一种分蘖洋葱根系提取物的制备方法及其应用

1.本发明涉及根结线虫病防治领域，特别涉及一种分蘖洋葱根系提取物的制备方法及其应用。


背景技术：

2.根结线虫病是一种土传病害，主要发生在作物根部，因其隐蔽性，一旦发生很难根除，严重发生时具有毁灭性，尤其寄主植物的连续种植，随着连作年限的增加，该病害尤为严重。在生产实践中主要采用化学药剂防治土传病害，虽然化学防治效果较好，但是频繁使用容易产生抗药性，施用剂量逐渐加大，使得防治成本提高，随之给生态环境带来负面影响，农药残留威胁着人类健康。随着人们环境保护意识的加强和食品安全的日益重视，绿色食品越来越受到关注。近年来，剧毒化学农药的禁用，高毒农药正在退出市场，目前，急需安全、高效的生物制剂防治根结线虫病。


技术实现要素：

3.本发明是要解决现有根结线虫病的防治方法存在污染环境、威胁人类健康的问题，提供一种分蘖洋葱根系提取物的制备方法及其应用。
4.本发明提供一种分蘖洋葱根系提取物的制备方法，包括以下步骤：
5.一、在温度为23℃-25℃的条件下，将每头分蘖洋葱置于40-60ml装有无菌蒸馏水的容器中，使根部浸入蒸馏水中，每天换水，5天后将分蘖洋葱转移至250-300ml装有无菌蒸馏水的容器中，继续每天换水，再培养5-7天；
6.二、然后用无菌水冲洗分蘖洋葱根系3-5次，接着用吸水纸吸干根系表面的水；剪下所有分蘖洋葱的根系，然后加入无菌水，研磨成匀浆，离心，收集上清液，即为分蘖洋葱根系提取物。
7.进一步的，步骤二中分蘖洋葱的根系与无菌水的质量比为1:1.
8.进一步的，步骤二中离心温度为4-5℃。
9.进一步的，步骤二中离心速度为14000-15000r/min。
10.进一步的，步骤二中离心时间为20-30min。
11.本发明还提供分蘖洋葱根系提取物在防治根结线虫病中的应用。
12.进一步的，所述分蘖洋葱根系提取物能够提高根结线虫二龄幼虫死亡率。
13.进一步的，所述分蘖洋葱根系提取物能够降低根结线虫卵的孵化率。
14.进一步的，所述分蘖洋葱根系提取物能够提高对根结线虫二龄幼虫的吸引作用。
15.进一步的，所述根结线虫为南方根结线虫。
16.本发明的有益效果：
17.本发明选择分蘖洋葱进行活性物质提取，其中的特殊风味物质含量高，且丙酮酸含量高，明显高于普通洋葱。由于是生物制剂，具有环保、无污染、无残留的优点，在自然环境中降解快，符合市场对绿色农产品的需求。
18.根系提取物对南方根结线虫二龄幼虫具有显著的毒杀作用，且根系提取物的10倍稀释液对线虫的毒杀作用最为显著。根系提取物可以有效抑制南方根结线虫卵孵化，且根系提取物的10倍稀释液对线虫卵的孵化抑制作用最为显著。另外，根系提取物对南方根结线虫二龄幼虫具有强烈的吸引作用，且明显强于根系渗出物的作用。
附图说明
19.图1为分蘖洋葱根系提取物对南方根结线虫二龄幼虫死亡率的影响；
20.图2为分蘖洋葱根系提取物对南方根结线虫二龄幼虫校正死亡率的影响；
21.图3为分蘖洋葱根系提取物对根结线虫卵孵化率的影响；
22.图4为分蘖洋葱根系提取物对根结线虫卵孵化抑制率的影响；
23.图5为分蘖洋葱根系提取物对根结线虫的趋化性的影响；
24.图6为分蘖洋葱根系渗出物和提取物对南方根结线虫的趋化性影响。
具体实施方式
25.本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
26.具体实施方式一：本实施方式分蘖洋葱根系提取物的制备方法，包括以下步骤：
27.一、在温度为23℃-25℃的条件下，将每头分蘖洋葱置于40-60ml装有无菌蒸馏水的容器中，使根部浸入蒸馏水中，每天换水，5天后将分蘖洋葱转移至250-300ml装有无菌蒸馏水的容器中，继续每天换水，再培养5-7天；
28.二、然后用无菌水冲洗分蘖洋葱根系3-5次，接着用吸水纸吸干根系表面的水；剪下所有分蘖洋葱的根系，然后加入无菌水，研磨成匀浆，离心，收集上清液，即为分蘖洋葱根系提取物。
29.分蘖洋葱中特殊风味物质含量高，且丙酮酸含量高，明显高于普通洋葱。由于是生物制剂，具有环保、无污染、无残留的优点，在自然环境中降解快，符合市场对绿色农产品的需求。
