治疗神经和心血管病况的化合物和方法

治疗神经和心血管病况的化合物和方法
1.本技术为申请日2017年4月21日，申请号201780024816.x，名称为“治疗神经和心血管病况的化合物和方法”的发明专利申请的分案申请。
2.相关申请的交叉引用
3.本技术要求2016年4月21日提交的美国临时申请第62/325,860号的权益，其全部内容以引用的方式并入本文中。
技术领域
4.本发明涉及用于从脑、中枢神经系统(central nervous system，cns)或心血管系统的某些病况，如脑损伤、神经退化性病况或心肌缺血中治疗、改善或促进恢复的化合物和其使用方法。
5.政府支持的声明
6.本发明在政府支持下在由美国国家卫生研究院(national institutes of health)授予的授权号ns093756下进行。政府对本发明享有一定权利。


背景技术：

7.脑损伤是令人苦恼的常见医学病况，并且是在世界范围内发病率和死亡率的主要原因之一。因为神经元具有有限的修复能力，所以脑尤其易受损伤影响。当个体出生时，脑已经具有其在生命中将具有的基本上所有的神经元。不同于体内的其它细胞，神经元在出生之后不久停止再制造。如果这些细胞受损或死亡，那么其不被置换，通常导致残疾和基本上不可逆地降低个人的认知和感觉运动能力。导致神经细胞死亡和损害的病况在缺血性发作(例如，中风)和创伤到退化性病症(例如，阿尔茨海默氏病)范围内以。
8.对中枢神经系统(central nervous system，cns)的损伤是在世界范围内死亡和残疾的实质性原因。举例来说，根据cdc，每年大约170万人忍受创伤性脑损伤(tbi)，就医疗成本和损失的生产率而言每年花费美国经济超过$600亿(finkelstein,corso,p；miller,t,美国损伤的发病率和经济负担(the incidence and economic burden of injuries in the united states),牛津大学出版社(oxford university press):纽约(new york),2006)。此外，中风在美国是死亡的第三主要原因，估计发病率为每年795,000例，残疾的主要原因，并且每年花费美国经济超过$340亿(ninds,2014；美国国立中风卫生研究院(stroke.nih.)gov；和mozaffarian d,benjamin ej,go as,等人“心脏病和中风统计-2015年更新：来自美国心脏协会的报告(heart disease and stroke statistics-2015update:a report from the american heart association)”,circulation.2015；e29-322)。
9.在急性设定中，治疗患者在24小时内有机会，这可以限制损害程度。紧接着缺血性或出血性中风，脑中的伤害部位通常含有不可逆地受损的组织核心，并且接着还含有有活性的区域但处于风险组织，称为半影区。在这一时间期间，不充分氧气和葡萄糖供应到脑中导致对半影区的进一步二级损伤。氧气和葡萄糖的缺乏降低细胞线粒体的能量产生。这一能量耗乏的直接作用是离子泵失效，其通过升高细胞外钾(k

)离子，导致脑组织中的复发
性扩散去极化的波。同时，钠(na

)离子灌注到细胞中，之后为氯(cl-)离子，导致由于渗透压升高、神经元和其过程附近的加压细胞的肿胀，最终使得裂解(细胞破裂)和发炎性反应。一般而言，离子内稳定的这一干扰导致兴奋性毒性、细胞肿胀和细胞死亡，其将损害延伸到邻近组织并且通过来二级机理扩展病灶。在初始24小时期间需要有效治疗以保护加压的脑细胞。中风中脑损害的增殖类似于以脑损伤的其它形式观察到的损害，如创伤和震荡。
10.除急性治疗之外，有效星形胶质细胞功能在广泛神经修复中起关键作用-在患有神经退化，如阿尔茨海默的患者中或最常见于老年个体中在脑伤害后的24-96小时时间内，在几个月-几年的时间内。脑细胞不能再生需要保持脑组织完整以重组以图恢复任何功能缺失。神经重组的这一潜能在老年个体中减弱。
11.gpcr受体已表明介导心脏保护作用。因此，利用调节这些受体通过行为的相似机理治疗心脏和心血管病况是有可能的。
12.急迫并且迫切的未满足的医学需要更有效治疗脑损伤、cns损伤、心脏和心血管疾病和相关病况，以及促进患有神经退化性病况，如阿尔茨海默的患者的神经修复。


技术实现要素：

13.在一个方面，本发明提供一种治疗选自创伤性脑损伤(traumatic brain injury，tbi)、中风、神经退化性病况、或心脏或心血管疾病的损伤、疾病或病况的方法，所述方法包含向有需要的患者施用有效量的a3腺苷受体(a3r)的激动剂。
14.在一个方面，本发明提供一种治疗选自创伤性脑损伤(tbi)、中风、神经退化性病况、或心脏或心血管疾病的损伤、疾病或病况的方法，所述方法包含向有需要的患者施用有效量的选自以下的a3腺苷受体(a3r)的偏向激动剂、部分激动剂、或偏向部分激动剂
[0015][0016]
其医药学上可接受的盐或包含其的医药学上可接受的组合物。
[0017]
在另一方面，本发明提供一种治疗选自创伤性脑损伤(tbi)或中风的脑或中枢神经系统(cns)损伤或病况的方法，所述方法包含向有需要的患者施用有效量的选自以下的化合物：
[0018][0019]
其医药学上可接受的盐或包含其的医药学上可接受的组合物。
[0020]
在另一个方面，本发明提供选自由以下组成的群组的化合物：
[0021][0021][0021]
其中每种化合物可呈北或南构象，或甲醇碳糖可以被d-核糖置换；或其医药学上可接受的盐；或其单、二或三磷酸盐或单、二或三磷酸盐的医药学上可接受的盐。
[0022]
在另一方面，本发明提供一种治疗或改善创伤性脑损伤(tbi)、辐射损害、中风、偏头痛、心脏或心血管疾病、或神经退化性病症的方法，所述方法包含向有需要的患者施用有效量的所公开的化合物。
[0023]
在另一方面，本发明提供一种治疗或改善创伤性脑损伤(tbi)、辐射损害、中风、偏
头痛、心脏或心血管疾病或神经退化性病症的方法，所述方法包含向有需要的患者施用有效量的选自以下的化合物：腺苷、adp、2-甲硫基-adp三钠盐、atp、atp二钠盐、α,β-亚甲基atp、α,β-亚甲基腺苷5'-三磷酸盐三钠盐、2-甲硫基腺苷三磷酸盐四钠盐、2-mesatp、bzatp三乙基铵盐、肌核苷、胞苷、酰基化胞苷、胞苷-单磷酸盐(cmp)、胞苷二磷酸盐(cdp)、胞苷三磷酸盐(ctp)、cdp-胆碱、cmp-胆碱、地努佛索(denufosol)、地努佛索四钠、gtp、itp、mrs 541、mrs 542、mrs 1760、mrs 2179、mrs 2279、mrs 2341、mrs 2365、mrs 2500、mrs 2690、mrs 2698、mrs 3558、mrs 4322、mrs 5151、mrs 5676、mrs 5678、mrs 5697、mrs 5698、mrs 5923、mrs 5930、苯甲基-neca、ib-meca、cl-ib-meca、lj529、dpma、ccpa、dbxrm、hemado、pemado、heneca、peneca、cp608,039、cp532,903、cgs21680、ar132、vt72、vt158、vt160、vt163、psb 0474、尿苷5'-二磷酸盐(udp)、udp-葡萄糖、尿苷β-硫基二磷酸盐(udpβs)、尿苷5'-三磷酸盐(utp)、尿苷γ-硫代磷酸盐(utpγs)、2-硫基utp四钠盐、utpγs三钠盐、尿苷-5'-二磷酸葡萄糖、二尿苷三磷酸盐、2-(己硫基)(ht)-amp、二腺苷五磷酸盐、2'-脱氧-2'-氨基-utp、2-硫基-utp、三乙酰基尿苷、二乙酰基/酰基尿苷、尿苷、苏拉明(suramin)、双嘧达莫(dipyridamole)类似物、二腺苷四磷酸盐ap4u、ap4a、ins365、ins37217或ins48823；其中每种糖可以被呈北或南构象的甲醇碳糖置换或每种糖可以被d-核糖置换；或其医药学上可接受的盐。
附图说明
[0024]
图1a展示在腹膜内施用之后mrs4322在小鼠中的血浆和脑浓度-时间曲线。图1b展示在静脉内施用之后mrs4322在新生猪中的血浆和脑细胞外液浓度-时间曲线。
[0025]
图2展示在腹膜内施用mrs2365之后mrs4322在小鼠中的血浆和脑浓度-时间曲线。
[0026]
图3展示mrs2365在经过edta处理的小鼠血浆中的活体外稳定性。
[0027]
图4展示mrs2365在经过edta处理的人类血浆中的活体外稳定性。
[0028]
图5展示mrs2365在经过edta处理的小鼠全血中的活体外稳定性。
[0029]
图6展示mrs2365在经过edta处理的人类全血中的活体外稳定性。
[0030]
图7展示mrs2365在经过edta和肝素处理的小鼠血浆中维持90秒孵育时间的活体外稳定性。
[0031]
图8展示mrs2365在经过edta和肝素处理的人类血浆中维持90秒孵育时间的活体外稳定性。
[0032]
图9展示在30分钟孵育之后mrs2365代谢物在肝素化人类血浆中的正离子lc/ms-ms离子色谱图和产物离子光谱。
[0033]
图10在30分钟孵育之后展示mrs2365代谢物在肝素化人类全血中的正离子lc/ms-ms离子色谱图和产物离子光谱。
[0034]
图11展示表示通过肝素化人类血浆和全血中的正和负离子lc/ms-ms检测到的mrs2365的代谢物的流程。在人类全血和血浆中(肝素锂作为抗凝剂)100μm下孵育之后观察到mrs2365的两种代谢物：m2，鉴别为mrs2365的部分地去磷酸化代谢物(即具有磷酸基残留，mrs2347)；和m1，鉴别为mrs2365的完全去磷酸化代谢物(即mrs4322)。
[0035]
图12a-d展示对暴露于tbi或假处理组(对照实验)的小鼠的mrs4322、cl-ib-meca和mrs2365处理的结果。tbi通常诱发gfap表达的增强。小鼠经历假处理组或tbi(在脑的同
侧上)并且接受tbi后30min标记的治疗。血浆从损伤后7天的小鼠中获得，接着处死小鼠以获得来自同侧(“ipsi”)和对侧(“cntr”)半球(中间第三)的脑匀浆。蛋白质印迹分析标准化成肌动蛋白。(图12a和12c)代表性印迹针对第7天的同侧脑匀浆和血浆展示。施用mrs4322或mrs2365减少暴露于tbi的小鼠的gfap表达的脑水平。(图12b和12d)数据从3个不同实验(n＝每次治疗小鼠的数量)汇集并且绘制成条柱频率分布图，展示为对照 /-sem的平均值。来自未治疗tbi的*p《0.05并且**p《0.01(红色条柱)。
[0036]
