体涉及一组兼抗四种植物病毒的6种黄瓜花叶病毒(cmv)rna2突变型质粒及其应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.植物病毒病种类繁多，分布广泛，是农业生产中仅次于真菌病害的第二大类植物病害(zhao et al.,2016)，对绝大部分作物均造成不同程度的危害。植物病毒可侵染包括粮食、油料、果蔬、中药材和花卉等在内的多种作物，严重阻碍植物生长，影响品质和降低产量。植物病毒病的防治一直以来是我们研究的热点及难点问题。
4.黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus，cmv)属于雀麦花叶病毒科(bromoviridae)，黄瓜花叶病毒属(cucumovirus)，是寄主范围最多、分布最广、最具经济重要性的植物病毒之一，可侵染100多科1200多种植物。造成多种具有重要经济价值的植物(农作物、园艺作物等)出现黄化、矮化、畸形等症状，严重影响其产量和品质(mochizuki et al.,2012)。烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,tmv)属于烟草花叶病毒属(tobamovirus)，在我国各个地方的烟区都能够发生侵染(孙凡玉等，1995)，并且常常是和黄瓜花叶病毒共同侵染(杨德廉等，2001)，侵染烟草后能够严重影响烟叶的产量和品质(姜翰林等，2019)，tmv可以通过种子或者植株叶片的微小伤口进入健康植株中，烟草在苗期的抵抗能力最弱，更有利于tmv的侵染(付一峰，2015)。
5.烟草脉带花叶病毒(tobacco vein banding mosaic virus,tvbmv)是马铃薯y病毒属(potyvirus)的成员，已成为我国山东、河南、安徽、陕西、云南和山西等省烟草种植区的主要病毒之一(zhang et al.,2011)。病毒侵染寄主，前期会出现轻微的卷叶和花叶症状，后期会出现严重的向下卷曲叶、叶片发黄和植株严重矮化、发育不良等症状。
6.马铃薯y病毒(potato virus y，pvy)寄主范围广泛，是目前我国烟草生产中普遍发生的重要病毒病之一，可引起烟草黄斑坏死、严重矮化等症状，pvy可引起辣椒植株斑驳、矮化、果少、花叶等症状，严重影响辣椒的产量和品质(李宁等，2018)。烟草受到pvy侵染后，体内存在的化学成分会发生变化，使烟叶烘烤后的品质下降(谢思，2011)。
7.对于植物病毒病的防治，最有效的方法是抗病品种的筛选与培育，但其存在育种周期长、抗病品种抗性易丧失等不足。另一种有效的防治方法是弱毒疫苗的交叉保护，是利用弱毒突变体预先侵染，诱导植物自身的免疫系统而防治后期侵染的同样类型强病毒株系；是一种有效的病毒防治策略，其具有减少农药用量，不污染环境和不影响生态平衡等优点。弱毒突变体可以是天然存在的，也可以通过分子生物学手段进行人工制备。
8.在自然界中，不同病毒同时侵染寄主植物的现象非常普遍，因此构建针对多种靶
标病毒的多价疫苗十分必要，否则无法达到同时防治几种病毒的目的。为实现利用单剂弱毒疫苗同时防治多种病毒，可以通过在一个骨架病毒中插入不同的异源病毒片段，来达到既防治骨架病毒，又防治插入片段对应的靶标病毒的效果。cmv、tmv、tvbmv和pvy是寄主范围广泛的病毒，混合侵染更是会造成更大危害，然而兼抗cmv、tmv、tvbmv和pvy的四价弱毒疫苗目前还未见有报道。


技术实现要素：

9.针对上述现有技术，本发明的目的是提供一组兼抗四种植物病毒的cmv rna2突变型质粒及其应用。本发明的cmv rna2突变型质粒与野生型cmv rna1和rna3混合后预先接种，对cmv、tmv、tvbmv和pvy单独或者混合侵染都具有一定的防治效果；而且，cmv rna2突变型质粒的骨架结构稳定，使用安全性高，为田间防治由这四种病毒引起的植物病害提供了疫苗材料和有效的防治措施。
10.本发明是通过如下技术方案实现的：
11.本发明的第一方面，提供兼抗黄瓜花叶病毒、烟草花叶病毒、烟草脉带花叶病毒和马铃薯y病毒的突变型质粒，所述突变型质粒为如下(1)-(6)任一所示：
12.(1)pccfr2-2bpt
ⅲ‑
tm
2158-2278
py
517-616
tvb
7600-7699
，其含有cmv
fny
分离物的突变型rna2，所述突变型rna2的核苷酸序列如seq id no.4所示；
13.(2)pccfr2-2bpt
ⅲ‑
tm
2158-2278
tvb
7600-7699
py
517-616
，其含有cmv
fny
分离物的突变型rna2，所述突变型rna2的核苷酸序列如seq id no.5所示；
14.(3)pccfr2-2bpt
ⅲ‑
py
517-616
tvb
7600-7699
tm
2158-2278
，其含有cmv
fny
分离物的突变型rna2，所述突变型rna2的核苷酸序列如seq id no.6所示；
15.(4)pccfr2-2bpt
ⅲ‑
py
517-616
tm
2158-2278
tvb
7600-7699
，其含有cmv
fny
分离物的突变型rna2，所述突变型rna2的核苷酸序列如seq id no.7所示；
16.(5)pccfr2-2bpt
ⅲ‑
tvb
7600-7699
py
517-616
tm
2158-2278
，其含有cmv
fny
分离物的突变型rna2，所述突变型rna2的核苷酸序列如seq id no.8所示；
17.(6)pccfr2-2bpt
ⅲ‑
tvb
7600-7699
tm
2158-2278
py
517-616
，其含有cmv
fny
分离物的突变型rna2，所述突变型rna2的核苷酸序列如seq id no.9所示。
18.优选的，优选的，所述突变型质粒为pccfr2-2bpt
ⅲ‑
tvb
7600-7699
tm
2158-2278
py
517-616
，其含有cmv
fny
分离物的突变型rna2，所述突变型rna2的核苷酸序列如seq id no.9所示。
19.本发明的第二方面，提供上述突变型质粒在制备防治植物病害的疫苗中的应用；所述植物病害是由黄瓜花叶病毒、烟草花叶病毒、烟草脉带花叶病毒和马铃薯y病毒单独或混合侵染引起的。
20.进一步的，所述疫苗为弱毒疫苗。
21.本发明的第三方面，提供一种弱毒疫苗，所述弱毒疫苗以上述突变型质粒为活性成分。
22.进一步的，所述弱毒疫苗中还包括：含cmv
fny rna1的质粒和含cmv
fny rna3的质粒。
23.本发明的第四方面，提供上述弱毒疫苗在防治由黄瓜花叶病毒、烟草花叶病毒、烟草脉带花叶病毒和马铃薯y病毒单独或混合侵染引起的植物病害中的应用。
24.本发明的有益效果：
25.(1)对于先前获得的黄瓜花叶病毒rna2的2b蛋白缺失型突变体pccfr2-2bptⅲ，本发明进一步在新的终止密码子后分别插入不同排列次序的tmv、tvbmv和pvy的保守片段，得到6个含有tmv、tvbmv和pvy不同排列次序基因片段的黄瓜花叶病毒rna2的2b蛋白缺失型突变体，该组质粒转化农杆菌后，分别与含有cmv
fny
