一种卟啉共价有机骨架材料及其制备方法与应用

1.本发明属于复合材料及检测技术领域，具体涉及一种卟啉共价有机骨架材料及其制备方法与应用。


背景技术：

2.实时检测活细胞释放的生物活性分子对于了解细胞功能和病理机制以及在疾病诊断中具有重要意义。在这些生物分子中，一氧化氮(no)是由多种哺乳动物细胞内源产生的重要自由基信使，在许多生物学和病理学途径(例如中枢神经系统调节，血管松弛，免疫反应，炎症，抗炎)中起着关键作用。no的分泌不足会导致高血压和动脉硬化，而no的分泌过量则会导致糖尿病(i型和ii型)、中风和感染性休克。据报道，在帕金森病、阿尔茨海默病、多发性硬化症和肌萎缩侧索硬化症等神经系统疾病中，发现no产生过多。因此，no的准确和定量检测可能有助于更深入地了解其在这些生理过程中的基本功能。然而，生物环境中no对含氧和含金属蛋白质的高扩散率、低浓度和高反应性使得实时、定量检测非常困难。
3.化学技术是基于电流信号和不同浓度的分析物之间的关系发展起来的一种很有前途的检测方法。近年来，电化学传感技术因其具有灵敏度高、成本低、易于小型化等优点，被广泛应用于检测多种生物活性分子，如肿瘤标志物、癌细胞、h2o2、h2s等。光电化学传感平台因其低信号背景、廉价的光电器件和高灵敏度而备受关注，因此研究一种新型电化学(ec)-光电化学(pec)双模式传感器用于检测no是亟待解决的问题。


技术实现要素：

4.本发明的主要目的在于提供一种卟啉共价有机骨架材料及其制备方法与应用，以克服现有技术的不足。
5.为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
6.本发明实施例提供了一种卟啉共价有机骨架材料，所述卟啉共价有机骨架材料中的重复结构单元具有如式(i)所示的结构：
[0007][0008]
其中，虚线代表键连接位置。
[0009]
本发明实施例还提供了前述的卟啉共价有机骨架材料的制备方法，其包括：使包含5，10，15，20-四(4-醛基苯)-21h，23h-卟啉、5，5
′‑
二氨基-2，2
′‑
联吡啶和溶剂的混合反应体系进行缩合反应，制得卟啉共价有机骨架材料。
[0010]
本发明实施例还提供了一种卟啉共价有机骨架材料基双模式生物传感器，其包括前述的卟啉共价有机骨架材料。
[0011]
本发明实施例还提供了前述的卟啉共价有机骨架材料基双模式生物传感器的制备方法，其包括：
[0012]
提供前述的卟啉共价有机骨架材料；
[0013]
将所述卟啉共价有机骨架材料施加于玻碳电极表面，制得卟啉共价有机骨架材料基双模式生物传感器。
[0014]
本发明实施例还提供了前述的卟啉共价有机骨架材料或卟啉共价有机骨架材料基双模式生物传感器于检测no中的用途。
[0015]
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
[0016]
(1)本发明将5，10，15，20-四(4-醛基苯)-21h，23h-卟啉(p-cho)与5，5
′‑
二氨基-2，2
′‑
联吡啶通过缩合反应合成一种二维共价有机骨架(卟啉共价有机骨架材料)，其可以用于制备ec-pec 双模式生物传感器；
[0017]
(2)本发明制备的卟啉共价有机骨架材料不仅对no表现出优异的电催化性能，而且表现出较高的电化学和光电流响应，因此制备的卟啉共价有机骨架材料基双模式生物传感器可用于检测no。
附图说明
[0018]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，
还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0019]
图1是本发明实施例1制备的卟啉共价有机骨架材料(p-cof)的固体核磁图谱；
[0020]
图2a-图2b是本发明实施例1制备的卟啉共价有机骨架材料(p-cof)的xrd图和红外光谱图；
[0021]
图3a-图3e是本发明实施例1制备的卟啉共价有机骨架材料的低倍、高倍sem图像以及低倍tem、高倍tem和hr-tem图像；
[0022]