30.具体实施方式二：本实施方式步骤二中分蘖洋葱的根系与无菌水的质量比为1:1。其它步骤与参数和具体实施方式一相同。
31.具体实施方式三：本实施方式步骤二中离心温度为4-5℃。其它步骤与参数和具体实施方式一或二相同。.
32.具体实施方式四：本实施方式步骤二中离心速度为14000-15000r/min。其它步骤与参数和具体实施方式一至三之一相同。
33.具体实施方式五：本实施方式步骤二中离心时间为20-30min。其它步骤与参数和具体实施方式一至四之一相同。
34.具体实施方式六：本实施方式分蘖洋葱根系提取物在防治根结线虫病中的应用。
35.具体实施方式七：本实施方式所述分蘖洋葱根系提取物能够提高根结线虫二龄幼虫的死亡率。其它步骤与参数和具体实施方式六相同。
36.具体实施方式八：本实施方式所述分蘖洋葱根系提取物能够降低根结线虫卵的孵化率。其它步骤与参数和具体实施方式六相同。
37.具体实施方式九：本实施方式所述分蘖洋葱根系提取物能够提高对根结线虫二龄幼虫的吸引作用。其它步骤与参数和具体实施方式六相同。
38.具体实施方式十：本实施方式所述根结线虫为南方根结线虫。其它步骤与参数和具体实施方式六至九之一相同。
39.下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
40.实施例1：本实施例分蘖洋葱根系提取物的制备方法，包括以下步骤：
41.一、在温度为25℃的条件下，将每头分蘖洋葱置于50ml装有无菌蒸馏水的离心管中，使根部浸入蒸馏水中，每天换水，5天后将分蘖洋葱转移至250ml装有无菌蒸馏水的三角瓶中，继续每天换水，再培养5天；
42.二、用无菌水冲洗分蘖洋葱根系3次后，然后用吸水纸吸干根系表面的水；剪下所有分蘖洋葱的根系，称重，然后加入等质量的无菌水，研磨成匀浆，5℃下14000r/min离心20min，收集上清液，即为分蘖洋葱根系提取物，然后用保鲜膜密封置于4℃冰箱中备用。
43.利用本实施例制备的分蘖洋葱根系提取物进行以下实验：
44.实验1：分蘖洋葱根系提取物对南方根结线虫的毒杀作用
45.在直径为60mm的无菌培养皿中分别加入根系提取物的稀释液10ml，每皿加入南方根结线虫二龄幼虫(j2)约1000条，共分为4个处理组，分别是稀释倍数10
×
、20
×
、40
×
和同体积无菌水对照组。每个处理组4皿，置于28℃恒温培养箱内。在1d、3d、5d、7d时于显微镜下调查每皿内j2死亡数，计算线虫死亡率和校正死亡率。整个试验重复二次。
46.试验结果：
47.对南方根结线虫j2死亡情况调查结果如图1和图2所示，图中
◆
表示对照组，
■
表示t10
×
，
▲
表示t20
×
，
×
表示t40
×
。分蘖洋葱根系提取物3个稀释浓度处理组的j2死亡率在4个调查时间点均显著高于对照组，可见分蘖洋葱根系提取物对南方根结线虫具有显著的毒杀作用。随着根系提取物处理时间的延长，提取物对南方根结线虫j2的毒杀作用也随之增强，死亡率和校正死亡率随着时间和浓度的增加而升高。3d后，提取物10倍稀释液(t10
×
)对线虫的毒杀作用显著高于其他两个处理组，在5d时，j2死亡率趋于稳定，t10
×
对j2的致死率和校正死亡率达到100％；t20
×
对j2的致死率和校正死亡率分别为85.19％和84.14％；t40
×
对j2的致死率和校正死亡率分别为52.6％和49.15％。由此可以看出，随着分蘖洋葱根系提取物浓度的降低j2的致死率和校正死亡率下降，即t10
×
》t20
×
》t40
×
。
48.实验2：分蘖洋葱根系提取物对南方根结线虫卵孵化的影响
49.在直径为60mm的无菌培养皿中分别加入根系提取物稀释液10ml，每皿加入约1000个南方根结线虫的卵，共分为4个处理组，分别是稀释倍数10
×
、20
×
、40
×
和同体积无菌水对照组。每个处理组4皿，将其置于28℃恒温培养箱内。在3d、5d、7d、9d时于体式显微镜下调查每皿内卵孵化出的j2二龄幼虫数，计算孵化率和相对抑制率。整个试验重复二次。
50.试验结果：
51.分蘖洋葱根系提取物在一定程度上可以有效抑制南方根结线虫卵孵化，提取物浓度越高，卵的孵化率越低，孵化抑制率就越高，提取物浓度为t10
×