野生型rna1和野生型rna3质粒的农杆菌混合后预先接种，可以预防cmv、tmv、tvbmv和pvy强毒株系的侵染，可作为兼抗黄瓜花叶病毒(cmv)、烟草花叶病毒(tmv)、烟草脉带花叶病毒(tvbmv)和马铃薯y病毒(pvy)的四价弱毒疫苗。
26.(2)该组质粒转化农杆菌后，分别与含有cmv
fny
野生型rna1和野生型rna3质粒的农杆菌混合后预先接种植株，六种突变体分别预先接种处理的植株对cmv的防治效果最好；对tmv、tvbmv、pvy以及四种病毒混合强毒的相对防效虽然各有不同，但也同样对这三种病毒单独侵染和四种病毒混合侵染具备一定的预防效果。
27.(3)本发明提供的突变型质粒中分别插入了不同排列次序的三种病毒的基因片段，tmv是长度为121bp的病毒基因组保守序列，tvbmv与pvy均是长度为100bp的病毒基因组保守序列，均能够对三种病毒起到交叉保护作用。
28.(4)本发明提供的cmv rna2突变型质粒的骨架结构稳定，所插入的外源片段接种后能够在植物体内稳定存在，使用安全性高。
附图说明
29.图1：cmv
fny
野生型rna2、2b蛋白缺失型突变体，以及tmv、tvbmv和pvy片段组合插入型的rna2突变体示意图。注：cmv，黄瓜花叶病毒；tmv，烟草花叶病毒；tvbmv，烟草脉带花叶病毒；pvy，马铃薯y病毒；基础载体pcb301-cmv
fny-r2含有cmv
fny
野生型rna2，其转录物为cmv
fny-r2；中间载体pccfr2-2bptⅲ含有2b蛋白缺失型突变以及新插入的多克隆位点bamh i、spe i和sma i，其转录物为r2-2bptⅲ；pccfr2-2bpt
ⅲ‑
tm
2158-2278
py
517-616
tvb
7600-7699
、pccfr2-2bpt
ⅲ‑
tm
2158-2278
tvb
7600-7699
py
517-616
、pccfr2-2bpt
ⅲ‑
py
517-616
tvb
7600-7699
tm
2158-2278
、pccfr2-2bpt
ⅲ‑
py
517-616
tm
2158-2278
tvb
7600-7699
、pccfr2-2bpt
ⅲ‑
tvb
7600-7699
py
517-616
tm
2158-2278
和pccfr2-2bpt
ⅲ‑
tvb
7600-7699
tm
2158-2278
py
517-616
都含有tmv、tvbmv和pvy片段组合插入型的rna2突变体，其转录物分别是r2-2bpt
ⅲ‑
tmptv、r2-2bpt
ⅲ‑
tmtvp、r2-2bpt
ⅲ‑
ptvtm、r2-2bpt
ⅲ‑
ptmtv、r2-2bpt
ⅲ‑
tvptm和r2-2bpt
ⅲ‑
tvtmp，其中tm代表tmv的2158-2278片段，p代表pvy的517-616片段，tv代表tvbmv的7600-7699片段。
30.图2：tmv、tvbmv和pvy片段组合插入型的cmv
fny rna2突变体质粒的pcr分析。m为tiangen公司的d2000分子量标准；mock，空对照；r2，cmv
fny rna2。
31.图3：tmv、tvbmv和pvy片段组合插入型的cmv
fny rna2突变体的致病性分析。mock，不含质粒的农杆菌菌液；r1，cmv
fny rna1；r2，cmv
fny rna2；r3，cmv
fny rna3；r2-2bpt
ⅲ‑
tmptv、r2-2bpt
ⅲ‑
tmtvp、r2-2bpt
ⅲ‑
ptvtm和r2-2bpt
ⅲ‑
ptmtv、r2-2bpt
ⅲ‑
tvptm和r2-2bpt
ⅲ‑
tvtmp为突变型cmv
fny rna2，具体信息见图1。
32.图4：预先接种突变体pccfr2-2bpt
ⅲ‑
tm
2158-2278
py
517-616
tvb
7600-7699
对四种病毒单侵染和混合侵染的交叉保护效果分析。其中mock，不含质粒的农杆菌菌液；r1，cmv
fny
rna1；r2，cmv
fny
rna2；r3，cmv
fny rna3；r2-2bpt
ⅲ‑
tmptv，pccfr2-2bpt
ⅲ‑
tm
2158-2278
py
517-616
tvb
7600-7699
的转录物；dpi，接种后的天数。
2278
py
517-616
的转录物；dpi，接种后的天数。
43.图15：突变体pccfr2-2bpt
ⅲ‑
tvb
7600-7699
tm
2158-2278
py
517-616
预先接种后再接种cmv、tvbmv、tmv、pvy的稳定性检测。注：m为tiangen公司的d2000分子量标准；mock，不含质粒的农杆菌菌液；r1，cmv
fny rna1；r2，cmv
fny rna2；r3，cmv
fny rna3；r2-2bpt
ⅲ‑
tvtmp，pccfr2-2bpt
ⅲ‑
tvb
7600-7699
tm
2158-2278
py
517-616
的转录物；dpi，接种后的天数。
具体实施方式
44.应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
45.如前所述，cmv、tmv、tvbmv和pvy是寄主范围广泛的病毒，混合侵染更是会造成更大危害，然而兼抗cmv、tmv、tvbmv和pvy的四价弱毒疫苗目前还未见有报道。理论上虽然可以通过在cmv为基础的病毒载体中插入tmv、tvbmv和pvy的片段，来达到同时防治4种病毒的目的。但同一载体中插入多种不同病毒的片段，是否可以稳定存在呢？不同病毒片段的插入顺序是否影响对靶标病毒的防治效果呢？这些问题的回答无法通过推导可以预测，需要通过载体中插入不同病毒片段后分析疫苗稳定性和交叉保护效果来具体分析。
46.发明人在前期的研究中开发设计了一种含有黄瓜花叶病毒(cmv)fny分离物rna2的突变型质粒载体pccfr2-2bptⅲ(cn113388637a)，其至少可以容纳350bp的外源片段并保持遗传稳定性。在此基础上，本发明尝试以pccfr2-2bptⅲ作为基础载体，插入tmv、tvbmv和pvy的外源片段，构建能兼抗黄瓜花叶病毒、烟草花叶病毒、烟草脉带花叶病毒和马铃薯y病毒的突变型质粒。
47.本发明首先对所插入的tmv、tvbmv和pvy的外源片段进行了筛选考察，最终选择插入的tmv、tvbmv和pvy的外源片段的核苷酸序列分别如seq id no.1、seq id no.2和seq id no.3所示。
48.然后利用重叠pcr方法将seq id no.1、seq id no.2和seq id no.3所示的病毒基因片段按照不同的排列次序连接到一起。再利用酶切和连接方法将六种不同排列次序连接好的病毒基因片段分别插入到中间载体pccfr2-2bptⅲ(此质粒是在cmv
fny
分离物rna2全序列的基础上，缺失2a与2b蛋白的非重叠区域(2662-2751位)，并在2661位后插入双终止密码子taatag，以及bamh i、spe i和sma i酶切位点)，构建得到6个突变型质粒。
49.将构建的6个突变型质粒转化农杆菌，分别与含有cmv
fny