图4a-图4b是本发明实施例1制备的卟啉共价有机骨架材料(p-cof)的吸附脱附曲线和孔径分布曲线；
[0023]
图5a-图5d是本发明实施例1制备的卟啉共价有机骨架材料(p-cof)的xps图谱；
[0024]
图6是本发明实施例1制备的卟啉共价有机骨架材料对l929细胞和b16细胞的细胞活力图；
[0025]
图7a-图7d是本发明实施例4中p-cof基双模式生物传感器的电化学传感性能图；
[0026]
图8a-图8b是本发明实施例4中p-cof基双模式生物传感器的电化学灵敏度测试图；
[0027]
图9a-图9d是本发明实施例4中p-cof基双模式生物传感器对no的选择性、重复性、重现性和稳定性测试图；
[0028]
图10a-图10b是本发明实施例4中p-cof基双模式生物传感器对癌细胞释放no的原位检测图；
[0029]
图11a-图11b是本发明实施例4中p-cof基双模式生物传感器的光电化学传感性能图；
[0030]
图12a-图12d是本发明实施例4中p-cof基双模式生物传感器对no的选择性、重复性、重现性和稳定性测试图；
[0031]
图13a-图13d是本发明实施例4中p-cof基双模式生物传感器的紫外-可见漫反射光谱；
[0032]
图14是本发明实施例4中p-cof基双模式生物传感器上no的光电催化机理图。
具体实施方式
[0033]
鉴于现有技术的缺陷，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，其主要用5，10，15，20-四(4-醛基苯)-21h，23h-卟啉(p-cho)和5，5
′‑
二氨基-2，2
′‑
联吡啶(bpy)(同时记为p-cho)作为配体通过缩合反应合成一种二维共价有机骨架(p-cof)，探索其作为no 检测的新型ec-pec双模式传感平台。
[0034]
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0035]
具体的，作为本发明技术方案的一个方面，其所涉及的一种卟啉共价有机骨架材料，所述卟啉共价有机骨架材料中的重复结构单元具有如式(i)所示的结构：
[0036][0037]
其中，虚线代表键连接位置。
[0038]
在一些优选实施方案中，所述卟啉共价有机骨架材料具有非晶态的球状纳米结构。
[0039]
进一步地，所述卟啉共价有机骨架材料具有丰富的氧空位、大量的π-π*键和含氮基团，不仅表现出优异的电化学活性，而且表现出优异的光活性。
[0040]
本发明实施例的另一个方面还提供了前述的卟啉共价有机骨架材料的制备方法，其包括：使包含5，10，15，20-四(4-醛基苯)-21h，23h-卟啉、5，5
′‑
二氨基-2，2
′‑
联吡啶和溶剂的混合反应体系进行缩合反应，制得卟啉共价有机骨架材料。
[0041]
在一些优选实施方案中，所述制备方法具体包括：将5，10，15，20-四(4-醛基苯)-21h，23h
‑ꢀ
卟啉、5，5
′‑
二氨基-2，2
′‑
联吡啶与溶剂混合，加入乙酸超混合并进行冷冻干燥处理，之后在保护性气氛中，温度为110～130℃的条件下进行缩合反应48～84h，获得所述卟啉共价有机骨架材料。
[0042]
进一步地，所述5，10，15，20-四(4-醛基苯)-21h，23h-卟啉与5，5
′‑
二氨基-2，2
′‑
联吡啶的摩尔比为1∶1～1∶3。
[0043]
进一步地，所述制备方法还包括：在所述缩合反应完成后，对所获产物进行离心、纯化、干燥处理。
[0044]
进一步地，所述溶剂为1，2-二氯苯与正丁醇形成的混合溶剂，且不限于此。
[0045]
在一些更为具体的优选实施方案中，所述卟啉共价有机骨架材料的制备方法包括：在 20ml的史莱克管中，先加入5，10，15，20-四(4-醛基苯)-21h，23h-卟啉(记为p-cho，60mg， 0.08mmol)和5，5
′‑
二氨基-2，2
′‑