图13a-d展示光栓疗法诱发的中风梗塞实验的结果和施用mrs4322和/或特定腺苷类型a3受体拮抗剂mrs1523的作用。mrs4322减少中风梗塞的作用，但这些作用由mrs1523逆转。(图13a)使小鼠脑的冠状面切片(每组切片来自单一小鼠)用媒剂(注射的生理盐水)的光栓疗法中风，并且在经过治疗的小鼠中，mrs4322和mrs2365作为标记。中风的小鼠在缺血的30分钟内接受媒剂或治疗(ip注射)。接着在中风24小时后处死小鼠，去除其脑，用ttc切片和染色。(图13b)来自中风的小鼠冠状面切片用a3受体拮抗剂mrs1523预注射。(图13c)平均ttc染色的中风体积mrs4322、mrs2365、mrs5698和cl-ibmeca作为标记。(图13d)用如指示的a3受体拮抗剂mrs1523预治疗的小鼠的中风体积。数据从2个实验(n＝每次治疗小鼠的数量)汇集并且绘制成平均 /-sem。**p《0.01并且***p《0.001。
[0037]
图14a-b展示光栓疗法诱发的中风梗塞实验的结果和施用mrs4322、mrs1873或媒剂的作用。光栓疗法诱发的中风梗塞由mrs4322和mrs1873减少。(图14a)脑的冠状面切片用媒剂(注射的生理盐水)中的光栓疗法中风，并且在经过治疗的小鼠中，mrs4322和mrs2365作为标记。中风的小鼠在缺血的30分钟内接受媒剂或治疗(ip注射)。接着在中风24小时后处死小鼠，去除其脑，用ttc切片和染色。(图14b)平均ttc染色的中风体积作为标记。数据从3个实验(n＝每次治疗小鼠的数量)汇集并且绘制成平均 /-sem。**p《0.01。
[0038]
图15展示适用于所要求的发明的某些化合物的结构。
[0039]
图16展示在静脉内施用之后mrs4322在新生猪中的血浆和脑细胞外液浓度-时间曲线。在向新生猪静脉内施用之后，在血浆、脑脑细胞外液和脑脊髓液样品中可检测到mrs4322浓度。
[0040]
图17展示相对于在cho细胞中表达的人类a3受体处的a3激动剂放射性配体[3h]neca(10nm)，mrs4322的竞争结合实验。mrs4322的计算出的ki值是1490
±
410nm。
[0041]
图18展示相对于在cho细胞中表达的小鼠a3受体处的a3激动剂放射性配体[3h]neca(10nm)，mrs4322的竞争结合实验。mrs4322的计算出的ki值是4940
±
974nm。
[0042]
图19展示在cho细胞中表达的人类a3受体处的mrs4322和neca的camp积累实验。mrs4322的计算出的ec
50
值是3630
±
370nm；对于neca，测定41.8
±
6.3nm的ec
50
值。
[0043]
图20展示在cho细胞中表达的小鼠a3受体处的mrs4322和neca的camp积累实验。mrs4322的计算出的ec
50
值是759
±
170nm；对于neca，测定6.85
±
0.88nm的ec
50
值。
具体实施方式
[0044]
1.脑、cns、心血管和其它损伤和病况
[0045]
在一些实施例中，本发明提供预防和/或治疗与急性脑创伤以及脑和cns的较长期疾病以及心脏和心血管疾病和病况有关的脑损害的新方法。在一个方面，本发明提供通过利用神经保护性和神经恢复性作用治疗这类损伤、疾病和病况的方法，所述作用由现理解
为神经元的主要天然看护细胞的星形胶质细胞以及供应显著部分的脑能量的星形胶质细胞线粒体介导。在另一方面，本发明提供通过由a3r受体介导的心脏保护和再生作用治疗这类损伤、疾病和病况的方法。不希望受理论所束缚，关于神经保护性和神经恢复性作用，人们相信由a3r和/或p2y1受体介导的星形胶质细胞能量代谢的选择性增强促进星形胶质细胞看护功能，如其神经保护性和神经恢复性功能，继而增强神经元和其它细胞对两种急性损伤和长期应激的抗性。在一些情况下，可能有利的是实现偏向，即选择性或优先的一或多种由a3r和/或p2y1受体介导的路径，其中一或多种非所需路径不活化或活化到更小程度。除了或作为星形胶质细胞的一个替代方案，可活化胶质细胞、小胶质细胞、神经元、内皮细胞和其它脑和/或cns细胞类型的神经保护性或神经恢复性功能。因此，在一个方面，本发明提供用于从脑、中枢神经系统(cns)的某些病况，如脑损伤中治疗、改善或促进恢复的化合物和其使用方法，例如通过增强由星形胶质细胞、胶质细胞、小胶质细胞、神经元、内皮细胞或脑和/或cns的其它细胞介导的神经保护和/或神经恢复性作用，所述方法包含向有需要的患者施用有效量的所公开的化合物。
[0046]
星形胶质细胞在支持和保护神经元中起关键作用，并且它们决定性地影响引起脑损害的脑损伤，如缺血性损伤的后果。自身在这些脑功能中起中心作用的星形胶质细胞线粒体很少被认识到。举例来说，星形胶质细胞线粒体的抑制增加肿胀，并且导致坏死细胞死亡。神经元仅当星形胶质细胞粒线体功能失效时才通过复发性扩散去极化永久性地受损，并且需要星形胶质细胞线粒体以减少细胞外k

的病理生理学隆起，其引发扩散去极化。星形胶质细胞上嘌呤能受体的活化导致粒线体ca
2
增加，其增强粒线体柠檬酸循环功能并且提高呼吸和atp产生。因此，在一个方面，本发明涉及发现星形胶质细胞嘌呤能受体的活化增强脑细胞存活信号传递路径，使得星形胶质细胞和神经元在氧化应激期间有活力。此外，活化的星形胶质细胞产生并且供应减少的谷胱甘肽，一种有助于星形胶质细胞和神经元两者对氧化应激的抗性的关键抗氧化剂。因此，在一个方面，本发明提供一种调节星形胶质细胞嘌呤能受体以促进一或多种在氧化应激之后患者的脑中的细胞类型的存活和活力的方法，所述氧化应激如由脑损伤、缺血-再灌注或神经退化性病况引起的氧化应激，所述方法包含向有需要的患者施用所公开的化合物。
[0047]
在一些实施例中，星形胶质细胞的活化通过使一或多种嘌呤能受体，如腺苷受体(ar)，例如与星形胶质细胞有关或由星形胶质细胞表达的受体与所公开的化合物接触，因此调节一或多种受体的活性而实现。在一些实施例中，通过对腺苷受体，如星形胶质细胞上的a1、a
2a
、a
2b
和a3的作用，化合物活化星形胶质细胞以治疗一或多种所公开的疾病或病况。在一些实施例中，在向有需要的患者施用之后，所公开的化合物影响一或多种功能，如谷氨酸吸收、反应性神经胶质增生、肿胀和神经营养的释放以及神经毒性因素，其到代谢应激和其后果有影响，因此治疗一或多种疾病或病况。在一些实施例中，化合物是ar激动剂。在一些实施例中，嘌呤能受体是a3腺苷受体(a3r)。在一些实施例中，化合物是a3r激动剂。在一些实施例中，化合物是a3受体(a3r)，如人类a3受体(ha3r)下的部分激动剂或偏向激动剂或偏向部分激动剂。在一些实施例中，化合物是a3受体处的偏向拮抗剂。在一些实施例中，化合物是mrs4322或mrs1873或其医药学上可接受的盐。
[0048]
p2y受体是g蛋白偶合的受体，并且不同亚型的这些受体在如突触连通、细胞分化、离子流、血管扩张、血脑屏障通透性、血小板凝集和神经调节的过程中具有重要作用。嘌呤
能p2y受体家族的特征化成员包括：哺乳动物p2y1、p2y
11
、p2y
12
和p2y
13
受体，其与腺嘌呤核苷酸结合；p2y4、p2y6和p2y
14
受体，其与尿嘧啶核苷酸结合；和p2y2和啮齿动物p2y4受体，其具有混合选择性。在一些实施例中，星形胶质细胞的活化通过使一或多种嘌呤能受体，如p2y受体，例如与星形胶质细胞有关或由星形胶质细胞表达的受体与所公开的化合物接触，因此调节一或多种受体的活性而实现。在一些实施例中，通过对p2y受体，如与星形胶质细胞有关或由星形胶质细胞表达的p2y1、p2y
11
、p2y
12
和p2y
13
受体的作用，化合物活化星形胶质细胞以治疗一或多种所公开的疾病或病况。在一些实施例中，p2y受体是p2y1受体。在一些实施例中，p2y1受体位于细胞内粒线体膜上。在一些实施例中，化合物是p2y激动剂。在一些实施例中，化合物是p2y1激动剂，例如，在人类p2y1受体处。在一些实施例中，化合物是p2y1受体，如人类p2y1受体处的偏向激动剂、部分激动剂或偏向部分激动剂。在一些实施例中，化合物是p2y1受体处的偏向拮抗剂。在一些实施例中，化合物是mrs4322或其医药学上可接受的盐。
[0049]
在另一方面，本发明提供一种治疗或改善有需要的患者的脑损伤，如由tbi或进行性神经退化性病症造成的脑损伤的方法，所述方法包含向患者施用有效量的所公开的化合物。在一些实施例中，受试者已罹患tbi、震荡、中风、部分或全部脊髓横断或营养不良。在其它实施例中，受试者已罹患毒性神经病、脑膜脑病、由遗传病症引起的神经退化、与年龄有关的神经退化或血管疾病；或揭示于us 8,691,775中的另一种疾病，所述案以引用的方式并入本文中。在其它实施例中，本发明提供一种治疗或改善有需要的患者的脑损伤，如由tbi或进行性神经退化性病症造成的脑损伤的方法，所述方法包含向患者施用有效量的a3r激动剂。在其它实施例中，本发明提供一种治疗或改善有需要的患者的脑损伤，如由tbi或进行性神经退化性病症造成的脑损伤的方法，所述方法包含向患者施用有效量的p2y1激动剂。在一些实施例中，化合物是a3受体处的偏向激动剂、部分激动剂或偏向部分激动剂。在一些实施例中，化合物是p2y1受体处的偏向激动剂、部分激动剂、或偏向部分激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，化合物是mrs4322或mrs1873或其医药学上可接受的盐。
[0050]
在另一方面，本发明提供一种促进有需要的患者的星形胶质细胞介导的神经保护或神经修复的方法，所述方法包含向患者施用有效量的所公开的化合物。在另一方面，本发明提供一种促进有需要的患者的星形胶质细胞介导的神经保护或神经修复的方法，所述方法包含向患者施用有效量的a3r激动剂。在其它实施例中，本发明提供一种促进有需要的患者的星形胶质细胞介导的神经保护或神经修复的方法，所述方法包含向患者施用有效量的p2y1激动剂。在一些实施例中，化合物是a3受体处的偏向激动剂、部分激动剂、或偏向部分激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，化合物是p2y1受体处的偏向激动剂、部分激动剂、或偏向部分激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，化合物是mrs4322或mrs1873或其医药学上可接受的盐。
[0051]
在另一方面，本发明提供一种促进有需要的患者的神经元、神经胶质细胞、内皮细胞或其它脑细胞，如缺血性半影区中的细胞的存活的方法，所述方法包含向患者施用有效量的本文中所公开的化合物。在一些实施例中，本发明提供一种促进有需要的患者的神经元、神经胶质细胞或其它脑细胞，如缺血性半影区中的细胞的存活的方法，所述方法包含向患者施用有效量的a3r激动剂。在一些实施例中，本发明提供一种促进有需要的患者的神经元、神经胶质细胞、内皮细胞或其它脑细胞，如缺血性半影区中的细胞的存活的方法，所述
方法包含向患者施用有效量的p2y1激动剂。在一些实施例中，化合物是a3受体处的偏向激动剂、部分激动剂、或偏向部分激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，化合物是p2y1受体处的偏向激动剂、部分激动剂、或偏向部分激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，化合物是mrs4322或mrs1873或其医药学上可接受的盐。
[0052]