野生型rna1和野生型rna3质粒的农杆菌混合后预先接种，考察其防治黄瓜花叶病毒(cmv)、烟草花叶病毒(tmv)、烟草脉带花叶病毒(tvbmv)和马铃薯y病毒(pvy)的应用效果。结果发现：六种突变体分别预先接种处理的植株对cmv的防治效果最好；对tmv、tvbmv、pvy以及四种病毒混合强毒的相对防效虽然各有不同，但也同样对这三种病毒单独侵染和四种病毒混合侵染具备一定的预防效果。由此提出了本发明。
50.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本技术的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本技术的技术方案。
51.本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。本发明实施例中未注明具体实验条件和方法的，通常按照常规
条件，如j.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，2002，分子克隆实验指南(第三版)；d.l.斯佩克特等主编，科学出版社，2001，细胞实验指南；或者按照制造厂商建议的条件。
52.实施例1.含有tmv、tvbmv和pvy片段组合插入型的cmv
fny rna2突变体的质粒载体构建
53.tmv片段的克隆：利用transzol up(transgen公司)提取受tmv(af395129.1)侵染的普通烟总rna，然后进行6种rt-pcr反应，扩增tmv的2158-2278位的121bp片段并带有用于进一步重叠pcr的重叠序列。所用引物对分别是tmv-bamhi-2158-f/tmv-cz-pvy-2278-r、tmv-bamhi-2158-f/tmv-cz-tvbmv-2278-r、tmv-cz-tvbmv-2158-f/tmv-smai-2278-r、tmv-cz-pvy-2158-f/tmv-cz-tvbmv-2278-r、tmv-cz-pvy-2158-f/tmv-smai-2278-r和tmv-cz-tvbmv-2158-f/tmv-cz-pvy-2278-r。在reverse transcriptase m-mlv(takara)作用下，进行反转录，反应条件：在不加酶的条件下，80℃变性3min；加入反转录酶后，42℃反应1.5h。再以反转录产物cdna为模版，在2
×
taq master mix(vazyme)作用下，进行pcr反应，pcr条件：95℃预变性3min；95℃变性15s，52℃退火15s，72℃延伸12s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存；6种pcr产物含有tmv的121bp保守序列片段以及用于重叠pcr的重叠序列。6种pcr产物经dna回收试剂盒回收备用。
54.tvbmv片段的克隆：利用transzol up(transgen公司)提取受tvbmv(eu734432.1)侵染的普通烟总rna，然后进行6种rt-pcr反应，扩增tvbmv的7600-7699位的100bp片段并带有用于进一步重叠pcr的重叠序列。所用引物对分别是tvbmv-cz-pvy-7600-f/tvbmv-smai-7699-r、tvbmv-cz-tmv-7600-f/tvbmv-cz-pvy-7699-r、tvbmv-cz-pvy-7600-f/tvbmv-cz-tmv-7699-r、tvbmv-cz-tmv-7600-f/tvbmv-smai-7699-r、tvbmv-bamhi-7600-f/tvbmv-cz-pvy-7699-r和tvbmv-bamhi-7600-f/tvbmv-cz-tmv-7699-r。在reverse transcriptase m-mlv(takara)作用下，进行反转录，反应条件：在不加酶的条件下，80℃变性3min；加入反转录酶后，42℃反应1.5h。再以反转录产物cdna为模版，在2
×
taq master mix(vazyme)作用下，进行pcr反应，pcr条件：95℃预变性3min；95℃变性15s，52℃退火15s，72℃延伸12s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存；6种pcr产物含有tvbmv的100bp保守序列片段以及用于重叠pcr的重叠序列。6种pcr产物经dna回收试剂盒回收备用。
55.pvy片段的克隆：利用transzol up(transgen公司)提取受pvy(x97895.1)侵染的普通烟总rna，然后进行6种rt-pcr反应，扩增pvy的517-616位的100bp片段并带有用于进一步重叠pcr的重叠序列。所用引物对分别是pvy-cz-tmv-517-f/pvy-cz-tvbmv-616-r、pvy-cz-tvbmv-517-f/pvy-smai-616-r、pvy-bamhi-517-f/pvy-cz-tvbmv-616-r、pvy-bamhi-517-f/pvy-cz-tmv-616-r、pvy-cz-tvbmv-517-f/pvy-cz-tmv-616-r和pvy-cz-tmv-517-f/pvy-smai-616-r。在reverse transcriptase m-mlv(takara)作用下，进行反转录，反应条件：在不加酶的条件下，80℃变性3min；加入反转录酶后，42℃反应1.5h。再以反转录产物cdna为模版，在2
×
taq master mix(vazyme)作用下，进行pcr反应，pcr条件：95℃预变性3min；95℃变性15s，52℃退火15s，72℃延伸12s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存；6种pcr产物含有pvy的100bp保守序列片段以及用于重叠pcr的重叠序列。6种pcr产物经dna回收试剂盒回收备用。
56.双病毒片段(tmv
2158-2278
pvy
517-616
、tmv
2158-2278
tvbmv
7600-7699
、pvy
517-616
tvbmv
7600-7699
、pvy
517-616
tmv
2158-2278
、tvbmv
7600-7699
pvy
517-616
和tvbmv
7600-7699
tmv
2158-2278
)的重叠pcr：以上述制
备的单病毒片段两两互为模板，在2
×
taqmaster mix(vazyme)作用下，进行重叠pcr，引物对分别为tmv-bamhi-2158-f/pvy-cz-tvbmv-616-r、tmv-bamhi-2158-f/tvbmv-cz-pvy-7699-r、pvy-bamhi-517-f/tvbmv-cz-tmv-7699-r、pvy-bamhi-517-f/tmv-cz-tvbmv-2278-r、tvbmv-bamhi-7600-f/pvy-cz-tmv-616-r和tvbmv-bamhi-7600-f/tmv-cz-pvy-2278-r；重叠pcr条件：95℃预变性3min；95℃变性15s，41℃退火15s，72℃延伸12s，8个循环；95℃变性15s，52℃退火15s，72℃延伸25s，25个循环；72℃延伸5min；4℃保存；pcr产物分别为tmv