联吡啶(记为bpy，31mg，0.17mmol)，再加入1，2-二氯苯(5ml) 和正丁醇(5ml)的混合溶剂中，超声10min，使反应物溶解，然后向混合溶液中加入乙酸(50μl)，再超声5min后，将混合物用液氮冷冻干燥3次，随后，将史莱克管转移到油浴锅中，并在 n2气氛下120℃反应72h，自然冷却至室温后，将产物以10000rpm离心5min进行分离，进一步用乙醇纯化3次，然后在80℃的烤箱中干燥12h，获得棕色粉末，即卟啉共价有机骨架材料(记为p-cof，59mg，产率为65％)，卟啉共价有机骨架材料的反应如下式所示：
[0046][0047]
本发明实施例的另一个方面还提供了一种卟啉共价有机骨架材料基双模式生物传感器，其包括前述的卟啉共价有机骨架材料。
[0048]
本发明实施例的另一个方面还提供了前述的卟啉共价有机骨架材料基双模式生物传感器的制备方法，其包括：
[0049]
提供前述的卟啉共价有机骨架材料；
[0050]
将所述卟啉共价有机骨架材料施加于玻碳电极表面，制得卟啉共价有机骨架材料基双模式生物传感器。
[0051]
在一些优选实施方案中，所述制备方法具体包括：
[0052]
将所述卟啉共价有机骨架材料与超纯水混合并经超声处理获得卟啉共价有机骨架材料悬浮液；
[0053]
以及，将所述卟啉共价有机骨架材料悬浮液施加于玻碳电极表面，再经后处理，获得所述卟啉共价有机骨架材料基双模式生物传感器。
[0054]
本发明中所述卟啉共价有机骨架材料基双模式生物传感器为一种新型电化学(ec)-光电化学(pec)双模式传感器。
[0055]
具体的，所述卟啉共价有机骨架材料基双模式生物传感器的制备方法包括：
[0056]
(1)玻碳电极的预处理：
[0057]
依次用0.3μm和0.05μm氧化铝粉末抛光玻碳电极(gce，直径5mm)，并用milli-q水冲洗。然后，用食人鱼溶液(h2so4∶h2o2＝7∶3)清洗gce 15分钟，并用乙醇和超纯水超声冲洗5分钟，然后在氮气下干燥。最后，采用循环伏安法在0.5m h2so4中以100mv
·
s-1
在-1.0～1.0 v重复扫描，将gce预处理活化，直至获得标准循环伏安法(cv)，将其用mil-li-q水冲洗并在氮气下干燥备用。
[0058]
(2)卟啉共价有机骨架材料基双模式生物传感器的构筑
[0059]
将p-cof(10mg)分散在milli-q水中(10ml)，然后超声处理20min以形成均匀悬浮液(1 mg
·
ml-1
)。接着将20μl材料悬浮液滴到gce表面并在空气中干燥。之后，用过量的milli-q 水清洗修饰电极，去除电极上松散包覆的p-cof，然后在室温下干燥，制得卟啉共价有机骨架材料基双模式生物传感器(p-cof基双模式生物传感器)，记作p-cof/gce。所制备的电化学传感器在使用前都储存在4℃下。
[0060]
本发明中的卟啉共价有机骨架材料具有很好的生物相容性和较低的细胞毒性，可用于检测细胞中释放no分子的传感平台。
[0061]
本发明实施例的另一个方面还提供了前述的卟啉共价有机骨架材料或卟啉共价有机骨架材料基双模式生物传感器于检测no中的用途。
[0062]
例如，卟啉共价有机骨架材料或卟啉共价有机骨架材料基生物传感器于检测活细胞释放 no中的用途。
[0063]
下面结合若干优选实施例及附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，本实施例在以发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0064]
下面所用的实施例中所采用的实验材料，如无特殊说明，均可由常规的生化试剂公司购买得到。本发明中所使用的水全部为超纯水(电阻率＞18.25mω
·
cm-1
)；本技术使用的主要试剂如表1所示。
[0065]
表1本发明使用的主要试剂
[0066][0067][0068]
样品制备过程中使用的主要设备仪器如表2所示。此外，本实验还使用了烧杯、烧瓶、量筒、离心管、磁转子、有机塑料培养皿、称量瓶、玻璃棒、不锈钢药匙、镊子、滴管和保鲜膜等。本实验所使用的水全部为超纯水(电阻率＞18.25mω
·
cm-1
)，氯化乙酰胆碱 (c7h
16
no2·
cl)来自阿拉丁化学试剂有限公司。
[0069]
表2本发明使用的主要实验仪器
[0070][0071]
实施例1卟啉共价有机骨架材料的制备