时，卵的孵化抑制率显著高于其他处理浓度，7d时，最高可达58.26％。卵的孵化率在3d、5d、7d三个检测时间点，t10
×
和t20
×
都显著低于对照组，在第9d时，所有处理都显著低于对照组；t10
×
对卵的孵化抑制率在所有调查时间点均显著高于其他处理，结果如图3和图4所示，图中
◆
表示对照组，
■
表示t10
×
，
▲
表示t20
×
，
×
表示t40
×
。
52.实验3：分蘖洋葱根系提取物对根结线虫的趋化性
53.采用pluronic f-127(pf-127)胶法室内测试线虫的趋化行为。
54.根系渗出物10倍稀释液s10
×
的制备：将分蘖洋葱置于50ml装满蒸馏水的离心管中，使其根部浸入水中，5天后，无菌水冲洗分蘖洋葱根系3次后，将其根部浸入100ml无菌水中，通气培养48h，收集得到培养液即为含有根系渗出物的液体，通过3层滤纸布氏漏斗过滤2次，按照每10ml培养液中含1g根的比例加入适量的无菌水，定容为10ml/g根，即为根系渗出物的10倍稀释液s10
×
，然后用保鲜膜密封置于4℃冰箱中备用。
55.根系提取物10倍稀释液t10
×
的制备：将实施例1制备的根系提取物稀释成10倍，即为t10
×
。
56.实验分为3组，分别是根系渗出物组、根系提取物组和对照组。
57.根系渗出物组pf-127胶的配置方法：将无菌的搅拌子放入250ml的玻璃瓶中，将40ml根系渗出物10倍稀释液加入玻璃瓶中，向瓶中加入23g pf-127粉，然后再加入40ml根系渗出物10倍稀释液。将玻璃瓶放置在搅拌器上，4℃下过夜搅拌混合，即可得到100ml约23％的pf-127胶溶液。
58.根系提取物组pf-127胶的配置方法：将无菌的搅拌子放入250ml的玻璃瓶中，将40ml根系提取物10倍稀释液加入玻璃瓶中，向瓶中加入23g pf-127粉，然后再加入40ml根系提取物10倍稀释液。将玻璃瓶放置在搅拌器上，4℃下过夜搅拌混合，即可得到100ml约23％的pf-127胶溶液。
59.对照组pf-127胶的配置方法：将无菌的搅拌子放入250ml的玻璃瓶中，将40ml无菌水加入玻璃瓶中，向瓶中加入23g pf-127粉，然后再加入40ml无菌水。将玻璃瓶放置在搅拌器上，4℃下过夜搅拌混合，即可得到100ml约23％的pf-127胶溶液。
60.将配制成的3组pf-127胶分别注入无菌的200μl微量移液器枪头(tip)内，注入量为每个枪头150μl，每个组准备4个直径60mm培养皿，每个培养皿的中央各放置一个对应的注入pf-127胶的枪头，培养皿中加入10ml含500条j2的无菌水配制的pf-127胶，分别于8h、24h观察3个组tip头内线虫的数量变化情况。
61.实验结果：
62.用根系渗出物和根系提取物10倍液配制的胶注入tip内，然后置于线虫分布均匀的pluronic f-127胶系统中8h和24h后，显微镜下观察，如图5所示(其中表示ck，表示根系提取物，表示根系渗出物)，根系提取物对南方根结线虫j2具有强烈的吸引作用，并且明显强于根系渗出物的作用。8h时，装有根系提取物tip头内线虫吸引率为19.3％，24h时调查根系提取物对线虫的吸引率为13.95％，都与对照组形成显著性差异，即根系提取物对线虫有诱集作用，但是随着时间的延长，线虫对提取物的不适而离开，导致24h线虫的吸引率降低，而根系渗出物对线虫的趋化性无显著性影响。并且在24h时，体式显微镜(目镜10
×
，物镜1.6
×
)下装有根系提取物的tip头内的线虫绝大部分线虫虫体僵直，呈现死亡状态，但装有根系渗出物的tip头内的线虫仅有部分线虫虫体僵直。该结果说明分蘖洋葱根系
提取物对南方根结线虫二龄幼虫具有强烈的吸引作用和毒杀作用，及诱杀作用(如图6)。
63.结论：根据以上试验结果可知，分蘖洋葱根系提取物对南方根结线虫二龄幼虫(j2)具有明显的吸引作用；根系提取物以上试验浓度下对南方根结线j2都具有显著的毒杀作用，浓度越高毒杀作用越强，提取物浓度为t10
×
时，5d对线虫的校正死亡率可达100％；根系提取物对线虫卵的孵化率与对照相比有显著的抑制效果，浓度为t10
×
时，对线虫卵的抑制率为58.26％。总之，分蘖洋葱根系提取物对南方根结线j2有明显的诱杀作用，根系提取物对卵孵化有抑制作用。