2158-2278
pvy
517-616
、tmv
2158-2278
tvbmv
7600-7699
、pvy
517-616
tvbmv
7600-7699
、pvy
517-616
tmv
2158-2278
、tvbmv
7600-7699
pvy
517-616
和tvbmv
7600-7699
tmv
2158-2278
中200bp左右的保守序列片段以及用于进一步重叠pcr的重叠序列。6种pcr产物经dna回收试剂盒回收备用。
57.三病毒片段(tmv
2158-2278
pvy
517-616
tvbmv
7600-7699
、tmv
2158-2278
tvbmv
7600-7699
pvy
517-616
、pvy
517-616
tvbmv
7600-7699
tmv
2158-2278
、pvy
517-616
tmv
2158-2278
tvbmv
7600-7699
、tvbmv
7600-7699
pvy
517-616
tmv
2158-2278
和tvbmv
7600-7699
tmv
2158-2278
pvy
517-616
)的重叠pcr：以上述制备的双病毒片段与另外一组单病毒片段两两互为模板，在2
×
taq master mix(vazyme)作用下，进行重叠pcr，引物对分别为tmv-bamhi-2158-f/tvbmv-smai-7699-r、tmv-bamhi-2158-f/pvy-smai-616-r、pvy-bamhi-517-f/tmv-smai-2278-r、pvy-bamhi-517-f/tvbmv-smai-7699-r、tvbmv-bamhi-7600-f/tmv-smai-2278-r和tvbmv-bamhi-7600-f/pvy-smai-616-r；重叠pcr条件：95℃预变性3min；95℃变性15s，41℃退火15s，72℃延伸24s，8个循环；95℃变性15s，52℃退火15s，72℃延伸35s，25个循环；72℃延伸5min；4℃保存；pcr产物分别为tmv
2158-2278
pvy
517-616
tvbmv
7600-7699
、tmv
2158-2278
tvbmv
7600-7699
pvy
517-616
、pvy
517-616
tvbmv
7600-7699
tmv
2158-2278
、pvy
517-616
tmv
2158-2278
tvbmv
7600-7699
、tvbmv
7600-7699
pvy
517-616
tmv
2158-2278
和tvbmv
7600-7699
tmv
2158-2278
pvy
517-616
中321bp的保守序列片段。6种pcr产物经dna回收试剂盒回收备用。
58.将中间载体pccfr2-2bptⅲ经bamh i和sma i双酶切，酶切产物经dna回收试剂盒回收；将三病毒片段tmv
2158-2278
pvy
517-616
tvbmv
7600-7699
、tmv
2158-2278
tvbmv
7600-7699
pvy
517-616
、pvy
517-616
tvbmv
7600-7699
tmv
2158-2278
、pvy
517-616
tmv
2158-2278
tvbmv
7600-7699
、tvbmv
7600-7699
pvy
517-616
tmv
2158-2278
和tvbmv
7600-7699
tmv
2158-2278
pvy
517-616
分别经bamh i和sma i双酶切，酶切产物经dna回收试剂盒回收。将同样双酶切的中间载体pccfr2-2bptⅲ和6种双酶切后的三种病毒321bp的连接总片段分别在t
4 dna连接酶作用下16℃过夜连接；连接产物转化大肠杆菌dh5α的感受态细胞，涂带有100μg/ml卡那霉素的lb平板，经菌落pcr筛选得到阳性克隆pccfr2-2bpt
ⅲ‑
tm
2158-2278
py
517-616
tvb
7600-7699
、pccfr2-2bpt
ⅲ‑
tm
2158-2278
tvb
7600-7699
py
517-616
、pccfr2-2bpt
ⅲ‑
py
517-616
tvb
7600-7699
tm
2158-2278
、pccfr2-2bpt
ⅲ‑
py
517-616
tm
2158-2278
tvb
7600-7699
、pccfr2-2bpt
ⅲ‑
tvb
7600-7699
py
517-616
tm
2158-2278
和pccfr2-2bpt
ⅲ‑
tvb
7600-7699
tm
2158-2278
py
517-616
。提取质粒后进行pcr验证，所用引物对是cmv-fny2-2510-f/cmv-fny2-3050-r(详细信息见表1)。以pcb301-cmv
fny-r2为模板，扩增得到540bp片段，而已pccfr2-2bpt
ⅲ‑
tm
2158-2278
py
517-616
tvb
7600-7699
、pccfr2-2bpt
ⅲ‑
tm
2158-2278
tvb
7600-7699
py
517-616
、pccfr2-2bpt
ⅲ‑
py
517-616
tvb
7600-7699
tm
2158-2278
、pccfr2-2bpt
ⅲ‑
py
517-616
tm
2158-2278
tvb
7600-7699
、pccfr2-2bpt
ⅲ‑
tvb
7600-7699
py
517-616
tm
2158-2278
和pccfr2-2bpt
ⅲ‑
tvb
7600-7699
tm
2158-2278
py
517-616
为模板进行扩增可以得到大约790bp的产物(图2)。中间载体pccfr2-2bptⅲ中的rna2缺失了，插入321bp的组合片段后，经引物对cmv-fny2-2510-f/cmv-fny2-3050-r扩增，应该得到大约790bp的片
rna2，转录物是r2-2bpt
ⅲ‑
tvptm)、pccfr2-2bpt
ⅲ‑
tvb
7600-7699
tm
2158-2278
py
517-616
(突变型cmv rna2，转录物是r2-2bpt
ⅲ‑
tvtmp)和pcb301-cmv
fny-r2(野生型cmv
fny rna2，转录物是r2)的农杆菌菌液分别与含pcb301-cmv
fny-r1(野生型cmv
fny rna1，转录物是r1)、pcb301-cmv
fny-r3(野生型cmv
fny rna3，转录物是r3)的农杆菌菌液等比例混匀；于28℃培养箱中静置3h。
67.农杆菌浸润侵染本氏烟：1ml一次性注射器去掉针头，吸取上述混好的农杆菌菌液，选取3-4叶期的本氏烟，利用压力将注射器中的菌液从叶片背面的叶脉之间注入，每株共注射两个叶片，每片叶片注射量至少覆盖1/3叶片。接种完的植株放置25℃培养，16h光照/8h黑暗交替。
68.结果分析：农杆菌浸润接种10d后，接种野生型cmv
fny rna1/rna2/rna3的本氏烟烟叶片皱缩，植株严重矮化，高度不到健康植株的1/2，病情指数为100；而分别接种cmv