[0072]
在20ml的史莱克管中，先加入5，10，15，20-四(4-醛基苯)-21h，23h-卟啉(记为p-cho， 60mg，0.08mmol)和5，5
′‑
二氨基-2，2
′‑
联吡啶(记为bpy，31mg，0.17mmol)，再加入1，2-二氯苯(5ml)和正丁醇(5ml)的混合溶剂中，超声10min，使反应物溶解，然后向混合溶液中加入乙酸(50μl)，再超声5min后，将混合物用液氮冷冻干燥3次，随后，将史莱克管转移到油浴锅中，并在n2气氛下120℃反应72h，自然冷却至室温后，将产物以10000rpm离心5min 进行分离，进一步用乙醇纯化3次，然后在80℃的烤箱中干燥12h，获得棕色粉末，即卟啉共价有机骨架材料(记为p-cof，59mg，产率为65％)。
[0073]
性能表征：
[0074]
本实施例制备的卟啉共价有机骨架材料(p-cof)的固体核磁图谱如图1所示，xrd图谱、ft-ir光谱分别如图2a-图2b所示；从p-cof的x射线衍射(xrd)如图2a中可以看出，在2θ＝20.4
°
的特征衍射处，出现一个主峰，对应于非晶态石墨，在2θ＝6.8
°
处出现一个弱峰；图2b的傅里叶转换红外光谱(ft-ir)可以看出，在1601cm-1
处的特征吸附峰为苯骨架振动吸附峰，在1700cm-1
处的特征吸附峰为p-cof与5，10，15，20-四(4-醛基苯)-21h，23h-卟啉中醛基 (-cho)中的c＝o伸缩振动峰。在1639cm-1
附近是5，5
′‑
二氨基-2，2
′‑
联吡啶中n-h弯曲振动。 p-cof的ft-ir光谱中，在1620cm-1
处出现一个新峰为亚胺(c＝n)的伸缩振动，表明 5，10，15，20-四(4-醛基苯)-21h，23h-卟啉中的醛基与5，5
′‑
二氨基-2，2
′‑
联吡啶中的氨基发生了席夫碱反应，成功合成出cof。图3a-图3b为本实施例制备的卟啉共价有机骨架材料(p-cof) 低倍和高倍sem图像，合成的p-cof为球形结构，分布不均匀，表面光滑；图3c-图3e为 p-cof的低倍tem、高倍tem和hr-tem图像，p-cof的低倍tem显示其由大量尺寸为 0.9-1μm的纳米球组成，高倍tem图像显示p-cof纳米球是多层组装的，在p-cof的hr-tem 图像中未观察到清晰的晶格条纹，表明其非晶态结构；
[0075]
图4a-图4b是本实施例制备的卟啉共价有机骨架材料(p-cof)的吸附脱附曲线和
孔径分布曲线；
[0076]
图5a是本实施例制备的卟啉共价有机骨架材料(p-cof)的xps图谱，xps测量扫描光谱证实了p-cof中c 1s(284.9ev)、n 1s(398.6ev)和o 1s(532.2ev)信号的共存。利用 xpspeak1软件对p-cof的高分辨c 1s、n 1s和o 1s谱进行了拟合分析(图5b-图5d)。c 1s xps谱被分为c-c(sp2)(283.65ev)、c-c(sp)(284.2ev)、c-n(284.7ev)、c-o(285.4ev)、 c＝o(287ev)、n-c＝o(289.3ev)和π-π
*
(291.95ev)。其中，c-c(sp2)和π-π
*
峰的高强度表明p-cof具有高共轭结构。n 1sxps光谱可分为-n＝(397.3ev)、吡啶氮(398.2ev)、吡咯氮 (399.2ev)和少量石墨氮(402.1ev)4个峰。值得注意的是，在o1sxps光谱中观察到了结合能为531.4ev处的峰，这是由于o空位的存在；结合能为532.6ev和535.4ev处是少量的c-o 和吸附h2o所致。
[0077]
细胞毒性表征：
[0078]
癌细胞b16在含有10％热灭活的胎牛血清和抗生素(每毫升50单位的青霉素和每毫升50 单位的链霉素)的达尔伯克改良伊格尔培养基(dmem培养基)中生长。将细胞保持在37℃， 5％co2中直至使用。
[0079]
通过3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(mtt)测定评估p-cof对癌细胞b16 的体外细胞毒性。在用p-cof处理之前，将细胞接种在96孔板中，密度为800个细胞，并孵育。24h后，用含有不同浓度p-cof的培养基替换原来培养基，再培养24h。随后，弃去培养基，而用pbs洗涤癌细胞b16两次。在培养基中孵育24h后，加入mtt(5mg_ml-1