在其它实施例中，患者具有或在获得如以下那些的脑损伤的风险下。因此，还提供治疗下文所论述的病况的方法。
[0053]
创伤性脑损伤
[0054]
创伤性脑损伤(tbi)是令人苦恼的常见医学病况，并且预测其会在2020年前变为全球发病率和死亡率的第三主要原因。没有tbi的经过批准的治疗，并且大多数tbi患者出院而无药理学治疗(witt 2006)。如震荡的反复性tbi可触发年龄相关的神经退化，其经数十年导致一系列症状和残疾(mckee 2013)。tbi可通过运动有关的损伤、汽车事故、摔倒、爆炸性冲击、生理袭击等发生。损伤在其复杂性和严重性方面范围广泛，在损伤之后从心理状态、认知困难或意识丧失的短暂变化的“轻度”震荡到延长时间的不省人事和/或健忘症的“重度”。在美国，大约170万人具有每年导致tbi的损伤并且寻求医学干预(uscsf和cdc)，并且cdc估计160万到380万额外的震荡事件每年在运动和其它娱乐性工作中发生，其不存在到医院或急救部门。(cdc；langlois 2006)大约5-10％的运动员每个体育季会受到震荡。(运动震荡学会2012(sports concussion institute 2012))橄榄球对于男性是具有最高震荡风险的运动(对于震荡75％机会)，而足球对于女性具有最高震荡风险(对于震荡50％机会)。tbi在儿童和年轻成人(cdc)中是死亡和残疾的主要原因，并且是最常受到的军方有关的损伤；自从2003患病的大约20％的美国服务成员已经受至少一种tbi。(神经创伤的慢性作用协会(chronic effects of neurotrauma consortium，cenc)；warden 2006；scholten 2012；taylor 2012；gavett 2011；guskiewicz2005；omalu 2005)全部tbi有关的间接和直接医学成本估计为每年$770亿(ucsf和cdc)。由于tbi(cdc和thurman 1999)，至少5百万美国人在进行活动中需要持续日常支持。
[0055]
根据本发明的星形胶质细胞的活化呈现这类病况的新治疗选项。因此，在一个方面，本文提供一种治疗tbi或促进从tbi中恢复的方法，所述方法包含向有需要的患者施用有效量的所公开的化合物。在一些实施例中，tbi选自对脑(如震荡、冲击伤、格斗相关的损伤)或脊髓(如部分或全部脊髓横断)的创伤性损伤。在一些实施例中，tbi由对头部的轻度、中度或重度的打击造成，包含敞开或封闭的头部伤口，或由对头部的渗透或非渗透打击造成。在一些实施例中，本发明提供一种治疗tbi或促进从tbi中恢复的方法，所述方法包含向有需要的患者施用有效量的a3r激动剂。在一些实施例中，本发明提供一种治疗tbi或促进从tbi中恢复的方法，所述方法包含向有需要的患者施用有效量的p2y1激动剂。在一些实施例中，化合物是a3受体处的偏向激动剂、部分激动剂、或偏向部分激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，化合物是p2y1受体处的偏向激动剂、部分激动剂、或偏向部分激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，化合物是mrs4322或mrs1873或其医药学上可接受的盐。
[0056]
中风
[0057]
当由于缺血性堵塞或从脑中血管的出血性破裂中将氧和营养素运输到脑中的血管断裂，引起脑的断裂区域中的神经元、胶质细胞和内皮细胞死亡时，中风发生。中风的后果视损害的位置和广度而定，并且在通过受损脑区域调控的身体功能中观察到所述损害的
影响。中风可造成单侧或双侧麻痹、言语和语言残疾、记忆力丧失、行为变化和甚至死亡。中风在美国是死亡的第四主要原因，并且是成人残疾的主要原因。每年，约800,000人经历新的或复发性中风。每日，超过2000美国人会患有中风，导致这些事件的超过400的死亡。在2010年，在美国，中风在每19个死亡中占约1个。≥20岁的估计680万美国人已患有中风。(aha和go 2014)从2010年起，中风的每年直接和间接成本估计为$365亿。在中风的几分钟内，血流的缺失将永久性地损害脑组织的核心。在这一受损核心与正常脑组织之间是已知为半影区组织的组织区域，其从减少的血流和能量代谢的一些干扰中在梯度应激下。中风事件之后超过前24-48小时，对半影区中神经元和胶质细胞细胞的应激用一些恢复或其它细胞死亡解决。
[0058]
在一个方面，本发明提供一种中风患者中神经保护性疗法的方法，所述方法包含向有需要的患者施用有效量的所公开的化合物。在一些实施例中，这类疗法尽可能多地抢救半影区，并且/或限制其它急性组织损伤，并且/或促进神经元恢复。在另一方面中提供一种治疗中风或促进从中风中恢复的方法，所述方法包含向有需要的患者施用有效量的所公开的化合物。在另一方面中提供一种治疗中风或促进从中风中恢复的方法，所述方法包含向有需要的患者施用有效量的a3r激动剂。在一些实施例中，本发明提供一种治疗中风或促进从中风中恢复的方法，所述方法包含向有需要的患者施用有效量的p2y1激动剂。在一些实施例中，化合物是a3受体处的偏向激动剂、部分激动剂、或偏向部分激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，化合物是p2y1受体处的偏向激动剂、部分激动剂、或偏向部分激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，化合物是mrs4322或其医药学上可接受的盐。
[0059]
在一些实施例中，中风选自缺血性中风、出血性中风、蛛网膜下出血、脑血管痉挛或短暂性缺血性发作(tia)。在一些实施例中，中风是缺血性的。在一些实施例中，中风是出血性的。在一些实施例中，化合物在中风的48小时内施用。在一些实施例中，化合物在中风的24小时内施用。在一些实施例中，化合物在中风的16小时内施用。在一些实施例中，化合物在中风的8、4、2或1小时内施用。在一些实施例中，在中风之后化合物施用至少前1-72小时。在一些实施例中，在中风之后化合物施用至少前8-52小时。在一些实施例中，在中风之后化合物施用至少前8-48小时。在一些实施例中，在中风之后化合物施用至少前24-48小时。在一些实施例中，随着中风发生长期施用化合物以治疗中风。在一些实施例中，长期施用化合物以治疗短暂性缺血性发作(tia)。
[0060]
在一些实施例中，长期施用化合物以治疗缺血性中风、出血性中风、蛛网膜下出血、脑血管痉挛、短暂性缺血性发作(tia)，或治疗在增大的中风风险下的患者，如在过去已患有中风和在另一中风风险下的患者，如超过40岁、45岁、50岁、55岁、60岁、65岁、70岁、75岁、或80岁的患者。
[0061]
在一些实施例中，化合物治疗由中风引起的缺血-再灌注损伤。
[0062]
神经退化性疾病
[0063]
神经退化性疾病是不可治愈、进行性和最终衰弱的综合症，其由脑和脊髓中的神经元的进行性退化和/或死亡造成。神经退化导致动作(共济失调)和/或认知功能(痴呆)病症，并且包括一系列疾病，如阿尔茨海默氏病(alzheimer’s disease，ad)、帕金森氏病(parkinson’s disease，pd)、亨廷顿氏病(huntington’s disease，hd)、多发性硬化症(multiple sclerosis，ms)、肌肉萎缩性侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，als)
和慢性创伤性脑病变(chronic traumatic encephalopathy，cte)。尽管许多神经退化性疾病是主要遗传起源，其它原因可包括病毒、酒精中毒、肿瘤或毒素，并且正如现在清楚的是，反复性脑损伤。
[0064]
由于前述因素随时间神经元积累细胞损害，其通常考虑许多神经退化性疾病与延长的细胞应激，如阿尔茨海默氏病和帕金森氏病有关的原因，发生在老年个体中。痴呆表示神经退化性疾病的主导性后果，其中ad表示大约60-70％的病例。(kandale 2013)如上文所论述，神经保护性和神经恢复性机理的活化可改善一或多种神经退化性疾病的进程。因此，在一个方面，本发明提供一种治疗神经退化性疾病或促进从神经退化性疾病中恢复的方法，所述方法包含向有需要的患者施用有效量的所公开的化合物。
[0065]
在一个方面，本发明提供一种促进罹患神经退化性疾病的患者的神经保护或神经修复的方法，所述方法包含向患者施用有效量的所公开的化合物。在一些实施例中提供一种促进罹患神经退化性疾病的患者的神经保护或神经修复的方法，所述方法包含向患者施用有效量的a3r激动剂。在其它实施例中提供一种促进罹患神经退化性疾病的患者的神经保护或神经修复的方法，所述方法包含向患者施用有效量的p2y1激动剂。在一些实施例中，化合物是a3受体处的偏向激动剂、部分激动剂、或偏向部分激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，化合物是p2y1受体处的偏向激动剂、部分激动剂、或偏向部分激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，化合物是mrs4322或其医药学上可接受的盐。
[0066]
阿尔茨海默氏病(ad)
[0067]
在2014年估计所有年龄的520万美国人患有ad；65岁和更老的人群的11％患有ad。(阿尔茨海默协会)在2050年之前，预计患有ad的65岁和更老的人的数量是预计1380万的几乎三倍。在美国，为ad患者提供照护的成本是每年约$2140亿；这一成本的70％由医疗保险和医疗补助覆盖。目前趋势预计在2050之前这些成本将增长到每年$1.2万亿。
[0068]
星形胶质细胞的活化和根据本发明促进神经保护和神经修复呈现ad的新治疗选项。因此，在一个方面，本文提供一种治疗ad或促进罹患ad的患者的神经保护或神经修复的方法，所述方法包含向患者施用有效量的本文中所公开的化合物。在一些实施例中，本发明提供一种治疗ad或促进罹患ad的患者的神经保护或神经恢复的方法，所述方法包含向患者施用有效量的a3r激动剂。在一些实施例中，本发明提供一种治疗ad或促进罹患ad的患者的神经保护或神经恢复的方法，所述方法包含向患者施用有效量的p2y1激动剂。在一些实施例中，化合物是a3受体处的偏向激动剂、部分激动剂、或偏向部分激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，化合物是p2y1受体处的偏向激动剂、部分激动剂、或偏向部分激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，化合物是mrs4322或其医药学上可接受的盐。
[0069]
帕金森氏病(pd)
[0070]
多达一百万患有pd的美国人存活，并且每年新近诊断大约60,000美国人，不包括未被发现的数千病例。(帕金森氏病基金会(parkinson's disease foundation)在美国，pd的全部合并的直接和间接成本，包括药物治疗、社会保障付款和损失的收入估计达几乎每年$250亿。(帕金森氏病基金会和huse 2005)