fny rna1/rna2-2bpt
ⅲ‑
tmptv/rna3、cmv
fny rna1/rna2-2bpt
ⅲ‑
tmtvp/rna3、cmv
fny rna1/rna2-2bpt
ⅲ‑
ptvtm/rna3、cmv
fny rna1/rna2-2bpt
ⅲ‑
ptmtv/rna3、cmv
fny rna1/rna2-2bpt
ⅲ‑
tvptm/rna3和cmv
fny rna1/rna2-2bpt
ⅲ‑
tvtmp/rna3均与健康对照的高度和叶片平展度基本一致，无病毒病症状(图3)。说明，质粒pccfr2-2bpt
ⅲ‑
tm
2158-2278
py
517-616
tvb
7600-7699
、pccfr2-2bpt
ⅲ‑
tm
2158-2278
tvb
7600-7699
py
517-616
、pccfr2-2bpt
ⅲ‑
py
517-616
tvb
7600-7699
tm
2158-2278
、pccfr2-2bpt
ⅲ‑
py
517-616
tm
2158-2278
tvb
7600-7699
、pccfr2-2bpt
ⅲ‑
tvb
7600-7699
py
517-616
tm
2158-2278
和pccfr2-2bpt
ⅲ‑
tvb
7600-7699
tm
2158-2278
py
517-616
均为含有不同类型的cmv
fny rna2的弱毒突变体(图2)。
69.实施例3：含有tmv、tvbmv和pvy片段组合插入型的cmv
fny rna2突变体的质粒的交叉保护效果与稳定性分析
70.基于实施例2的结果，进一步测试cmv
fny rna2弱毒突变体的交叉保护效果，以及弱毒突变位点的稳定性。首先，分别接种pcb301-cmv
fny-r1/pccfr2-2bpt
ⅲ‑
tm
2158-2278
py
517-616
tvb
7600-7699
/pcb301-cmv
fny-r3(转录物为r1/r2-2bpt
ⅲ‑
tmptv/r3)、pcb301-cmv
fny-r1/pccfr2-2bpt
ⅲ‑
tm
2158-2278
tvb
7600-7699
py
517-616
/pcb301-cmv
fny-r3(转录物为r1/r2-2bpt
ⅲ‑
tmtvp/r3)、pcb301-cmv
fny-r1/pccfr2-2bpt
ⅲ‑
py
517-616
tvb
7600-7699
tm
2158-2278
/pcb301-cmv
fny-r3(转录物为r1/r2-2bpt
ⅲ‑
ptvtm/r3)、pcb301-cmv
fny-r1/pccfr2-2bpt
ⅲ‑
py
517-616
tm
2158-2278
tvb
7600-7699
/pcb301-cmv
fny-r3(转录物为r1/r2-2bpt
ⅲ‑
ptmtv/r3)、pcb301-cmv
fny-r1/pccfr2-2bpt
ⅲ‑
tvb
7600-7699
py
517-616
tm
2158-2278
/pcb301-cmv
fny-r3(转录物为r1/r2-2bpt
ⅲ‑
tvptm/r3)和pcb301-cmv
fny-r1/pccfr2-2bpt
ⅲ‑
tvb
7600-7699
tm
2158-2278
py
517-616
/pcb301-cmv
fny-r3(转录物为r1/r2-2bpt
ⅲ‑
tvtmp/r3)。接种cmv
fny rna2弱毒突变体7d后，分别用cmv、tmv、tvbmv、pvy的强毒单独侵染或四种混合病毒侵染预先接种弱毒突变体的植株和未预先接种弱毒突变体的植株，每个处理至少进行3个重复。接种强毒7d后，观察植株症状。根据株高、叶片花叶、皱缩程度，计算病情指数，最终得出弱毒突变体预先接种的相对防效。
71.病情指数：100
×
∑(各级病株数
×
病害级别)/(调查总株数
×
最高级数)。
72.相对防效(％)：100％
×
(对照组病情指数—处理组病情指数)/对照组病情指数。
73.结果分析：
74.(1)对于预先接种pcb301-cmv
fny-r1/pccfr2-2bpt
ⅲ‑
tm
2158-2278
py
517-616
tvb
7600-7699
/pcb301-cmv
fny-r3(转录物为r1/r2-2bpt
ⅲ‑
tmptv/r3)的效果分析(图4)：cmv强毒接种本氏
烟，7d后植株明显矮化，出现典型的cmv侵染叶片症状即鼠尾状发病特征，病情指数为100，而预接种r1/r2-2bpt
ⅲ‑
tmptv/r3的本氏烟再进行cmv强毒的挑战接种，7d后植株高度与健康对照相同，叶片生长状态良好平展，病情指数为0，相对防效为100％，说明该弱毒突变体的预先接种对cmv有非常好的交叉保护防治效果；tmv强毒接种本氏烟，7d后植株明显矮化，大部分叶片萎蔫严重，无法正常生长，病情指数为100，而预接种r1/r2-2bpt
ⅲ‑
tmptv/r3的本氏烟再进行tmv强毒的挑战接种，7d后植株高度与健康对照相比有一定程度的矮化，叶片有一定程度的萎蔫，病情指数为63.0，相对防效为37.0％，说明该弱毒突变体的预先接种对tmv有较好的交叉保护防治效果；pvy强毒接种本氏烟，7d后植株明显矮化，叶片翻卷皱缩，病情指数为77.8，预接种r1/r2-2bpt
ⅲ‑
tmptv/r3的本氏烟进行pvy强毒的挑战接种，7d后相对于健康植株稍有矮化，叶片轻微卷叶，生长状态良好，病情指数为48.1，相对防效达到38.2％，说明该弱毒突变体的预先接种对pvy有较好的交叉保护防治效果；tvbmv强毒接种本氏烟，7d后植株明显矮化，叶片萎蔫皱缩严重，不能正常生长，病情指数为92.6，预接种r1/r2-2bpt
ⅲ‑
tmptv/r3的本氏烟进行tvbmv强毒的挑战接种，7d后相对于健康植株稍有矮化，叶片长势良好，病情指数为63.0，相对防效为32.0％，说明该弱毒突变体的预先接种对tvbmv有较好的交叉保护防治效果；当cmv/tmv/pvy/tvbmv四种病毒混合接种本氏烟，7d后植株明显矮化，萎蔫严重，不能正常生长，病情指数为92.6，预接种r1/r2-2bpt
ⅲ‑
tmptv/r3的本氏烟再进行四种强毒的混合挑战接种，整体症状有所减轻，病情指数为77.8，相对防效为16.0％，说明弱毒突变体的预先接种对cmv/tmv/pvy/tvbmv这4种病毒的混合接种有一定的交叉保护防治效果(图4)。综合来看，该pcb301-cmv
fny-r1/pccfr2-2bpt
ⅲ‑
tm
2158-2278
py
517-616
tvb
7600-7699
/pcb301-cmv
fny-r3(转录物为r1/r2-2bpt
ⅲ‑
tmptv/r3)对cmv强毒的防效最好，相对防效为100％，对其他三种病毒tmv、pvy、tvbmv的单独侵染的相对防效分别为37.0％，38.2％，32.0％，而对四种病毒的混合侵染防效为16.0％。同时，对弱毒突变体pccfr2-2bpt
ⅲ‑
tm
2158-2278
py
517-616
tvb
7600-7699