，20μl)，然后再培养细胞4h。最后，将二甲基亚砜(150ml)加入板孔中，然后将板振荡15min。用酶标仪测量488nm处的吸光度值6s。
[0080]
用mtt法评价所制备样品的生物细胞毒性。将正常细胞l929和癌细胞b16暴露于浓度范围在20-200μg
·
ml-1
的p-cof分散液中。随着浓度的增加，p-cof对正常细胞和癌细胞的存活率降低。如图6所示，当材料达到200μg
·
ml-1时，约85.5％的l929正常细胞存活，而约75.5％的b16癌细胞存活。这表明p-cof具有较低的细胞毒性以及良好的生物相容性。
[0081]
实施例2卟啉共价有机骨架材料的制备
[0082]
在20ml的史莱克管中，先加入5，10，15，20-四(4-醛基苯)-21h，23h-卟啉(记为p-cho， 60mg，0.08mmol)和5，5
′‑
二氨基-2，2
′‑
联吡啶(记为bpy，25mg，0.14mmol)，再加入1，2-二氯苯(5ml)和正丁醇(5ml)的混合溶剂中，超声10min，使反应物溶解，然后向混合溶液中加入乙酸(50μl)，再超声5min后，将混合物用液氮冷冻干燥3次，随后，将史莱克管转移到油浴锅中，并在n2气氛下125℃反应72h，自然冷却至室温后，将产物以10000rpm离心5min 进行分离，进一步用乙醇纯化3次，然后在80℃的烤箱中干燥12h，获得棕色粉末，即卟啉共价有机骨架材料(记为p-cof，53mg，产率为58％)。
[0083]
实施例3卟啉共价有机骨架材料的制备
[0084]
在20ml的史莱克管中，先加入5，10，15，20-四(4-醛基苯)-21h，23h-卟啉(记为p-cho， 60mg，0.08mmol)和5，5
′‑
二氨基-2，2
′‑
联吡啶(记为bpy，35mg，0.2mmol)，再加入1，2-二氯苯(5ml)和正丁醇(5ml)的混合溶剂中，超声10min，使反应物溶解，然后向混合溶液中加入乙酸(50μl)，再超声5min后，将混合物用液氮冷冻干燥3次，随后，将史莱克管转移到油浴锅中，并在n2气氛下110℃反应80h，自然冷却至室温后，将产物以10000rpm离心5min进行分离，进一步用乙醇纯化3次，然后在80℃的烤箱中干燥12h，获得棕色粉末，即卟啉共价有
机骨架材料(记为p-cof，65mg，产率为72％)。
[0085]
实施例4卟啉共价有机骨架材料基双模式生物传感器的制备
[0086]
(1)玻碳电极的预处理：
[0087]
依次用0.3μm和0.05μm氧化铝粉末抛光玻碳电极(gce，直径5mm)，并用milli-q水冲洗。然后，用食人鱼溶液(h2so4∶h2o2＝7∶3)清洗gce 15分钟，并用乙醇和超纯水超声冲洗5分钟，然后在氮气下干燥。最后，采用循环伏安法在0.5m h2so4中以100mv
·
s-1
在-1.0～1.0 v重复扫描，将gce预处理活化，直至获得标准循环伏安法(cv)，将其用mil-li-q水冲洗并在氮气下干燥备用。
[0088]
(2)卟啉共价有机骨架材料基双模式生物传感器的构筑
[0089]
将p-cof(10mg)分散在milli-q水中(10ml)，然后超声处理20min以形成均匀悬浮液(1 mg
·
ml-1
)。接着将20μl材料悬浮液滴到gce表面并在空气中干燥。之后，用过量的milli-q 水清洗修饰电极，去除电极上松散包覆的p-cof，然后在室温下干燥，制得卟啉共价有机骨架材料基双模式生物传感器(p-cof基双模式生物传感器)，记作p-cof/gce，所制备的电化学传感器在使用前都储存在4℃下。
[0090]
no溶液的配置：
[0091]
通过在1l milli-q超纯水中加入2.42g kh2po4、2.00g kcl，14.45g na2hpo4·
12h2o和 80.03g nacl来配制磷酸盐缓冲液(pbs，0.1m，ph＝7.4)；
[0092]
