斯氏线虫的培养方法、斯氏线虫蛹胶囊制剂及其制备方法与流程

1.本发明属现代农业领域，涉及一种昆虫病原线虫的增殖和蛹胶囊的制备方法。


背景技术：

2.昆虫病原线虫(entomopathogenic nematodes)属于线虫门小杆目，主要包括斯氏线虫属 (steinernema)和异小杆线虫属(heterorhabditis)，是一类重要的天敌生物，对害虫种群增 长起着自然调节的作用。昆虫病原线虫肠道前端携带共生菌，以3龄侵染期虫态(infectivejuveniles，ijs)存活于土壤和水体中。侵染期线虫通过昆虫表皮的自然开口(口器、气孔、 肛门等)、伤口或节间膜侵入寄主体内，在昆虫血腔中释放其肠道共生细菌，共生菌增殖并产 生毒素而导致昆虫死亡，线虫则以共生菌细胞和虫体组织为营养生长繁殖产生下一代侵染期 幼虫。斯氏线虫能引起寄主快速死亡，而且具有搜索宿主靶标的功能，成为研究应用最多的 昆虫病原线虫类群，目前已鉴定了小卷蛾斯氏线虫(s.carpocapsae)、海滨斯氏线虫(s.litorale) 等60多个种，寄主范围包括鳞翅目、鞘翅目、同翅目等多种农林害虫。由于昆虫病原线虫资 源广泛、寄主范围广、感染致死效率高、环境生态安全、不易产生抗性、可规模培养，同时 可借助水膜进行水平和垂直运动，通过感知寄主呼吸产生的co2等气味而主动搜寻和感染隐 蔽害虫，在害虫生物防治中表现出重要的研究价值和应用潜力。
3.病原线虫广泛应用于害虫生物防治的关键是病原线虫的高效培养技术。基于昆虫病原线 虫行为学、规模化繁殖生产技术、病原线虫防治应用等方面的技术突破，美国、韩国、澳大 利亚、加拿大、以色列等发达国家均成功开发了病原线虫生物杀虫剂，商品化的线虫品系100 多种，应用于农林、高尔夫球场、花卉等多种害虫防治，销售额占生物农药市场的13％，成 为仅次于苏云金杆菌(bacillus thuringiensis)的新型活体生物杀虫剂。
4.目前，昆虫病原线虫的培养根据繁殖载体的不同主要分为活体繁殖方法和离体繁殖方法。 昆虫寄主活体培养是早期昆虫病原线虫应用的培养方式，其培养策是使用敏感、易人工饲 养繁殖的昆虫寄主来培养昆虫病原线虫。一般是利用大蜡螟等幼虫作为敏感宿主，通过感染 期线虫自然入侵到幼虫体内，释放内生菌致死属主并生长，繁殖产生子代线虫。收集死亡虫 体中的繁殖线虫通过分离收集、无菌水清洗剂、载体吸附、低温保存等步骤再加工成相应线 虫制剂。由于培养过程较复杂、工艺参数无标准，难以形成批量生产。离体培养是则通过分 离共生菌，通过固体培养基或发酵罐进行液体培养。其技术原理在于病原线虫主要以共生菌 为饲料，通过无菌条件下繁殖共生菌并补充必要的c/n营养物质，接种昆虫病原线虫生长繁 殖产生子代。固体培养是将感染期幼虫接种到相应的共生细菌的纯培养基中进行培养，但存 在稳定性不高，培养时间较长，生产效率低的问题。液体培养是目前线虫规模化生长的主 要方法，使用生物发酵系统(发酵罐)培养内生菌，当内生细菌繁殖到一定数量时接种线虫 繁殖产生后代。通常从开始培养算起，15-20d后可收集感染期幼虫。但液体培养技术要求高、 投入大，发酵培养过程需要监测各种理化参数并对温度、ph和溶氧等参数进行监控，接种线 虫对培养基和培养条件敏感，感染期幼虫的恢复状态难控
制，同时由于培养时间长、动力能 耗大，导致生产成本过高。