[0071]
根据本发明的神经保护和神经修复的活化呈现pd的新治疗选项。因此，在一个方面，本文提供一种治疗pd或促进罹患pd的患者的神经保护或神经修复的方法，所述方法包含向患者施用有效量的所公开的化合物。在一些实施例中，本发明提供一种治疗pd或促进
traumatic encephalomyopathy，ctem)，其特征在于模拟als的运动神经元病症状。进行性肌肉无力和运动和步态异常被认为是ctem的早期标志。cte的第一阶段症状包括进行性注意力缺陷、定向障碍、眩晕和头痛。第二阶段症状包含记忆力丧失、社交不稳定性、不规则行为和不良判断。在第三和第四阶段，患者罹患进行性痴呆症、减缓动作、颤抖、表情缺乏(hypomimia)、晕眩、言语障碍、听力丧失和自杀倾向，并且可进一步包括发音困难、吞咽困难和眼部异常，例如，上睑下垂。
[0080]
因此，在一个方面，本文提供一种治疗或预防cte或促进罹患cte的患者的神经保护或神经修复的方法，所述方法包含向患者施用有效量的所公开的化合物。在其它实施例中，还提供一种刺激cte患者的神经元和其连接的恢复和修复的方法，所述方法包含向患者施用有效量的所公开的化合物。在一些实施例中，化合物治疗第一阶段、第二阶段、第三阶段或第四阶段cte的一或多种症状。在一些实施例中，本发明提供一种治疗cte或促进罹患cte的患者的神经保护或神经恢复的方法，所述方法包含向患者施用有效量的a3r激动剂。在一些实施例中，本发明提供一种治疗cte或促进罹患cte的患者的神经保护或神经恢复的方法，所述方法包含向患者施用有效量的p2y1激动剂。在一些实施例中，化合物是a3受体处的偏向激动剂、部分激动剂、或偏向部分激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，化合物是p2y1受体处的偏向激动剂、部分激动剂、或偏向部分激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，化合物是mrs4322或mrs1873或其医药学上可接受的盐。
[0081]
在显微等级，病理学包括神经元死亡、τ沉积、tar dna结合蛋白43(tdp 43)β-淀粉样沉积、白质变化和其它异常。τ沉积包括越来越多的出现的致密神经原纤维缠结(dense neurofibrillary tangles，nft)、神经突起和神经胶质缠结，其由星形胶质细胞和其它神经胶质细胞构成。因此，在一些实施例中，所述方法治疗、增强清除率或预防神经元死亡、τ沉积、tar dna结合蛋白43(tdp 43)β-淀粉样沉积、白质变化和与cte有关的其它异常。
[0082]
在一些实施例中，本发明提供长期施用本文中所公开的化合物，如a3r的偏向激动剂、部分激动剂、或偏向部分激动剂或p2y1的偏向激动剂、部分激动剂、或偏向部分激动剂以治疗神经退化性疾病，如上文和下午所论述的疾病。
[0083]
心血管疾病
[0084]
所公开的化合物也适用于治疗各种心血管疾病和病况。在一些实施例中，本发明提供一种治疗心脏或心血管疾病的方法，所述疾病如心肌缺血、心肌梗塞、心肌病、冠状动脉疾病、心律失常、心肌炎、心包炎、心绞痛、高血压性心脏病、心内膜炎、风湿性心脏病、先天性心脏病、或动脉粥样硬化，所述方法包含向有需要的患者施用有效量的所公开的化合物，如mrs4322或mrs1873或其医药学上可接受的盐。在一些实施例中，所公开的化合物提供对atp敏感的钾通道的调节，例如通过a3r受体处的偏向激动作用、部分激动作用或偏向部分激动作用。
[0085]
在一些实施例中，心脏或心血管疾病是心肌缺血或心肌梗塞。
[0086]
其它疾病
[0087]
例如通过增强星形胶质细胞粒线体活性调节有益的作用，如神经保护的化合物也可能治疗各种其它疾病。举例来说，由于星形胶质细胞在本发明中所公开的神经保护中的作用，例如通过调节a3r和/或p2y1受体的星形胶质细胞的活化可适用于治疗下文所论述的各种疾病和病况。因此，在一些实施例中，本发明提供一种治疗或促进罹患疾病或病况的患
functional role of purinergic and nitrergic inhibitory cotransmitters in human colonic relaxation)”n1,gil v,mart
í
nez-cutillas m,clav
é
p,gallego d,jim
é
nez m.；和神经胃肠病学(neurogastroenterol).motil.2014年1月；26(1):115-23.doi:10.1111/nmo.12240.电子版2013年10月8日.“几内亚猪近端结肠的浆膜下层的间质细胞中的钙反应(calcium responses in subserosal interstitial cells of the guinea-pig proximal colon)”tamada h.,hashitani h.pmid:24329947，其以引用的方式并入本文中)。在其它实施例中，疾病或病况选自由cns介导的疼痛，如神经痛、发炎性疼痛和/或剧痛(对于某些核苷和核苷酸化合物在治疗这些病况中的用途，参见例如英国药理学杂志(br j pharmacol.)2010年3月；159(5):1106-17.doi:10.1111/j.1476-5381.2009.00596.x.电子版2010年2月5日.“在神经性、急性和发炎性疼痛的模型中的p2x和p2y受体亚型下作用的配体的活性的比较分析(a comparative analysis of the activity of ligands acting at p2x and p2y receptor subtypes in models of neuropathic,acute and inflammatory pain.)”and
ó
rd1,m
éhé
sz b,gyires k,illes p,sperl
á
gh b.pmid:20136836)，其以引用的方式并入本文中)。
[0089]
在其它实施例中，疾病或病况选自脑的癌症，如神经胶母细胞瘤(对于某些核苷和核苷酸化合物在治疗这些病况中的用途，参见例如嘌呤能信号(purinergic signal.)2015年9月；11(3):331-46.doi:10.1007/s11302-015-9454-7.电子版2015年5月15日.“通过嘌呤受体配体的替莫唑胺抗肿瘤作用的增强能够限制人类神经胶母细胞瘤干细胞的活体外生长(potentiation of temozolomide antitumor effect by purine receptor ligands able to restrain the in vitro growth of human glioblastoma stem cells.)”d'alimonte,i.等人pmid:25976165，其以引用的方式并入本文中)。在其它实施例中，疾病或病况是疼痛(对于某些核苷和核苷酸化合物在治疗疼痛中的用途，参见例如药理学生物化学行为(pharmacol biochem behav.)2015年1月；128:23-32.doi:10.1016/j.pbb.2014.11.001.电子版2014年11月6日.“周边p2y1、p2y6和p2y
11
受体参与大鼠的福马林诱发的发炎性疼痛(participation of peripheral p2y1,p2y
6 and p2y
11 receptors in formalin-induced inflammatory pain in rats.)”barrag
á
n-iglesias p.等人pmid:25449358；和神经药理学(neuropharmacology.)2014年4月；79:368-79.doi:10.1016/j.neuropharm.2013.12.005.电子版2013年12月12日.“周边p2y1受体的封锁通过调节角叉菜胶诱发的发炎性疼痛大鼠中的trpv1表达预防热痛觉过敏的诱发：p38 mapk磷酸化参与drg(blockade of peripheral p2y
1 receptors prevents the induction of thermal hyperalgesia via modulation of trpv1 expression in carrageenan-induced inflammatory pain rats:involvement of p38mapk phosphorylation in drgs.)”kwon sg,roh dh,yoon sy,moon jy,choi sr,choi hs,kang sy,han hj,beitz aj,lee jh.pmid:24333674，其中的每个以引用的方式并入本文中)。在其它实施例中，疾病或病况选自肠胃病症，如腹泻(对于某些核苷和核苷酸化合物在治疗这些病况中的用途，参见例如生理学报(acta physiol(oxf).)2014年12月；212(4):293-305.doi:10.1111/apha.12408.“嘌呤能和硝基能抑制共同传递在人类结肠松弛中的不同功能作用”,n.,gil v,mart
í
nez-cutillas m,clav
é
p,gallego d,jim
é
nez m.，其以引用的方式并入本文中)。在其它实施例中，疾病或病况是受损认知(对于某些核苷和核苷酸化合物在治疗这一病况中的用
途，参见例如神经精神药理学2015年1月；40(2):305-14.doi:10.1038/npp.2014.173.电子版2014年7月15日.“在刺激大鼠内侧前额皮层中的p2y1受体后的受损认知”koch h,bespalov a,drescher k,franke h,kr
ü
gel u.pmid:25027332，其以引用的方式并入本文中)。
[0090]
在一些实施例中，本发明提供一种治疗与脑损伤或神经退化性病况有关的疾病或病况的方法，所述疾病或病况如癫痫症、偏头痛、与辐射癌症疗法有关的侧支脑损害、抑郁症、情绪或行为变化、痴呆症、不规则行为、自杀行为、颤抖、亨廷顿氏舞蹈症、动作协调的丧失、失聪、受损言语、干眼症、表情缺乏、注意力缺陷、记忆力丧失、认知困难、晕眩、发音困难、吞咽困难、眼部异常或定向障碍，所述方法包含向有需要的患者施用有效量的所公开的化合物。在一些实施例中，化合物是a3r激动剂。在一些实施例中，化合物是p2y1激动剂。在一些实施例中，化合物是a3受体处的偏向激动剂、部分激动剂、或偏向部分激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，化合物是p2y1受体处的偏向激动剂、部分激动剂、或偏向部分激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，化合物是mrs4322或mrs1873或其医药学上可接受的盐。
[0091]