根据文献报道的方法来制备浓度为1.8mm的饱和no溶液。所有玻璃器皿和pbs溶液在制备前都用氮气脱氧。接下来，用恒压漏斗将6m h2so4缓慢滴入含有饱和nano2溶液的玻璃烧瓶中，然后将气体依次通过2m naoh溶液以去除氧和其他氮氧化物。最后，将no 气体通入装有300mlpbs的密封棕色瓶中30min，得到no饱和溶液。根据文献，饱和no 溶液在20℃下为1.8mm，并在0℃的黑暗中储存以确保3h的稳定性。
[0093]
性能表征：
[0094]
1.p-cof基双模式生物传感器电化学(ec)测量
[0095]
所有电化学测量均在电化学工作站(中国上海chi-660e)上采用三电极体系进行测试，其中gce修饰电极、ag/agcl(饱和kcl)和铂丝分别用作工作电极、参比电极和对电极。以n2饱和pbs为电解质。采用循环伏安法(cv)和安培法评估修饰电极的电催化活性并进行定量检测溶液中的no。
[0096]
p-cof基双模式生物传感器的传感性能测试：如图7a(p-cof在0.1mpbs中不同浓度 no的cv曲线)所示，在0.1m pbs溶液中，扫描速率为100mv
·
s-1
，在空白和no存在下，通过cv来研究p-cof/gce修饰电极的电化学性能。结果表明，在无no存在的情况下，p-cof/gce在0-1.2v范围内没有观察到明显的氧化峰。相反，在pbs电解液中加入不同量的no后，在0.9v(vs.ag/agcl)发现了明显的不可逆氧化峰，表明p-cof对no具有良好的电催化活性。很明显，随着no浓度的增加，阳极峰值电流随之增加，阳极峰值电流与no 浓度呈明显的线性相关，线性相关系数为0.998(如图7b，电流响应随no浓度变化的校正曲线)。这表明，p-cof/gce具有优越的电催化性能，可作为一种电化学生物传感器用于no的定量检测。
[0097]
为了进一步研究p-cof/gce对no的氧化催化机理，在10-120mv
·
s-1
范围内，用cv法测定了不同扫描速率下扫描速率对no氧化的影响(如图7c，在0.1mpbs中，150μmol的no 下不同扫描速率的cv曲线)。说明阳极峰值电流密度在10-120mv
·
s-1
范围内随扫描速率的增
加而线性增加，相关系数为0.9955(如图7d，no氧化峰值电流与扫描速率的线性变化)。这一发现表明了修饰电极表面受动力学过程控制。同时，随着扫描速率的增加，峰电位略有正移，相应的阴极峰没有出现，这表明no电催化氧化过程是不可逆的。本过程的催化机理为：
[0098]
no首先吸附在p-cof上，随后电子转移形成no

并转化为no
2-。no在p-cof上电催化氧化的反应式如下：
[0099]
no-e-→
no

[0100]
no

oh-→
no
2- h

[0101]
p-cof基双模式生物传感器的灵敏度测试：为了定量测定no、电流响应和线性检测范围，向0.01m pbs中连续搅拌加入饱和的no溶液，并记录了p-cof/gce在0.9v外加电位下的电流响应变化。如8a所示，可通过添加饱和的no溶液的瞬间获得no的氧化电流密度，并在不到4s的时间内达到90％的稳态响应电流，该响应时间短于no的生理寿命(～5s)。这主要是由p-cof的高催化活性和较大的π-π
*
共轭结构，促进了电子转移。如图8a的插图所示，在连续添加饱和的no溶液，从0.36μm到44μm的范围内，p-cof/gce的氧化电流密度呈阶梯式增长。如图8b所示，从测定不同no浓度的连续安培曲线推断出传感器的校准曲线。结果表明，在0.36到44μmol的范围内，安培电流响应随no浓度的增加而线性增加，线性回归方程为j(μa
·
cm-2
)＝27.53 3.9c(μm)，回归系数为0.993，对no的检出限(lod)为 17.3nm(s/n＝3)。相比于已报道的基于电化学方法进行no检测的生物传感器，p-cof基生物传感器具有出色的分析性能，具有更宽的线性范围和更低的lod(表3)。
[0102]
表3本发明与其他生物传感器检测no的对比表格。
[0103]
[0104][0105]
p-cof基双模式生物传感器对no的选择性、重现性、重复性和稳定性测试：