的突变位点的稳定性进行了pcr分析，在接种植物后无论是否有强病毒存在，利用引物对cmv-fny2-2510-f(seq id no.28)/cmv-fny2-3050-r(seq id no.29)进行rt-pcr扩增条带均约为790bp，与原始质粒的扩增条带大小一致(图2，图5)，说明弱毒突变体pccfr2-2bpt
ⅲ‑
tm
2158-2278
py
517-616
tvb
7600-7699
在侵染植物后或者接种强毒的条件下均可以保持突变位点的稳定，即维持疫苗性质的稳定。
75.(2)对于预先接种pcb301-cmv
fny-r1/pccfr2-2bpt
ⅲ‑
tm
2158-2278
tvb
7600-7699
py
517-616
/pcb301-cmv
fny-r3(转录物为r1/r2-2bpt
ⅲ‑
tmtvp/r3)的效果分析(图6)：cmv强毒接种本氏烟，7d后植株明显矮化，出现典型的cmv侵染叶片症状即鼠尾状发病特征，病情指数为92.6，而预接种r1/r2-2bpt
ⅲ‑
tmtvp/r3的本氏烟再进行cmv强毒的挑战接种，7d后植株高度与健康对照基本相同，叶片生长状态良好平展，病情指数为7.4，相对防效为92.0％，说明该弱毒突变体的预先接种对cmv有非常好的交叉保护防治效果；tmv强毒接种本氏烟，7d后植株明显矮化，大部分叶片萎蔫严重，无法正常生长，病情指数为100，而预接种r1/r2-2bpt
ⅲ‑
tmtvp/r3的本氏烟再进行tmv强毒的挑战接种，7d后植株高度与健康对照相比有一定程度的矮化，叶片有一定程度的萎蔫，病情指数为70.4，相对防效为29.6％，说明该弱毒突变体的预先接种对tmv有较好的交叉保护防治效果；tvbmv强毒接种本氏烟，7d后植株明显矮化，叶片萎蔫皱缩严重，不能正常生长，病情指数为92.6，预接种r1/r2-2bpt
ⅲ‑
tmtvp/r3的本氏烟进行tvbmv强毒的挑战接种，7d后相对于健康植株稍有矮化，叶片长势良好，部分萎蔫，病情
指数为70.4，相对防效为24.0％，说明该弱毒突变体的预先接种对tvbmv有良好的交叉保护防治效果；pvy强毒接种本氏烟，7d后植株明显矮化，叶片翻卷皱缩，病情指数为85.2，预接种r1/r2-2bpt
ⅲ‑
tmtvp/r3的本氏烟进行pvy强毒的挑战接种，7d后相对于健康植株稍有矮化，叶片轻微卷叶，生长状态良好，病情指数为70.4，相对防效为17.4％，说明该弱毒突变体的预先接种对pvy有一定的交叉保护防治效果；当cmv/tmv/tvbmv/pvy四种病毒混合接种本氏烟，7d后植株明显矮化，萎蔫严重，不能正常生长，病情指数为100，预接种r1/r2-2bpt
ⅲ‑
tmtvp/r3的本氏烟再进行四种强毒的混合挑战接种，整体症状有所减轻，病情指数为77.8，相对防效为22.2％，说明弱毒突变体的预先接种对cmv/tmv/tvbmv/pvy这4种病毒的混合接种有良好的交叉保护防治效果(图6)。综合来看，该pcb301-cmv
fny-r1/pccfr2-2bpt
ⅲ‑
tm
2158-2278
tvb
7600-7699
py
517-616
/pcb301-cmv
fny-r3(转录物为r1/r2-2bpt
ⅲ‑
tmtvp/r3)对cmv强毒的防效最好，相对防效为92.0％，对其他三种病毒tmv、tvbmv、pvy的单独侵染的相对防效分别为29.6％，24.0％，17.4％，而对四种病毒的混合侵染防效为22.2％。同时，对弱毒突变体pccfr2-2bpt
ⅲ‑
tm
2158-2278
tvb
7600-7699
py
517-616
的突变位点的稳定性进行了pcr分析，在接种植物后无论是否有强病毒存在，利用引物对cmv-fny2-2510-f(seq id no.28)/cmv-fny2-3050-r(seq id no.29)进行rt-pcr扩增条带均约为790bp，与原始质粒的扩增条带大小一致(图2，图7)，说明弱毒突变体pccfr2-2bpt
ⅲ‑
tm
2158-2278
tvb
7600-7699
py
517-616
在侵染植物后或者接种强毒的条件下均可以保持突变位点的稳定，即维持疫苗性质的稳定。
76.(3)对于预先接种pcb301-cmv
fny-r1/pccfr2-2bpt
ⅲ‑
py
517-616
tvb
7600-7699
tm
2158-2278
/pcb301-cmv
fny-r3(转录物为r1/r2-2bpt
ⅲ‑
ptvtm/r3)的效果分析(图8)：cmv强毒接种本氏烟，7d后植株明显矮化，出现典型的cmv侵染叶片症状即鼠尾状发病特征，病情指数为92.6，而预接种r1/r2-2bpt
ⅲ‑
ptvtm/r3的本氏烟再进行cmv强毒的挑战接种，7d后植株高度与健康对照相同，叶片生长状态良好平展，病情指数为11.1，相对防效为88.0％，说明该弱毒突变体的预先接种对cmv有非常好的交叉保护防治效果；pvy强毒接种本氏烟，7d后植株明显矮化，叶片翻卷皱缩，病情指数为77.8，预接种r1/r2-2bpt
ⅲ‑
ptvtm/r3的本氏烟进行pvy强毒的挑战接种，7d后相对于健康植株稍有矮化，叶片轻微卷叶，生长状态良好，病情指数为55.6，相对防效达到28.5％，说明该弱毒突变体的预先接种对pvy有良好的交叉保护防治效果；tvbmv强毒接种本氏烟，7d后植株明显矮化，叶片萎蔫皱缩严重，不能正常生长，病情指数为100，预接种r1/r2-2bpt
ⅲ‑
ptvtm/r3的本氏烟进行tvbmv强毒的挑战接种，7d后相对于健康植株稍有矮化，叶片长势良好，病情指数为70.4，相对防效为29.6％，说明该弱毒突变体的预先接种对tvbmv有较好的交叉保护防治效果；tmv强毒接种本氏烟，7d后植株明显矮化，大部分叶片萎蔫严重，无法正常生长，病情指数为100，而预接种r1/r2-2bpt
ⅲ‑
ptvtm/r3的本氏烟再进行tmv强毒的挑战接种，7d后植株高度与健康对照相比有一定程度的矮化，叶片有一定程度的萎蔫，病情指数为77.8，相对防效为22.2％，说明该弱毒突变体的预先接种对tmv有良好的交叉保护防治效果；当cmv/pvy/tvbmv/tmv四种病毒混合接种本氏烟，7d后植株明显矮化，萎蔫严重，不能正常生长，病情指数为92.6，预接种r1/r2-2bpt
ⅲ‑
ptvtm/r3的本氏烟再进行四种强毒的混合挑战接种，整体症状有所减轻，病情指数为77.8，相对防效为16.0％，说明弱毒突变体的预先接种对cmv/pvy/tvbmv/tmv这4种病毒的混合接种有一定的交叉保护防治效果(图8)。综合来看，该pcb301-cmv
fny-r1/pccfr2-2bpt
ⅲ‑
py
517-616
tvb
7600-7699
tm
2158-2278
/pcb301-cmv
fny-r3(转录物为r1/r2-2bpt
ⅲ‑
ptvtm/r3)对cmv强毒的
防效最好，相对防效为88.0％，对其他三种病毒pvy、tvbmv、tmv的单独侵染的相对防效分别为28.5％，29.6％，22.2％，而对四种病毒的混合侵染防效为16.0％。同时，对弱毒突变体pccfr2-2bpt
ⅲ‑
py
517-616
tvb
7600-7699
tm
2158-2278