5.昆虫病原线虫是活体生物，其存活、保存需要一定的条件，因而稳定、持效的昆虫病原 线虫剂型加工是作为生物杀虫剂的又一难点。昆虫病原线虫大批量贮存技术主要是通过一定 的方式脱水使线虫进入低湿休眠(anhydrobiosis)状态，或者采用低温储存(4℃左右)，以降 低线虫代谢，从而延长线虫贮存时间。同时培养线虫必须通过洗涤、纯化和收集，通过海绵、 淀粉、硅藻土等吸附或添加甘油、凝胶等方法部分脱水加成块剂、粉剂、胶囊等剂型，并低 温保存以保持线虫活力，延长货架期，进一步增加了生产成本和技术复杂性，制约了昆虫病 原线虫作为生物线虫杀虫剂的实用化。
6.蛹是昆虫从幼虫变化到成虫的一种特定过渡形态，这个阶段幼虫组织器官变态转化成成 虫形态的阶段。蛹体组织富含蛋白质、脂肪、水等营养物质，同时外被半通透膜作用的坚硬 蛹蜕，具有对外进行空气、水分交流功能及阻止外源微生物侵染的作用。草地贪夜蛾属鳞翅 目夜蛾科害虫，是斯氏线虫的天然寄主，其产卵量大、食性杂、适应性强，易于人工规模饲 养，同时斯氏线虫对草地贪夜蛾同样具有感染作用，因而可以利用草地贪夜蛾蛹作为线虫生 物反应器繁殖斯氏线虫，同时以蛹体组织作为感染期线虫生存的天然微生态环境，蛹蜕作为 天然胶囊，加工制备斯氏线虫蛹胶囊制剂，工艺过程简单、生产成本低，常温保存时间长。


技术实现要素：

7.本发明的第一个目的是提供一种斯氏线虫的培养方法，用以解决当前昆虫病原线虫培养 工艺过程复杂、生产成本高的技术问题。
8.为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案，斯氏线虫的培养方法，所述培养方法 为：
9.利用草地贪夜蛾的蛹作为斯氏线虫内生细菌的生物反应器，蛹体内注射并扩增内生细菌 后，接种感染期斯氏线虫，通过自然侵染进入蛹体内，取食内生细菌和蛹细胞组织繁殖子代 昆虫病原昆虫。
10.本发明培养方法，线虫内生细菌菌进入草地贪夜蛾蛹血腔后，利用蛹细胞组织繁殖，虫 体内产生大量的内生细菌，内生细菌令草地贪夜蛾发病致死，接种的斯氏线虫通过自然侵染 进入蛹体内，取食内生菌和蛹细胞组织营养成分和水生长繁殖，产生子代线虫。工艺过程简 单、生产成本低。
11.对本发明技术方案的进一步改进，所述培养方法具体为：
12.(1)注射内生细菌为无菌条件下分离斯氏线虫专性内生细菌，nbta培养基上获得蓝色内生 菌单菌落(图1)，tsb培养基中振荡培养获得内生细菌培养液，以内生细菌单菌培养液作为 蛹接种内生菌源，以无菌水稀释培养液至1
×
105cfu/ml供注射接种。
13.(2)选择人工饲料批量饲养繁殖的草地贪夜蛾1-3日龄蛹为昆虫病原线虫的繁殖寄主；用微 量注射器将线虫内生细菌注射入草地贪夜蛾蛹腹部，内生细菌接种量300-500cfu/头，室温培 养24h蛹内繁殖内生细菌；
14.(3)将侵染期斯氏线虫接种到注入内生细菌的草地贪夜蛾蛹上，线虫通过气孔、节间膜等部 位自然感染进入蛹内，感染线虫取食蛹体内内生细菌和蛹体营养物质，生长繁殖3-5d产生子 代斯氏线虫。
15.对本发明技术方案的进一步改进，所述步骤(2)内生细菌接种方法：以1-3日龄的蛹注 不同浓度内生细菌后，不同蛹龄的草地贪夜蛾蛹接种内生菌(300-500cfu/头)都能导致蛹快 速死亡，蛹感染死亡率都为100％。因此选择蛹接种斯氏线虫内生菌浓度为300-500cfu/头。
16.对本发明技术方案的进一步改进，所述步骤(2)内生细菌接种方法：1-3龄草地贪夜蛾 蛹接种内生菌后，内生细菌进入蛹血腔，利用蛹细胞组织繁殖，蛹体内繁殖产生大量的内生 细菌，不同蛹龄内生菌增殖数量差异显著，随蛹龄增加内生菌数量显著下降，以1日龄蛹增 殖数量最高，达2.67
×
109cfu/头。因此选择1日龄草地贪夜蛾蛹接种300-500cfu/头斯氏线虫内 生菌以繁殖内生细菌。