[0106]
进一步分析了p-cof基双模式生物传感器对no检测的选择性。选择其他干扰物，包括 kcl、nano2、nacl、h2o2、cacl2、cuso4、葡萄糖(gluose)、尿酸(ua)、多巴胺(da)和抗坏血酸(aa)，作为可能的干扰物。为了验证这种生物传感器的选择性，干扰物的浓度是 no的10倍。如图9a所示，在加入150μm no后，p-cof/gce显示出明显的电流密度变化，而在加入其他干扰物时未发现明显的电流响应。再次注入150μm no后，电流密度迅速增大。这表明p-cof/gce具有良好的选择性和抗干扰能力。
[0107]
此外，在相同条件下平行构建了五个p-cof/gce电极，分别检测同一浓度no溶液，考察p-cof基生物传感器的重复性。如图9b所示，每个修饰的电极检测no的安培响应值都比
较接近。相对标准偏差(rsd)为2.26％，表明构筑的生物传感器具有良好的重现性。此外，连续5次测量，如图9c所示在150μm no下电流响应的rsd低至0.48％，表明构筑的生物传感器具有良好的重现性。
[0108]
为了评估基于p-cof的生物传感器是否可以满足长期测试的要求，将p-cof/gce生物传感器存储在4℃的冰箱中，连续测试15天，如图9d所示观察到的电流密度在15天后约为原始响应的92％，表明生物传感器的具有较高的稳定性。
[0109]
p-cof基双模式生物传感器对癌细胞释放no的原位检测：
[0110]
用p-cof基双模式生物传感器通过安培法原位检测癌细胞b16释放的no，以进一步评估其实际应用性。已知乙酰胆碱能诱导ca
2
大量涌入，从而与癌细胞b16表面的受体结合，然后生成no分子。图10a显示了向癌细胞b16(1
×
105cells
·
ml-1
)中加入不同浓度的乙酰胆碱 (0.4μm、0.6μm、0.8μm和1.0μm)的电流响应，随着ach浓度的增加，可以观察到电流轻微的增加，并在以下测试中选择了1.0mmach。如图10b所示，随着癌细胞b16浓度的增加， p-cof基双模式生物传感器对癌细胞b16的0、1
×
105、2
×
105和1
×
104cells
·
ml-1
的电流响应分别约为0、0.79、2.87和6.57μa
·
cm-2
。电流的变化归因于从癌细胞b16释放的no的氧化。这些结果揭示了p-cof基双模式生物传感器能够实时检测从活癌细胞释放的no的能力。
[0111]
2.p-cof基双模式生物传感器光电化学(pec)测量
[0112]
所有pec实验均在电化学工作站(modulab xm ecs，ametek，american)上进行，使用50w氙灯作为光源。整个pec试验的电压为0v。在标准的三电极结构中，p-cof/gce 电极为工作电极，ag/agcl(饱和kcl)为参比电极，铂丝为辅助电极。在0.1mpbs(ph＝7.4) 中进行pec测量。
[0113]
p-cof基双模式生物传感器的传感性能测试：除了研究p-cof基传感器对no的电化学传感性能外，我们还采用pec技术对no进行了测定。如图11a所示，p-cof/gce的光电流强度δi(δi＝i-i
gce
)的变化约为10na，随后，用p-cof基pec传感器对不同浓度的no进行定量测定，随着no浓度从1μm增加到660μm，p-cof基传感器的光电流响应逐渐增大。如图11b所示，在1μm-660μmno浓度范围内，观察到光电流变化(δi)与no浓度之间存在线性关系，线性回归方程δi(na)＝5.4*logcon
no-16.73，回归系数为0.9914，最低检测限为71.2nm(s/n＝3)，这可以相比于甚至优于已报道的no传感器性能(表3)。
[0114]