在另外的实施例中，本发明提供一种治疗有需要的患者的选自由以下组成的群组的神经退化性疾病的方法：阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、多发性硬化症、肌肉萎缩性侧索硬化和朊病毒疾病，所述方法包含施用有效量的所公开的化合物。在一些实施例中，化合物是a3r激动剂。在一些实施例中，化合物是p2y1激动剂。在一些实施例中，化合物是a3受体处的偏向激动剂、部分激动剂、或偏向部分激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，化合物是p2y1受体处的偏向激动剂、部分激动剂、或偏向部分激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，化合物是mrs4322或mrs1873或其医药学上可接受的盐。
[0092]
在一些实施例中，认知或神经功能的改善测量为在经修改的韦氏记忆等级(wechsler memory scale)的延迟口头回顾任务中约1％与20％之间的评分增加。举例来说，认知功能的改善可测量为约1％与10％之间或约1％与5％之间的评分增加。
[0093]
2.本发明的某些化合物的描述
[0094]
在一个方面，本发明提供适用于治疗、改善或促进从脑或中枢神经系统(cns)的某些病况，如脑损伤或神经退化性病况中恢复的化合物。在一些实施例中，所公开的化合物增强由星形胶质细胞介导的神经保护和神经再生，从而治疗、改善或促进从病况中恢复。在一些实施例中，化合物对于a3受体具有选择性，例如a3受体的选择性相对于其它腺苷受体是至少10倍；或例如相对于其它腺苷受体超过25倍、50倍、100倍、500倍或1000倍。在一些实施例中，化合物选择性调节a3受体。在一些实施例中，化合物是a3受体处的选择性激动剂。在一些实施例中，化合物是a3受体处的选择性部分激动剂。在一些实施例中，化合物是偏向的完全或部分激动剂。在一些实施例中，化合物是偏向的完全或部分拮抗剂。
[0095]
在一些实施例中，化合物对于p2y1受体具有选择性，例如p2y1受体的选择性相对于其它p2y受体是至少10倍；或例如相对于其它p2y受体超过25倍、50倍、100倍、500倍或1000倍。在一些实施例中，化合物选择性调节p2y1受体。在一些实施例中，化合物是p2y1受体处的选择性激动剂。在一些实施例中，化合物是p2y1受体处的选择性部分激动剂。在一些实施例中，化合物是偏向的完全或部分激动剂。在一些实施例中，化合物是偏向的完全或部分拮抗剂。
[0096]
术语“偏向”是指优选地调节、活化、激动或拮抗一或多种但非全部的与受体有关
的路径的化合物。
[0097]
不希望受理论所束缚，人们相信偏向的完全或部分激动作用或拮抗作用使得选择性调节一或多种与a3或p2y1受体有关联的路径，这可导致改善治疗疾病或病况并且避免非所需路径调节(其将导致副作用)。选择性调节可优选地活化如本文中所公开的星形胶质细胞，例如以治疗脑损伤或神经退化性疾病或病况。因此，在一些实施例中，所公开的化合物是一或多种与腺苷a3受体或p2y1受体有关联的g偶合或g非依赖性的路径的偏向的完全或部分激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，化合物选择性调节由a3或p2y1受体介导的路径，如β-抑制蛋白活化、细胞内钙移动、camp调节、atp依赖性钾通道活化、或erk1/2磷酸化或与这类路径有关的其它下游细胞活动。在一些实施例中，路径增强或与神经保护或神经修复、或心肌保护或心肌再生有关。在一些实施例中，化合物选自(n)-甲醇碳核苷，如mrs4322；或其医药学上可接受的盐。
[0098]
如本文所用的术语“甲醇碳核苷”是指核苷类似物，其中存在于核糖的四氢呋喃环中的氧被亚甲基单元置换，并且所得碳环与环丙基环稠合以形成双环[3.1.0]己烷，如结构不受理论束缚，人们相信甲醇碳核苷模拟糖构象或类构象，其被认为受到某些受体亚型青睐。在一些实施例中，北甲醇碳核苷是模拟或偏好c3
′‑
内/c2
′‑
外糖构象的核苷，并且南甲醇碳核苷是模拟或偏好c3
′‑
外/c2
′‑
内构象的核苷。在一些实施例中，(n)-甲醇碳(“北”甲醇碳)糖具有以下结构：在一些实施例中，(n)-甲醇碳糖具有以下结构：在本文中称为“d-(n)-甲醇碳糖”。在其它实施例中，甲醇碳糖呈南或(s)-甲醇碳构形。在一些实施例中，这类甲醇碳糖由以下结构表示：在一些实施例中，(s)-甲醇碳糖具有以下结构：在本文中称为“d-(s)-甲醇碳糖”。
[0099]
在一些实施例中，化合物在a3或p2y1受体处具有功能上选择性，即，在由a3或p2y1受体介导的路径当中选择性区别，例如通过调节一或多种路径而非其它，或通过活化一或多种路径和去活化一或多种其它路径。在一些实施例中，化合物是如由camp信号传递测量的拮抗剂，而不是用于β-抑制蛋白补充的部分激动剂。在其它实施例中，化合物是gq/11-介导的ca
2
移动的激动剂和抑制蛋白补充的部分激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，本发明提供一种通过偏向或功能上选择性a3受体调节(例如，通过在如上文提到的那些的路径当中选择性激动作用或拮抗作用)治疗脑损伤或神经退化性疾病或病况的方法，所述方法包含向有需要的患者施用有效量的所公开的化合物。在一些实施例中，化合物选自dmpa、ccpa、
541、mrs 542、mrs 1760、mrs 2179、mrs 2279、mrs 2341、mrs 2365、mrs 2500、mrs 2690、mrs 2698、mrs 3558、mrs 4322、mrs 5151、mrs 5676、mrs 5678、mrs 5697、mrs 5698、mrs 5923、mrs 5930、苯甲基-neca、ib-meca、cl-ib-meca、lj529、dpma、ccpa、dbxrm、hemado、pemado、heneca、peneca、cp608,039、cp532,903、cgs21680、ar132、vt72、vt158、vt160、vt163、psb 0474、尿苷5'-二磷酸盐(udp)、udp-葡萄糖、尿苷β-硫基二磷酸盐(udpβs)、尿苷5'-三磷酸盐(utp)、尿苷γ-硫代磷酸盐(utpγs)、2-硫基utp四钠盐、utpγs三钠盐、尿苷-5'-二磷酸葡萄糖、二尿苷三磷酸盐、2-(己硫基)(ht)-amp、二腺苷五磷酸盐、2'-脱氧-2'-氨基-utp、2-硫基-utp、三乙酰基尿苷、二乙酰基/酰基尿苷、尿苷、苏拉明、双嘧达莫类似物、二腺苷四磷酸盐ap4u、ap4a、ins365、ins37217或ins48823；其中每种糖可以被呈北或南构象的甲醇碳糖置换或每种糖可以被d-核糖置换；或其医药学上可接受的盐。
[0106]
在一些实施例中，2-甲硫基-adp或其医药学上可接受的盐适用于本发明的方法。不希望受理论所束缚，人们相信2-mes adp在活体内快速水解成2-甲硫基腺苷，其中其是a3r的偏向激动剂、部分激动剂或偏向部分激动剂。2-甲硫基腺苷被认为具有非常类似于mrs4322的受体数据的受体数据。
[0107]
在一些实施例中，化合物是a3r激动剂，如n
6-苯甲基腺苷-5'-n-甲基糖醛酰胺，如n
6-(3-碘苯甲基)-腺苷-5'-n-甲基糖醛酰胺，也称为ib-meca或can-fite cf-101，或2-氯-n
6-(3-碘苯甲基)-腺苷-5'-n-甲基糖醛酰胺(也称为2-ci-ib-meca或can-fite cf-102)；(n)-甲醇碳核苷，如(1r,2r,3s,4r)-4-(2-氯-6-((3-氯苯甲基)氨基)-9h-嘌呤-9-基)-2,3-二羟基-n-甲基双环[3.1.0]己烷-1-甲酰胺(也称为cf502，can-fite生物制药，ma)；(2s,3s,4r,5r)-3-氨基-5-[6-(2,5-二氯苯甲基氨基)嘌呤-9-基]-4-羟基-四氢呋喃-2-甲酸甲基酰胺(也称为cp532,903)；(1's,2'r,3's,4'r,5's)-4-(2-氯-6-(3-氯苯甲基氨基)-9h-嘌呤-9-基)-2,3-二羟基-n-甲基双环[3.1.0]己烷-1-甲酰胺(也称为mrs3558)、2-(1-己炔基)-n-甲基腺苷；(1s,2r,3s,4r)-2,3-二羟基-4-(6-((3-碘苯甲基)氨基)-4h-嘌呤-9(5h)-基)-n-甲基环戊烷甲酰胺(也称为cf101，can-fite)；(1s,2r,3s,4r)-4-(2-氯-6-((3-碘苯甲基)氨基)-4h-嘌呤-9(5h)-基)-2,3-二羟基-n-甲基环戊烷甲酰胺(也称为cf102，can-fite)；(1'r,2'r,3's,4'r,5's)-4-{2-氯-6-[(3-碘苯基甲基)氨基]嘌呤-9-基-}-1-(甲基氨基羰基)-双环[3.1.0]己烷-2,3-二醇(也称为mrs1898)；或(n)-甲醇碳核苷的2-二炔基衍生物；或其医药学上可接受的盐。在一些实施例中，化合物选自ib-meca(也称为cf101)或cl-ib-meca(也称为cf102)；或其医药学上可接受的盐。在一些实施例中，化合物选自(n)-甲醇碳核苷，如以上所公开的那些；或其医药学上可接受的盐。
[0108]
也包括a3r变构调节剂，其在天然配体存在下增强受体活性，所述配体如2-环己基-n-(3,4-二氯苯基)-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺(也称为cf602，can-fite)。然而，决不排除以上列举的a3r激动剂，并且还可使用其它这类激动剂。也涵盖施用共价结合到聚合物的a3r激动剂。举例来说，a3r可呈偶联物形式施用，其中激动剂结合到聚酰胺胺(pamam)树枝状聚合物。
[0109]
不希望受理论所束缚，人们相信通过某些尿苷类似物的包括偏向激动作用的完全或部分激动作用将使得选择性调节一或多种路径，这可导致改善治疗所公开的疾病或病况并且避免非所需路径调节(其将导致副作用)。在一些实施例中，选择性调节优选地活化星形胶质细胞或其它神经胶质细胞，如小胶质细胞和少突细胞以治疗所公开的脑损伤或神经
退化性疾病或病况。适用于本发明的某些尿苷类似物化合物公开于wo 2014/160502中，其以全文引用之方式併入本文中。在一些实施例中，化合物是a3r激动剂。在一些实施例中，化合物是p2y1激动剂。在一些实施例中，化合物是腺苷受体，如a1、a
2a
、a
2b
或a3受体处的偏向激动剂。在一些实施例中，化合物是a3受体处的偏向激动剂、部分激动剂或偏向部分激动剂。在一些实施例中，化合物是p2y1受体处的偏向激动剂、部分激动剂、或偏向部分激动剂。在一些实施例中，化合物选自由以下组成的群组：
[0110]
[0111]
[0112][0113]
或其磷酸化类似物；或其医药学上可接受的盐。
[0114]
在一些实施例中，化合物选自：