17.对本发明技术方案的进一步改进，所述步骤(2)线虫感染方法：接种内生菌24h的蛹平 铺于底部垫有湿润滤纸的容器中，将侵染期斯氏线虫悬浮液按每头蛹500-1500ijs的量均匀喷 施到蛹上，置相对湿度90％、20-25℃培养箱中培养3-5d。不同日龄蛹草地贪夜蛾蛹中产生大 量线虫，但不同蛹龄对线虫产量有显著影响，随蛹日龄增加线虫产量逐步降低，与蛹中共生 菌含量呈正相关。不同线虫接种浓度间也存在一定差别。
18.对本发明技术方案的进一步改进，侵染期斯氏线虫悬浮液均匀喷施到蛹上的量为每头蛹 1000-1500ijs。以1000ijs/头和1500ijs/头单蛹接种量线虫产量高明显高于500ijs/头接种量，1 日龄蛹中线虫产量分别达7.83
×
104ijs/蛹和1.17
×
105ijs/蛹。
19.本发明的第二个目的是提供一种斯氏线虫蛹胶囊制剂及其制备方法，用以解决传统培养 方法收集线虫加工特殊剂型并需要低温保存、加工难度大的技术问题。
20.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案，斯氏线虫蛹胶囊制剂，利用上述任一项的 斯氏线虫的培养方法，形成蛹蜕自然包裹昆虫病原线虫的蛹胶囊，蛹表面以聚乙烯醇包衣水 溶性半透膜，获得斯氏线虫蛹胶囊制剂。利用天然的蛹蜕作为蛹胶囊外壳，并进行包衣，本 发明剂型加工方便、成本低廉。
21.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案，斯氏线虫蛹胶囊制剂的制备方法：
22.利用上述任一项的斯氏线虫的培养方法，形成蛹蜕自然包裹昆虫病原线虫的蛹胶囊；
23.以聚乙烯醇溶液(10％，w/w)喷淋蛹体表面，使蛹全部湿润，室温条件下风干后蛹表面 形成水溶性半透膜，获得斯氏线虫蛹胶囊制剂。
24.对本发明技术方案的进一步改进，所述斯氏线虫蛹胶囊制剂的贮存温度为20-25℃。以 草地贪夜蛾蛹繁殖线虫制备的蛹胶囊制剂中斯氏线虫存活率较高、感染活性强，常温条件下 (20-25℃)保存，线虫存活率仍高达78％以上，100ijs/头浓度草地贪夜蛾致死率达100％。
25.对本发明技术方案的进一步改进，所述斯氏线虫蛹胶囊制剂的贮存温度为15-20℃，线虫 存活率仍高达91.67％以上，100ijs/头浓度草地贪夜蛾致死率达100％。
附图说明
26.图1本发明实施例1斯氏线虫分离共生菌的菌落特征。
具体实施方式
27.实施例1
28.斜纹夜蛾幼虫体繁殖的斯氏线虫感染期虫态(ij)以无菌水洗涤配制成1
×
106ijs/ml。移 液器吸取20ul至灭菌的离心管中，以无菌水离心洗涤后，加入500μl 75％乙醇消毒30s， 再以无菌水清洗三次。无菌研磨后加入200μl无菌水重悬线虫，涂布于nbta培养基，28℃ 培养48h后观察菌落形态及色素吸收。挑取蓝色目标菌在nbta培养基上进一步纯化，获得 菌落形态一致、吸附蓝色的斯氏线虫共生菌(图1)。纯化单菌落接种到tsb培养基中振荡培 养24h(28℃，200r/min)，显微镜检并以无菌水稀释至1.0
×
106cfu/ml菌液4℃保存。
29.取草地贪夜蛾1d、2d、3d不同蛹龄的蛹，75％乙醇表面消毒3min后风干。蛹腹部以 微量注射器分别注射0.3μl和0.5μl共生菌(1.0
×