p-cof基双模式生物传感器对no的选择性、循环稳定性、重现性和稳定性的测试：进一步分析了p-cof基pec生物传感器对no的选择性，如图12a所示，在体系中加入nacl、 nano2、cacl2、cuso4、k2so4、nacl、葡萄糖和ua等干扰物时(干扰物浓度是no浓度的10 倍)，光电流响应没有明显的变化，而再次加入no后导致光电流的明显变化。这表明p-cof 基pec生物传感器对no有良好的选择性。此外，如图12b所示，p-cof基pec生物传感器在100μm no下，周期性开/关光照20次产生的光电流，没有观察到明显的变化，rsd＝1.1％，表明该光电极具有良好的稳定性。为了进一步探讨生物传感器的重现性，如图12c所示使用在相同条件下构建五个p-cof/gce电极来检测no，其rsd为2.2％，表明其优良的重现性。此外，还探讨了p-cof基pec生物传感器的稳定性，将电极保存在4℃，每3天测量其光电流响应，测量15天后(图12d)，光电流保持在初始值的83.1％，表明该传感器具有可接受的储存稳定性。
[0115]
p-cof基双模式生物传感器的光电催化的机理研究：
[0116]
一般来说，材料的捕光能力以及相应的光生电荷的分离、转移和复合对光催化活
性起着决定性的作用。利用紫外-可见漫反射光谱(drs)研究了所制备p-cof的光吸收特性和能带结构。根据文献报道光催化活性与光吸收能力密切相关。如图13a的紫外-可见吸收光谱所示， p-cof在可见光辐射区域有光响应，并且在400nm有高吸收能力。采用(αhv)n＝k(hv-eg)计算p-cof的带隙能(eg)，确定半导体光催化剂的能带结构。在这个公式中，α是吸收系数， k是常数，n取决于半导体材料的光跃迁形式(n＝1/2或n＝2)。配体分子 (2，2
′‑
bipyridine-5，5
′‑
diamine、p-cho)和p-cof的带隙分别为3.10ev、2.92ev和2.83ev(图 13b)。这说明所制备的p-cof具有较低的带隙，有利于对可见光进行吸收和利用，从而产生更多的光生电子-空穴对，提高光催化效率。
[0117]
如图13c的荧光光谱所示，相对于配体分子，p-cof具有更低的荧光发射强度。发光强度可以反映光催化剂光生电荷分离或复合的可能性，因此p-cof具有较高的光生电子-孔穴分离效率。
[0118]
采用电化学测试不同频率下获得的mott-schottky曲线用于进一步揭示p-cof电子特性。如图13d所示，获得的曲线具有正斜率，意味着p-cof具有n型半导体特性。p-cof的平带电位为-0.61v(相对于ag/agcl电极)。因此，p-cof的平带电位估计为-0.41v(相对于nhe 电极)。一般而言，n型半导体的导带(e
lumo
)比平带电位更负约0.1或0.2v。因此，p-cofe
lumo
估算为-0.61v。在这种情况下，根据方程e
homo
＝e
lumo
eg，推导出p-cof材料的价带 (e
nomo
)位置为2.22v。溶液中的no是一种高活性的自由基分子，可以得到一个被还原的电子(no e
→
no-，e＝-0.33v vs.nhe)。所以高能电子导带上的电子转移到溶液中的电子受体no上，导致no的还原，同时电极上的电子转移到价带上的空穴中，产生阴极光电流。具体的光电流产生机制如图14所示。
[0119]
本发明以5，10，15，20-四(4-醛基苯)-21h，23h-卟啉和5，5
′‑
二氨基-2，2
′‑
联吡啶为原料，合成出卟啉基p-cof，并构筑传感器，考察其在电化学和光电化学双模式下对no的检测性能。所合成的p-cof具有纳米球状纳米结构，由多层纳米片组装而成，具有高度共轭的化学结构。 p-cof纳米材料具有丰富的氧空位、大量的π-π
*
键和含氮基团，不仅表现出优异的电化学活性，而且表现出优异的光活性。可用于检测细胞中释放no分子的传感平台。基于p-cof的 ec和pec传感器分别在0.36μm～44μm和1～660μm浓度范围内，对no的最低检测限达为17.3nm和71.2nm，。所研制的p-cof传感器干扰物质下表现出很高的选择性，同时传感器还具有良好的稳定性和重复性，以及检测活癌细胞no的可行性。
[0120]
此外，本案发明人还参照前述实施例，以本说明书述及的其它原料、工艺操作、工艺条件进行了试验，并均获得了较为理想的结果。
[0121]
应当理解，本发明的技术方案不限于上述具体实施案例的限制，凡是在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落于本发明的保护范围之内。