biophysica acta)1808,1290-1308.2011)；(参见ben dd等人“人类a3受体处的腺苷和neca衍生物的不同功效：深刻理解受体活化开关(different efficacy of adenosine and neca derivatives at the human a3 receptor:insight into the receptor activation switch)”,生物化学药理学(biochem pharm)”87,321-331.2014；和camaioni e,di francesco e,vittori s,volpini r,cristalli g.“腺苷受体激动剂：2-(3-羟基-3-苯基-1-丙炔-1-基)neca)的非对映异构体的合成和生物评估(adenosine receptor agonists:synthesis and biological evaluation of the diastereoisomers of2-(3-hydroxy-3-phenyl-1-propyn-1-yl)neca)”,生物有机化学与医药化学1997；5:2267-75)；(参见klotz,k.n.“2-取代的n-乙基甲酰氨基腺苷衍生物作为人类a3腺苷受体处的高亲和力激动剂(2-substituted n-ethylcarboxamidoadenosine derivatives as high-affinity agonists at human a3 adenosine receptors)”,纳尼恩施米德伯格药理学档案(naunyn schmiedebergs arch pharmacol.)1999年8月；360(2):103-8；和cristalli g等人(1995)“腺苷-5'-n-乙基糖醛酰胺的2-芳炔基和2-杂炔基衍生物作为选择性a2a腺苷受体激动剂(2-aralkynyl and 2-heteroalkynyl derivatives of adenosine-5'-n-ethyluronamide as selective a2a adenosine receptor agonists)”,药物化学杂志(j med chem)38:1462-1472)；(参见kim s等人“a3r处的3d定量(sar at a3r)”,化学信息与建模杂志(j chem inf.model)47,1225-12332007)；
(参见lee,k.等人“环受限的(n)-甲醇碳核苷作为腺苷受体激动剂(ring-constrained(n)-methanocarba nucleosides as adenosine receptor agonists)”,生物有机化学与医药化学通讯(bioorg med chem lett)2001,11,1333-1337)；(参见kenneth a.jacobson等人第6章.“a3腺苷受体激动剂：病史和未来观点(a3 adenosine receptor agonists:history and future perspectives)”第96-97页.“斯普林格图书出版社：a3腺苷受体从细胞生物学到药理学和治疗学(book-springer:a3 adenosine receptors from cell biology to pharmacology and therapeutics)”,2009)；(see lee k et al.“环受限的(n)-甲醇碳核苷作为腺苷受体激动剂,”生物有机化学与医药化学通讯2001,11,1333-1337；和gao
等人“a3r活化的结构决定因素：激动剂/拮抗剂边界处的核苷配体(structural determinants of a3ractivation:nucleoside ligands at the agonist/antagonist boundary),”药物化学杂志,2002,45,4471-4484)；(参见muller ce,jacobson ka,“腺苷受体配体和其潜能用于新颖药物的近期发展(recent developments in adenosine receptor ligands and their potential for novel drugs),”生物化学与生物物理学报(biochimica et biophysica acta)2011,1808,1290-1308)；(mrs5930；参见jacobson ka等人“john daly演讲：腺苷和p2y受体的结构导向的药物设计(john daly lecture:structure-guided drug design for adenosine and p2y receptors),”化合物和结构(comp.and struct.)生物技术期刊(biotechnology jour)13.286-298.2015)；(mrs5923；参见jacobson ka等人“john daly演讲：腺苷和p2y受体的结构导向的药物设计,”化合物和结构生物技术期刊13.286-298.2015)；cp532,903(参见tracey wr等人“具有人类a3r的高选择性的新颖n6-取代的腺苷5'-n-甲基糖醛酰胺减少缺血性心肌损伤(novel n6-substitued adenosine5'-n-methyluronamides with high selectivity for human a3r reduce ischemic myochardial injury),”美国生理学杂志：心脏和循环生理
学(am j physiol heart circ physiol)285.2003；muller ce,jacobson ka,“腺苷受体配体和其潜能用于新颖药物的近期发展,”生物化学与生物物理学报1808,1290-1308.2011；和wan tc等人“a3r激动剂cp-532,903保护以免心肌缺血/再灌注损伤(the a3r agonist cp-532,903protects against myocardial ischemia/reperfusion injury),”药理学与药物治疗学杂志(j.of pharmacology and exptl therapies)324,1.2008)；(参见volpini r等人“作为ha3r的有效和选择性激动剂的hemado(hemado as potent and selective agonists of ha3r),”药物化学杂志45,3271-3279.2002；muller ce等人“腺苷受体配体的近期发展和其用于新颖药物的可能性,”生物化学与生物物理学报1808,1290-1308.2011；和volpini r等人“ha3r的有效和高度选择性激动剂的合成和评估(synthesis and evaluation of potent and highly selective agonists for ha3r),”药物化学杂志(j of med chem)52,7897-7900.2009)；(参见muller ce,jacobson ka.“腺苷受体配体的近期发展和其用于新颖药物的可能性,”生物化学与生物物理学报1808,1290-1308.2011)；其中r是h或环戊基甲基；
其中r是h、丁基或吡啶-2-基(参见cosyn l.等人,“2-三唑-取代的腺苷,”药物化学杂志(j med chem)2006.49.7373-7383)；(参见muller ce,jacobson ka.“腺苷受体配体的近期发展和其用于新颖药物的可能性,”生物化学与生物物理学报1808,1290-1308.2011)；(参见jacobson ka等人“john daly演讲：腺苷和p2y受体的结构导向的药物设计,”化合物和结构生物技术期刊(biotechnology jour)13.286-298.2015)；其中ar选自苯基、对ch3co-苯基、对氟苯基或2-吡啶基(参见volpini r等人“ha3r的有效和高度选择性激动剂的合成和评估,”药物化学杂志
52,7897-7900.2009)；7900.2009)；(参见pugliese am等人,“在ogd期间a3r对ca1海马体神经传递的作用(role of a3r on ca1 hippocampal neurotransmission during ogd),”生物化学药理学(biochem pharmacology)74.2007)；(参见klotz kn“腺苷受体和其配体ns's(adenosine receptors and their ligands ns's),”药理学档案362.382-391.2000)；或其医药学上可接受的盐。在一些实施例中，化合物选自(n)-甲醇碳核苷，如上文所公开的那些；或其医药学上可接受的盐。
[0117]
在一些实施例中，化合物选自：
[0118]
[0119]
[0120][0121]
或其医药学上可接受的盐。在一些实施例中，化合物选自(n)-甲醇碳核苷，如以上所公开的那些；或其医药学上可接受的盐。
[0122]
在一些实施例中，化合物选自在一些实施例中，化合物选自或其医药学上可接受的盐。在一些实施例中，化合物选自由以下组成的群组：
[0123]
其中每种化合物可呈北或南构象，或甲醇碳糖可以被d-核糖置换；或其医药学上可接受的盐；或其单、二或三磷酸盐或单、二或三磷酸盐的医药学上可接受的盐。在一些实施例中，甲醇碳糖是d-(n)-甲醇碳糖。在一些实施例中，甲醇碳糖是d-(s)-甲醇碳糖。
[0124]
在一些实施例中，化合物选自：
[0125]
[0126]
[0127][0127]
或其医药学上可接受的盐。在一些实施例中，化合物选自(n)-甲醇碳核苷，如以上所公开的那些；或其医药学上可接受的盐。
[0128]
在一些实施例中，化合物选自在一些实施例中，化合物选自或其医药学上可接受的盐。
[0129]
在一些实施例中，化合物选自在一些实施例中，化合物选自或其医药学上可接受的盐。
[0130]
在一些实施例中，化合物是或其医药学上可接受的盐。在一些实施例中，化合物是或其医药学上可接受的盐。在一些实施例
中，化合物是或其医药学上可接受的盐。
[0131]
在一些实施例中，化合物是或其医药学上可接受的盐。在一些实施例中，化合物是或其医药学上可接受的盐。在一些实施例中，化合物是或其医药学上可接受的盐。在一些实施例中，化合物是或其医药学上可接受的盐。在一些实施例中，化合物是
[0132]
在一个方面，本发明提供包含所公开的化合物或其医药学上可接受的盐和医药学
上可接受的赋形剂的医药组合物。在一些实施例中，化合物是上可接受的赋形剂的医药组合物。在一些实施例中，化合物是或其医药学上可接受的盐。在一些实施例中，化合物是或其医药学上可接受的盐。在一些实施例中，化合物是或其医药学上可接受的盐。在一些实施例中，化合物是
[0133]
在一些实施例中，化合物选自图15中的化合物或其医药学上可接受的盐。在一些实施例中，化合物选自
(mrs1898)或mrs1873；或其医药学上可接受的盐。
[0134]
在一个方面，本发明提供一种治疗选自创伤性脑损伤(tbi)或中风的脑或中枢神经系统(cns)损伤或病况的方法，所述方法包含向有需要的患者施用有效量的选自以下的化合物：
[0135][0136]