的突变位点的稳定性进行了pcr分析，在接种植物后无论是否有强病毒存在，利用引物对cmv-fny2-2510-f(seq id no.28)/cmv-fny2-3050-r(seq id no.29)进行rt-pcr扩增条带均约为790bp，与原始质粒的扩增条带大小一致(图2，图9)，说明弱毒突变体pccfr2-2bpt
ⅲ‑
py
517-616
tvb
7600-7699
tm
2158-2278
在侵染植物后或者接种强毒的条件下均可以保持突变位点的稳定，即维持疫苗性质的稳定。
77.(4)对于预先接种pcb301-cmv
fny-r1/pccfr2-2bpt
ⅲ‑
py
517-616
tm
2158-2278
tvb
7600-7699
/pcb301-cmv
fny-r3(转录物为r1/r2-2bpt
ⅲ‑
ptmtv/r3)的效果分析(图10)：cmv强毒接种本氏烟，7d后植株明显矮化，出现典型的cmv侵染叶片症状即鼠尾状发病特征，病情指数为100，而预接种r1/r2-2bpt
ⅲ‑
ptmtv/r3的本氏烟再进行cmv强毒的挑战接种，7d后植株高度与健康对照相同，叶片生长状态良好平展，病情指数为11.1，相对防效为88.9％，说明该弱毒突变体的预先接种对cmv有非常好的交叉保护防治效果；pvy强毒接种本氏烟，7d后植株明显矮化，叶片翻卷皱缩，病情指数为85.2，预接种r1/r2-2bpt
ⅲ‑
ptmtv/r3的本氏烟进行pvy强毒的挑战接种，7d后相对于健康植株稍有矮化，叶片轻微卷叶，生长状态良好，病情指数为55.6，相对防效达到34.7％，说明该弱毒突变体的预先接种对pvy有较好的交叉保护防治效果；tmv强毒接种本氏烟，7d后植株明显矮化，大部分叶片萎蔫严重，无法正常生长，病情指数为100，而预接种r1/r2-2bpt
ⅲ‑
ptmtv/r3的本氏烟再进行tmv强毒的挑战接种，7d后植株高度与健康对照相比有一定程度的矮化，叶片有一定程度的萎蔫，病情指数为70.4，相对防效为29.6％，说明该弱毒突变体的预先接种对tmv有较好的交叉保护防治效果；tvbmv强毒接种本氏烟，7d后植株明显矮化，叶片萎蔫皱缩严重，不能正常生长，病情指数为100，预接种r1/r2-2bpt
ⅲ‑
ptmtv/r3的本氏烟进行tvbmv强毒的挑战接种，7d后相对于健康植株稍有矮化，叶片长势良好，病情指数为77.8，相对防效为22.2％，说明该弱毒突变体的预先接种对tvbmv有良好的交叉保护防治效果；当cmv/pvy/tmv/tvbmv四种病毒混合接种本氏烟，7d后植株明显矮化，萎蔫严重，不能正常生长，病情指数为92.6，预接种r1/r2-2bpt
ⅲ‑
ptmtv/r3的本氏烟再进行四种强毒的混合挑战接种，整体症状有所减轻，病情指数为77.8，相对防效为16.0％，说明弱毒突变体的预先接种对cmv/pvy/tmv/tvbmv这4种病毒的混合接种有一定的交叉保护防治效果(图10)。综合来看，该pcb301-cmv
fny-r1/pccfr2-2bpt
ⅲ‑
py
517-616
tm
2158-2278
tvb
7600-7699
/pcb301-cmv
fny-r3(转录物为r1/r2-2bpt
ⅲ‑
ptmtv/r3)对cmv强毒的防效最好，相对防效为88.9％，对其他三种病毒pvy、tmv、tvbmv的单独侵染的相对防效分别为34.7％，29.6％，22.2％，而对四种病毒的混合侵染防效为16.0％。同时，对弱毒突变体pccfr2-2bpt
ⅲ‑
py
517-616
tm
2158-2278
tvb
7600-7699
的突变位点的稳定性进行了pcr分析，在接种植物后无论是否有强病毒存在，利用引物对cmv-fny2-2510-f(seq id no.28)/cmv-fny2-3050-r(seq id no.29)进行rt-pcr扩增条带均约为790bp，与原始质粒的扩增条带大小一致(图2，图11)，说明弱毒突变体pccfr2-2bpt
ⅲ‑
py
517-616
tm
2158-2278
tvb
7600-7699
在侵染植物后或者接种强毒的条件下均可以保持突变位点的稳定，即维持疫苗性质的稳定。
78.(5)对于预先接种pcb301-cmv
fny-r1/pccfr2-2bpt
ⅲ‑
tvb
7600-7699
py
517-616
tm
2158-2278
/pcb301-cmv
fny-r3(转录物为r1/r2-2bpt
ⅲ‑
tvptm/r3)的效果分析(图12)：cmv强毒接种本氏烟，7d后植株明显矮化，出现典型的cmv侵染叶片症状即鼠尾状发病特征，病情指数为100，
而预接种r1/r2-2bpt
ⅲ‑
tvptm/r3的本氏烟再进行cmv强毒的挑战接种，7d后植株高度与健康对照相同，叶片生长状态良好平展，病情指数为3.7，相对防效为96.3％，说明该弱毒突变体的预先接种对cmv有非常好的交叉保护防治效果；tvbmv强毒接种本氏烟，7d后植株明显矮化，叶片萎蔫皱缩严重，不能正常生长，病情指数为100，预接种r1/r2-2bpt
ⅲ‑
tvptm/r3的本氏烟进行tvbmv强毒的挑战接种，7d后相对于健康植株稍有矮化，叶片长势良好，病情指数为55.6，相对防效为44.4％，说明该弱毒突变体的预先接种对tvbmv有较好的交叉保护防治效果；pvy强毒接种本氏烟，7d后植株明显矮化，叶片翻卷皱缩，病情指数为70.4，预接种r1/r2-2bpt
ⅲ‑
tvptm/r3的本氏烟进行pvy强毒的挑战接种，7d后相对于健康植株稍有矮化，叶片轻微卷叶，生长状态良好，病情指数为40.7，相对防效达到42.2％，说明该弱毒突变体的预先接种对pvy有较好的交叉保护防治效果；tmv强毒接种本氏烟，7d后植株明显矮化，大部分叶片萎蔫严重，无法正常生长，病情指数为100，而预接种r1/r2-2bpt
ⅲ‑
tvptm/r3的本氏烟再进行tmv强毒的挑战接种，7d后植株高度与健康对照相比有一定程度的矮化，叶片有一定程度的萎蔫，病情指数为63.0，相对防效为37.0％，说明该弱毒突变体的预先接种对tmv有较好的交叉保护防治效果；当cmv/tvbmv/pvy/tmv四种病毒混合接种本氏烟，7d后植株矮化，叶片萎蔫严重，病情指数为85.2，预接种r1/r2-2bpt
ⅲ‑
tvptm/r3的本氏烟再进行四种强毒的混合挑战接种，整体症状有所减轻，病情指数为63.0，相对防效为26.1％，说明弱毒突变体的预先接种对cmv/tvbmv/pvy/tmv这4种病毒的混合接种有良好的交叉保护防治效果(图12)。综合来看，该pcb301-cmv
fny-r1/pccfr2-2bpt
ⅲ‑
tvb
7600-7699
py
517-616
tm
2158-2278
/pcb301-cmv
fny-r3(转录物为r1/r2-2bpt
ⅲ‑
tvptm/r3)对cmv强毒的防效最好，相对防效为96.3％，对其他三种病毒tvbmv、pvy、tmv的单独侵染的相对防效分别为44.4％，42.2％，37.0％，而对四种病毒的混合侵染防效为26.1％。同时，对弱毒突变体pccfr2-2bpt
ⅲ‑
tvb
7600-7699
py
517-616
tm
2158-2278