106cfu/ml)于血腔中，另以注射0.2μl无 菌水处理作对照，置于培养皿室温避光培养24h，检查蛹死亡率(触碰尾部不同为死亡)。每 处理随机取样5头，置于75％乙醇中消毒3min后，无菌水清洗3次，置于离心管中研磨， 以无菌水稀释至适宜浓度后涂布nbta培养基平板，观察计数吸附的蓝色线虫内生菌菌落数， 计算不同蛹龄、内生菌不同接种浓度蛹体内内生菌的增殖数量。结果表明，不同蛹龄的草地 贪夜蛾接种内生菌都能导致蛹快速死亡，注释不同浓度内生菌蛹死亡率都为100％。内生菌进 入蛹血腔后，利用蛹细胞组织繁殖，虫体内产生大量的内生菌，不同蛹龄内生菌增殖数量差 异显著，随蛹龄增加内生菌数量显著下降，以1日龄蛹增殖数量最高，达2.67
×
109cfu/头。因 此选择1日龄草地贪夜蛾蛹接种300-500cfu/头斯氏线虫内生菌以繁殖内生菌(表1)。
30.表1不同日龄草地贪夜蛾注射接种斯氏线虫内生菌
[0031][0032]
实施例2
[0033]
按实施案例1处理的不同日龄蛹平铺于底部平坦的容器中，容器底部铺垫一层湿润滤纸 保湿。侵染期线虫按每蛹500、1000、1500ijs浓度均匀喷洒在蛹表面，以保鲜膜覆盖容器口 保湿，25℃条件下静置培养5d。10％的聚乙烯醇溶液喷淋蛹体表面，使蛹全部湿润，室温条 件下风干后制备获得斯氏线虫蛹胶囊制剂，塑料瓶中密封保存。
[0034]
取样检测蛹体内的昆虫病原线虫数量和虫态。显微镜下不同处理的蛹体滴加一滴无菌水， 刺破蛹蜕，蛹中都可见大量首尾摇动的线虫自蛹内游离到无菌水中。将蛹进一步破碎，置于 单层滤纸的漏斗中，下置装有无菌水的烧杯，水面接近滤纸，以水诱法分离收集蛹体内的线 虫。吸取烧杯中线虫液显微镜下观察计算线虫浓度，计算不同处理蛹中线虫的
含量。试验结 果表明，不同日龄蛹草地贪夜蛾蛹中产生大量线虫，但不同蛹龄对线虫产量有显著影响，随 蛹日龄增加线虫产量逐步降低，与蛹中共生菌含量呈正相关。不同线虫接种浓度间也存在一 定差别，以1000ijs/头和1500ijs/头单蛹接种量线虫产量高明显高于500ijs/头接种量，1日龄 蛹中线虫产量分别达7.83
×
104ijs/蛹和1.17
×
105ijs/蛹(表2)。
[0035]
表2不同蛹龄草地贪夜蛾蛹不同接种量斯氏线虫繁殖量
[0036][0037]
实施例3
[0038]
上述线虫蛹胶囊制剂分别在10℃、20℃、25℃条件下保存6个月，按实施案例2的方法 取样检查斯氏线虫的存活率。结果表明，不同温度条件下保存的蛹胶囊中线虫存活率分别为 93.33％、91.67％和78.13％。将蛹胶囊破碎后置于烧杯中，加入无菌水振荡悬浮线虫，使线虫 浓度达1.0
×
103ijs/ml。另24孔板每孔预先内垫1层滤纸，加100μl无菌水湿润， 每板分别接入3龄草地贪夜蛾幼虫24头后，滤纸上滴加1.0
×
103ijs/ml的线虫悬浮液100μl， 使每孔线虫剂量(线虫/幼虫)达100ijs/头，每处理重复3次，另以清水处理为对照。保鲜 带封口后置于25℃生化培养箱中培养，72h检查并记录幼虫死亡数，计算校正死亡率以测定 蛹胶囊中斯氏线虫对草地贪夜蛾感染活性。结果表明，蛹胶囊中斯氏线虫对草地贪夜蛾3龄 幼虫具有高感染致死活性，不同温度处理的蛹胶囊按100ijs/头接种，草地贪夜蛾死亡率都达 100％(表3)。说明以草地贪夜蛾蛹繁殖线虫制备的蛹胶囊制剂中斯氏线虫存活率较高、感染 活性强，常温条件下(20-25℃)保存，线虫存活率仍高达78％以上，100ijs/头浓度草地贪夜 蛾致死率达100％，克服了传统培养方法收集线虫需要低温保存的缺点和难题。
[0039]
表3线虫蛹胶囊斯氏线虫的存活率及对草地贪夜蛾幼虫的感染活性
[0040]
贮存温度(℃)线虫存活率(％)草地贪夜蛾死亡率(％)1593.33
±
5.121002091.67
±
3.901002578.13
±
7.43100