其医药学上可接受的盐或包含其的医药学上可接受的组合物。
[0137]
在一些实施例中，化合物是
[0138][0139]
或其医药学上可接受的盐。
[0140]
在一些实施例中，化合物是
[0141][0142]
或其医药学上可接受的盐。
[0143]
在一些实施例中，脑或中枢神经系统(cns)损伤或病况是tbi。
[0144]
在一些实施例中，tbi选自对头部的震荡、冲击伤、格斗相关的损伤或者轻度、中度或重度的打击。
[0145]
在一些实施例中，化合物在tbi或中风的24小时内施用。
[0146]
在一些实施例中，化合物在tbi或中风的8小时内施用。
[0147]
在一些实施例中，化合物至少在tbi或中风之后的前8-48小时期间施用。
[0148]
在一些实施例中，脑或中枢神经系统(cns)损伤或病况是中风。
[0149]
在一些实施例中，长期施用化合物以当它溶解时在中风已发生后的时间段期间治疗中风。
[0150]
在一些实施例中，与未治疗的患者相比，患者中的神经保护或神经修复增加。
[0151]
在一些实施例中，化合物是人类a3腺苷受体(a3r)下的偏向部分激动剂。
[0152]
在一些实施例中，使a3r以朝向a3r受体的神经保护性功能偏向方式部分地激动。
[0153]
在一些实施例中，化合物经口、静脉内或肠胃外施用。
[0154]
在一个方面，本发明提供一种增强罹患tbi或中风的患者的神经保护或神经修复的方法，所述方法包含向有需要的患者施用有效量的选自以下的化合物
[0155][0156]
其医药学上可接受的盐或包含其的医药学上可接受的组合物。
[0157]
在一些实施例中，化合物是
[0158][0159]
或其医药学上可接受的盐。
[0160]
在一些实施例中，化合物是
[0161][0162]
或其医药学上可接受的盐。
[0163]
在一些实施例中，与未治疗的患者相比，神经保护或神经修复缩短tbi或中风之后的恢复期。
[0164]
在一些实施例中，化合物是人类a3腺苷受体(a3r)下的偏向部分激动剂，并且使a3r以朝向a3r受体的神经保护性功能偏向方式部分地激动。
[0165]
在一些实施例中，化合物经口、静脉内或肠胃外施用。
[0166]
在一些实施例中，化合物或其医药学上可接受的盐具有至少0.7的未结合的血浆部分或至少0.08的未结合的脑部分或两者都有。
[0167]
在一些实施例中，化合物或其医药学上可接受的盐具有至少0.7的未结合的血浆部分或至少0.08的未结合的脑部分或两者都有。
[0168]
在一个方面，本发明提供一种治疗选自创伤性脑损伤(tbi)、中风、神经退化性病况、或心脏或心血管疾病的损伤、疾病或病况的方法，所述方法包含向有需要的患者施用有效量的选自以下的a3腺苷受体(a3r)的激动剂
[0169][0170]
其医药学上可接受的盐或包含其的医药学上可接受的组合物。
[0171]
在一些实施例中，化合物是
[0172][0173]
或其医药学上可接受的盐。
[0174]
在一些实施例中，化合物是
[0175][0176]
或其医药学上可接受的盐。
[0177]
在一些实施例中，损伤、疾病或病况是tbi。
[0178]
在一些实施例中，tbi选自对头部的震荡、冲击伤、格斗相关的损伤或者轻度、中度或重度的打击。
[0179]
在一些实施例中，损伤、疾病或病况是选自缺血性中风、出血性中风、蛛网膜下出血、脑血管痉挛或短暂性缺血性发作(tia)的中风。
[0180]
在一些实施例中，神经退化性疾病选自阿尔茨海默氏病(ad)、帕金森氏病(pd)、亨廷顿氏病(hd)、多发性硬化症(ms)、肌肉萎缩性侧索硬化(als)、慢性创伤性脑病变(cte)或由病毒、酒精中毒、肿瘤、毒素或反复性脑损伤引起的神经退化性病况。
[0181]
在一些实施例中，损伤、疾病或病况是帕金森氏病。
[0182]
在一些实施例中，损伤、疾病或病况是阿尔茨海默氏病、偏头痛、脑手术或与癌症化疗有关的神经副作用。
[0183]
在一些实施例中，心脏或心血管疾病选自心肌缺血、心肌梗塞、心肌病、冠状动脉疾病、心律失常、心肌炎、心包炎、心绞痛、高血压性心脏病、心内膜炎、风湿性心脏病、先天性心脏病或动脉粥样硬化。
[0184]
在一些实施例中，心脏或心血管疾病是心肌缺血或心肌梗塞。
[0185]
在一些实施例中，长期施用化合物以当它溶解时在损伤已发生后的时间段期间治疗中风、心肌缺血或心肌梗塞。
[0186]
在一些实施例中，与未治疗的患者相比，患者中的神经保护或神经修复增加。
[0187]
在一些实施例中，通过在较少或无其它a3r介导的路径的活化的情况下的细胞内钙移动的优先活化，或通过gq11介导的细胞内钙移动、camp产生的gi介导的调节或erk1/2和akt的gi介导的磷酸化的优先活化，使a3r以朝向a3r受体的神经保护性功能的偏向方式激动。
[0188]
在一些实施例中，通过在较少或无其它a3r介导的路径的活化的情况下的细胞内钙移动的优先活化，或通过gq11介导的细胞内钙移动、camp产生的gi介导的调节或erk1/2和akt的gi介导的磷酸化的优先活化，使a3r以朝向a3r受体的心脏保护功能偏向方式激动。
[0189]
在一些实施例中，所述方法增加罹患与癌症化疗或脑手术有关或由癌症化疗或脑手术造成的神经病况的患者的神经保护或神经修复。
[0190]
在一些实施例中，经口施用化合物。
[0191]
在一个方面，本发明提供一种增加罹患tbi或中风的患者中的神经保护或神经修复从而治疗tbi或中风的方法，所述方法包含向有需要的患者施用有效量的选自以下的a3腺苷受体(a3r)的激动剂
[0192][0193]
其医药学上可接受的盐或包含其的医药学上可接受的组合物。
[0194]
在一个方面，本发明提供一种增加罹患心肌缺血或心肌梗塞的患者的受损心脏组织的心肌保护或再生从而治疗心肌缺血或心肌梗塞的方法，所述方法包含向有需要的患者施用有效量的选自以下的a3腺苷受体(a3r)的激动剂
[0195][0196]
其医药学上可接受的盐或包含其的医药学上可接受的组合物。
[0197]
在一些实施例中，化合物是
[0198][0199]
或其医药学上可接受的盐。
[0200]
在一些实施例中，化合物是
[0201][0202]
或其医药学上可接受的盐。
[0203]
在一些实施例中，与未治疗的患者相比，tbi、中风、心肌缺血或心肌梗塞后的恢复期缩短。
[0204]
在一些实施例中，使a3r以朝向a3r受体的神经保护性功能偏向方式部分地激动。
[0205]
在一些实施例中，使a3r以朝向a3r受体的心脏保护功能偏向方式部分地激动。
[0206]
在一些实施例中，经口施用化合物。
[0207]
在一些实施例中，相对于完全a3r激动剂，化合物是具有改良的心肌保护功能的a3r
的偏向激动剂。
[0208]
在一些实施例中，通过优先活化以下a3r介导的路径中的一或多个：gq11介导的细胞内钙移动的活化、camp产生的gi介导的调节、erk1/2和akt的gi介导的磷酸化或β-抑制蛋白活化的调节，相对于完全a3r激动剂，化合物是具有改良的心肌保护功能的a3r的偏向激动剂。
[0209]
在一些实施例中，通过在较少或不活化另一a3r介导的路径的情况下优先活化细胞内钙移动，相对于完全a3r激动剂，化合物是具有改良的心肌保护功能的a3r的偏向激动剂。
[0210]
在一些实施例中，相对于完全a3r激动剂，化合物是具有改良的心肌保护功能的a3r的部分激动剂。
[0211]
应存在于用于所公开的方法的组合物中的所公开的化合物(即，活性剂)或所公开的医药组合物的量将通常是治疗有效量。“治疗有效量”或剂量(或“有效量”)是指活性剂的量足以产生所需治疗性结果，如活化神经保护、神经再生和/或改善认知或神经功能。活性剂的组合物的毒性和疗效可以通过细胞培养或实验动物中的所属领域中已知的程序，例如针对测定ld
50
(测试组中50％死亡的剂量)和ed
50
(对于测试组中50％治疗有效的剂量)来测定。毒性与治疗效果之间的剂量比是治疗指数，并且它可以表示为比率ld
50
/ed
50
。呈现大治疗指数的组合物是有利的。从细胞培养分析和动物研究中获得的数据可以用于配制适用于人类的一系列剂量。在一些实施例中，这类组合物的剂量在循环浓度范围内，其包括ed
50
并且毒性极低或无毒性。剂量可以根据所用剂型和所用施用途径而在这个范围内变化。
[0212]
在一些实施例中，有效剂量和/或所需治疗结果通过比较至少两次测量的测试对象或患者的认知功能或另一参数确立；然而，还可使用超过两次测量。初始认知功能测量结果确立测试对象或患者的初始基线。认知功能可使用确立的认知测试测量，所述测试如经修改的韦氏记忆等级的延迟口头回顾任务。用认知测试治疗后的另一测试将建立第二测量结果。当第二测量结果与第一测量结果的比较展示至少约1％的改善时，确立有效量。在一些实施例中，如由经修改的韦氏记忆等级的延迟口头回顾任务测量的认知功能的改善在约1％与20％之间。在一些实施例中，改善在约1％与10％之间。在一些实施例中，改善在约1％与5％之间。所属领域的技术人员应理解，确定认知功能改善的其它方法同样适用，只要它们不测量痴呆症的阶段。
[0213]
因此，本发明涵盖通过向有需要的个体施用有效量的所公开的化合物而改善认知或神经功能的方法，其中神经和认知功能的增强测量为在经修改的韦氏记忆等级的延迟口头回顾任务评分中约1％与20％之间的评分增加。
[0214]
所公开的治疗方法可涵盖按需要施用所公开的化合物以获得所需治疗效果。可按需要施用组合物以维持所需治疗效果。在一些实施例中，在约一个月与12个月之间施用化合物。在一些实施例中，在一个月与六个月之间施用化合物。在一些实施例中，在一个月与三个月之间施用化合物。
[0215]
在本发明的一个方面，以约5毫克/天与10克/天之间的量施用所公开的化合物。在一些实施例中，化合物的每个剂量是约5毫克/剂量与10克/剂量之间的量。举例来说，令人满意的结果通过以每天一次或以分次剂量2到4次施用的约0.05与10毫克/千克/天之间、约0.1与7.5毫克/千克/天之间、约0.1与2毫克/千克/天之间或0.5毫克/千克/天的剂量经口
施用本发明的所公开的化合物而获得。对于肠胃外施用，例如通过静脉内滴注或输注，可使用约0.01与5毫克/千克/天之间、约0.05与1.0毫克/千克/天之间和约0.1与1.0毫克/千克/天之间的剂量。对患者合适的日剂量因此是经口约2.5与500mg之间、经口约5与250mg之间、经口约5与100mg之间、或静脉内约0.5与250mg之间、静脉内约2.5与125mg之间和约2.5与50mg之间。
[0216]
3.用途、配制物和施用
[0217]
医药学上可接受的组合物
[0218]
根据另一实施例，本发明提供包含所公开的化合物和医药学上可接受的载剂、佐剂或媒剂的组合物。在某些实施例中，本发明的组合物经配制用于向需要这类组合物的患者施用。在一些实施例中，本发明的组合物经配制用于向患者经口施用。
[0219]
如本文所用，术语“患者”意指动物，优选地是哺乳动物，并且最优选地是人类。
[0220]