的突变位点的稳定性进行了pcr分析，在接种植物后无论是否有强病毒存在，利用引物对cmv-fny2-2510-f(seq id no.28)/cmv-fny2-3050-r(seq id no.29)进行rt-pcr扩增条带均约为790bp，与原始质粒的扩增条带大小一致(图2，图13)，说明弱毒突变体pccfr2-2bpt
ⅲ‑
tvb
7600-7699
py
517-616
tm
2158-2278
在侵染植物后或者接种强毒的条件下均可以保持突变位点的稳定，即维持疫苗性质的稳定。
79.(6)对于预先接种pcb301-cmv
fny-r1/pccfr2-2bpt
ⅲ‑
tvb
7600-7699
tm
2158-2278
py
517-616
/pcb301-cmv
fny-r3(转录物为r1/r2-2bpt
ⅲ‑
tvtmp/r3)的效果分析(图14)：cmv强毒接种本氏烟，7d后植株明显矮化，出现典型的cmv侵染叶片症状即鼠尾状发病特征，病情指数为92.6，而预接种r1/r2-2bpt
ⅲ‑
tvtmp/r3的本氏烟再进行cmv强毒的挑战接种，7d后植株高度与健康对照相同，叶片生长状态良好平展，病情指数为3.7，相对防效为96.0％，说明该弱毒突变体的预先接种对cmv有非常好的交叉保护防治效果；tvbmv强毒接种本氏烟，7d后植株明显矮化，叶片萎蔫皱缩严重，不能正常生长，病情指数为92.6，预接种r1/r2-2bpt
ⅲ‑
tvtmp/r3的本氏烟进行tvbmv强毒的挑战接种，7d后相对于健康植株稍有矮化，叶片长势良好，病情指数为55.6，相对防效为40.0％，说明该弱毒突变体的预先接种对tvbmv有较好的交叉保护防治效果；tmv强毒接种本氏烟，7d后植株明显矮化，大部分叶片萎蔫严重，无法正常生长，病情指数为100，而预接种r1/r2-2bpt
ⅲ‑
tvtmp/r3的本氏烟再进行tmv强毒的挑战接种，7d后植株高度与健康对照相比有一定程度的矮化，叶片有一定程度的萎蔫，病情指数为70.4，相对防效为29.6％，说明该弱毒突变体的预先接种对tmv有较好的交叉保护防治效果；pvy
强毒接种本氏烟，7d后植株明显矮化，叶片翻卷皱缩，病情指数为63.0，预接种r1/r2-2bpt
ⅲ‑
tvtmp/r3的本氏烟进行pvy强毒的挑战接种，7d后相对于健康植株稍有矮化，叶片轻微卷叶，生长状态良好，病情指数为40.7，相对防效达到35.4％，说明该弱毒突变体的预先接种对pvy有较好的交叉保护防治效果；当cmv/tvbmv/tmv/pvy四种病毒混合接种本氏烟，7d后植株矮化，叶片萎蔫严重，不能正常生长，病情指数为92.6，预接种r1/r2-2bpt
ⅲ‑
tvtmp/r3的本氏烟再进行四种强毒的混合挑战接种，整体症状有所减轻，病情指数为63.0，相对防效为32.0％，说明弱毒突变体的预先接种对cmv/tvbmv/tmv/pvy这4种病毒的混合接种有较好的交叉保护防治效果(图14)。
80.综合来看，该pcb301-cmv
fny-r1/pccfr2-2bpt
ⅲ‑
tvb
7600-7699
tm
2158-2278
py
517-616
/pcb301-cmv
fny-r3(转录物为r1/r2-2bpt
ⅲ‑
tvtmp/r3)对cmv强毒的防效最好，相对防效为96.0％，对其他三种病毒tvbmv、tmv、pvy的单独侵染的相对防效分别为40.0％，29.6％，35.4％，而对四种病毒的混合侵染防效为32.0％。同时，对弱毒突变体pccfr2-2bpt
ⅲ‑
tvb
7600-7699
tm
2158-2278
py
517-616
的突变位点的稳定性进行了pcr分析，在接种植物后无论是否有强病毒存在，利用引物对cmv-fny2-2510-f(seq id no.28)/cmv-fny2-3050-r(seq id no.29)进行rt-pcr扩增条带均约为790bp，与原始质粒的扩增条带大小一致(图2，图15)，说明弱毒突变体pccfr2-2bpt
ⅲ‑
tvb
7600-7699
tm
2158-2278
py
517-616
在侵染植物后或者接种强毒的条件下均可以保持突变位点的稳定，即维持疫苗性质的稳定。
81.表2：本发明中突变体对各靶标病毒的相对防效
[0082][0083]
基于实施例3的结果可知，6种cmv
fny rna2突变型质粒与野生型rna1和rna3混合接种植物后，其突变位点均可以稳定存在；对cmv、tmv、pvy和tvbmv这4种病毒均表现出交叉保护效果，其中对cmv单独侵染的防效最好，超过90％，对其他三种病毒单独侵染的防效在20％-50％，对4种病毒混合侵染的防效在16％-32％。6种cmv
fny rna2突变型质粒对同一种病毒的防效存在差异，与异源病毒插入的顺序有关；6种cmv
fny rna2突变型质粒均可以兼抗cmv、tmv、pvy和tvbmv，为这4种病毒病的防治提供了多种疫苗材料的选择。可以根据田间病毒病发生种类和严重程度，选择合适的疫苗类型。
[0084]
对比例：
[0085]
分别将seq id no.1、seq id no.2和seq id no.3所示的病毒基因片段利用酶切和连接方法将其分别插入到中间载体pccfr2-2bptⅲ(此质粒是在cmv
fny
分离物rna2全序列的基础上，缺失2a与2b蛋白的非重叠区域(2662-2751位)，并在2661位后插入双终止密码子
taatag，以及bamh i、spe i和sma i酶切位点)，构建得到3个突变型质粒，分别为：
[0086]
pccfr2-2bpt
ⅲ‑
tvb
7600-7699
、pccfr2-2bpt
ⅲ‑
tm
2158-2278
、pccfr2-2bpt
ⅲ‑
py
517-616
。
[0087]
将构建的pccfr2-2bpt
ⅲ‑
tvb
7600-7699
、pccfr2-2bpt
ⅲ‑
tm
2158-2278
、pccfr2-2bpt
ⅲ‑
py
517-616
分别转化农杆菌，然后分别与含有cmv
fny
野生型rna1和野生型rna3质粒的农杆菌混合后预先接种本氏烟，再用cmv、tmv、tvbmv、pvy四种病毒混合侵染，考察其对4种病毒混合侵染的相对防效。结果如下：
[0088]
突变型质粒pccfr2-2bpt
ⅲ‑
tvb
7600-7699
与含有cmv
fny
野生型rna1和野生型rna3质粒的农杆菌混合后预先接种，其对四种病毒混合侵染的相对防效为4％。即无法有效防治四种病毒混合侵染。
[0089]
突变型质粒pccfr2-2bpt
ⅲ‑
tm
2158-2278
与含有cmv
fny
野生型rna1和野生型rna3质粒的农杆菌混合后预先接种，其对四种病毒混合侵染的相对防效为6％。即无法有效防治四种病毒混合侵染。
[0090]
突变型质粒pccfr2-2bpt
ⅲ‑
py
517-616
与含有cmv
fny
野生型rna1和野生型rna3质粒的农杆菌混合后预先接种，其对四种病毒混合侵染的相对防效为4％。即无法有效防治四种病毒混合侵染。
[0091]
以上所述仅为本技术的优选实施例而已，并不用于限制本技术，对于本领域的技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。