术语“医药学上可接受的载剂、佐剂或媒剂”是指不会破坏一起配制的化合物的药理学活性的无毒载剂、佐剂或媒剂。可以在本发明的组合物中使用的医药学上可接受的载剂、佐剂或媒剂包括但不限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(如人血清白蛋白)、缓冲物质(如磷酸盐)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质(如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐)、胶态二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。
[0221]“医药学上可接受的衍生物”意指在向接受者施用后能够直接或间接提供本发明的化合物或其抑制活性代谢物或残余物的本发明化合物的任何无毒盐、酯、酯的盐或其它衍生物。
[0222]
本发明的组合物可以经口、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、经直肠、经鼻、经颊、经阴道或经由植入式贮存器施用。如本文所使用，术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术。在一些实施例中，经口、腹膜內或静脉内施用组合物。本发明的组合物的无菌可注射形式可以是水性或油性悬浮液。这些悬浮液可以根据所属领域中已知的技术使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂来配制。无菌可注射制剂也可以是在无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如呈在1,3-丁二醇中的溶液形式。可以采用的可接受媒剂和溶剂是水、林格氏溶液(ringer's solution)和等张氯化钠溶液。另外，常规地采用无菌不挥发性油作为溶剂或悬浮介质。
[0223]
出于此目的，可以采用任何温和不挥发性油，包括合成单酸甘油酯或二酸甘油酯。如油酸的脂肪酸和其甘油酯衍生物如天然医药学上可接受的油(如橄榄油或蓖麻油，尤其呈其聚氧乙基化形式)般适用于制备可注射剂。这些油溶液或悬浮液还可以含有长链醇稀释剂或分散剂，如羧甲基纤维素或常用于配制医药学上可接受的剂型(包括乳液及悬浮液)的类似分散剂。出于配制的目的，还可以使用其它常用表面活性剂(如吐温(tweens)、司盘(spans))和其它常用于制造医药学上可接受的固体、液体或其它剂型的乳化剂或生物可用性增强剂。
[0224]
本发明的医药学上可接受的组合物可以按任何经口可接受剂型经口施用，所述剂型包括但不限于胶囊、片剂、水性悬浮液或溶液。在用于经口使用的片剂的情况下，常用载
剂包括乳糖和玉米淀粉。典型地还添加如硬脂酸镁的润滑剂。对于以胶囊形式经口施用，适用的稀释剂包括乳糖和干燥玉米淀粉。当为了经口用途需要水性悬浮液时，将活性成分与乳化剂和悬浮剂组合。必要时，还可以添加某些甜味剂、调味剂或着色剂。
[0225]
或者，本发明的医药学上可接受的组合物可以按用于经直肠施用的栓剂形式施用。这些栓剂可以通过将试剂与合适的非刺激性赋形剂混合来制备，所述赋形剂在室温下是固体但在直肠温度下是液体并且因此将在直肠中熔融以释放药物。这类材料包括可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。
[0226]
本发明的医药学上可接受的组合物也可以局部施用，尤其当治疗目标包括通过局部施用容易达到的区域或器官(包括眼睛、皮肤或下部肠道的疾病)时。容易制备适合于这些区域或器官中的每一个的局部配制物。
[0227]
对下部肠道的局部施用可以直肠栓剂配制物(参见上文)或以合适的灌肠剂配制物实现。还可使用局部透皮贴剂。
[0228]
对于局部施用来说，所提供的医药学上可接受的组合物可以含有悬浮或溶解于一或多种载剂中的活性组分的合适软膏形式配制。用于本发明的化合物的局部施用的载剂包括但不限于矿物油、液体矿脂、白矿脂、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。或者，所提供的医药学上可接受的组合物可以含有悬浮或溶解于一或多种医药学上可接受的载剂中的活性组分合适的洗剂或乳膏形式配制。合适的载剂包括但不限于矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、鲸蜡酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。
[0229]
对于眼科使用，所提供的医药学上可接受的组合物可在有或无防腐剂(如苯扎氯铵)存在下，配制成在ph值经调整的等张无菌生理食盐水中的微粉化悬浮液或配制成在ph值经调整的等张无菌生理食盐水中的溶液。或者对于眼科使用，医药学上可接受的组合物可在如矿脂的软膏中配制。
[0230]
本发明的医药学上可接受的组合物还可以通过经鼻气雾剂或吸入施用。这类组合物根据医药配制领域中熟知的技术制备，并且可以采用苯甲醇或其它合适的防腐剂、增强生物可用性的吸收促进剂、碳氟化合物和/或其它常规增溶剂或分散剂，以在生理食盐水中的溶液形式制备。
[0231]
在一些实施例中，本发明的医药学上可接受的组合物经配制用于经口施用。这类配制物可以在存在或不存在食品的情况下施用。在一些实施例中，本发明的医药学上可接受的组合物在不存在食品的情况下施用。在其它实施例中，本发明的医药学上可接受的组合物在存在食品的情况下施用。
[0232]
在其它实施例中，本发明的医药学上可接受的组合物经配制用于静脉内(iv)施用。
[0233]
可以与载剂材料组合以产生呈单一剂型的组合物的本发明化合物的量将根据所治疗的宿主、特定施用模式而变化。优选地，应配制所提供的组合物以使得可以向接受这些组合物的患者施用剂量在0.01-100毫克/千克体重/天之间的抑制剂。
[0234]
还应理解，针对任何特定患者的特定剂量和治疗方案将取决于多种因素，包括所用特定化合物的活性、年龄、体重、整体健康状况、性别、饮食、施用时间、排泄速率、药物组合以及治疗医师的判断和所治疗特定疾病的严重程度。组合物中本发明化合物的量也将视组合物中的特定化合物而定。
[0235]
化合物和医药学上可接受的组合物的使用
[0236]
本文所描述的化合物和组合物通常适用于治疗各种疾病和病况，如脑损伤和神经退化性病况以及本文中所公开的各种方法。
[0237]
用于本发明的化合物的活性可在活体外、活体内或在细胞系中分析。活体外分析包括调节或结合到蛋白质的分析。分析化合物的详细情况阐述于以下实例中。
[0238]
如本文所用，术语“治疗(treatment/treat/treating)”是指逆转、减轻如本文所描述的疾病或病症或其一或多种症状，延迟其发作，或抑制其进展。在一些实施例中，治疗可在已出现一或多种症状后施用。在其它实施例中，治疗可在不存在症状下施用。举例来说，治疗可以在症状发作之前向易感个体(例如，根据症状病史和/或根据遗传学或其它易感性因素)施用。还可以在症状已经消退之后继续进行治疗，例如以预防或延迟其复发。
[0239]
根据本发明的方法，可使用有效治疗所公开的疾病或病况或有关病况或症状或减轻其严重程度的任何量和任何施用途径来施用化合物和组合物。所需精确量将视受试者的物种、年龄和整体情况、疾病或病况的严重程度、特定试剂、其施用模式等而随各受试者而变化。优选地按单位剂型配制本发明的化合物以实现易于施用和剂量均一性。如本文所用，表述“单位剂型”是指适于待治疗患者的试剂的物理离散单元。然而，应理解，本发明的化合物和组合物的总每日用量应由主治医师在合理医学判断范围内决定。针对任何特定患者或生物体的特定有效剂量水平将取决于多种因素，包括所治疗的病症和所述病症的严重程度；所用特定化合物的活性；所用特定组合物；患者的年龄、体重、整体健康状况、性别和饮食；所用特定化合物的施用时间、施用途径和排泄速率；治疗持续时间；与所用特定化合物组合或同时使用的药物；和医学领域中熟知的类似因素。如本文所用，术语“患者”意指动物，在一些实施例中意指哺乳动物，或在某些其它实施例中意指人类。
[0240]
视所治疗的疾病或病况的严重程度而定，本发明的医药学上可接受的组合物可以经口或经鼻喷雾剂经口、舌下、经直肠、肠胃外、脑池内、阴道内、腹膜內、局部(如通过粉剂、软膏或滴剂)、眼内(如滴眼剂)、经颊对人类和其它动物施用。在某些实施例中，可以每天、一天一或多次针对受试者体重按约0.01mg/kg到约50mg/kg或约1mg/kg到约25mg/kg的剂量水平，经口或肠胃外施用本发明的化合物，以获得所需治疗效果。
[0241]
用于经口施用的液体剂型包括但不限于医药学上可接受的乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除了活性化合物外，液体剂型还可以含有所属领域中常用的惰性稀释剂，例如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油类(尤其是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇脂肪酸酯和其混合物。除惰性稀释剂之外，口服组合物还可以包括佐剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂和芳香剂。
[0242]
可以根据已知领域使用合适分散剂或润湿剂和悬浮剂来配制可注射制剂，例如无菌可注射水性或油性悬浮液。无菌可注射制剂也可以是无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液或乳液，例如1,3-丁二醇中的溶液形式。可以采用的可接受媒剂和溶剂中有水、林格氏溶液、u.s.p.和等张氯化钠溶液。另外，常规地采用无菌不挥发性油作为溶剂或悬浮介质。出于此目的，可以采用任何温和不挥发性油，包括合成单酸甘油酯或二酸甘油酯。另外，在可注射剂制备中使用脂肪酸，如油酸。
[0243]
可注射配制物可以例如通过经由细菌截留过滤器过滤或通过并入灭菌剂来灭菌，呈可以在使用前溶解或分散于无菌水或其它无菌可注射介质中的无菌固体组合物形式。
[0244]
为了延长本发明化合物的作用，通常需要减慢从皮下或肌肉内注射吸收化合物。这可以通过使用具有不良水溶性的结晶或非晶形材料的液体悬浮液来实现。化合物的吸收速率则取决于其溶解速率，溶解速率又可以取决于晶体尺寸和结晶形式。或者，通过将化合物溶解或悬浮于油媒剂中来实现肠胃外施用的化合物形式的延迟吸收。通过形成化合物在生物可降解聚合物(如聚丙交酯-聚乙交酯)中的微胶囊基质来制备可注射积存形式。取决于化合物与聚合物的比率和所用特定聚合物的性质，可以控制化合物的释放速率。其它生物可降解聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。还通过将化合物截留于与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备积存可注射配制物。
[0245]
用于经直肠或经阴道施用的组合物优选是可以通过将本发明化合物与合适非刺激性赋形剂或载剂(如可可脂、聚乙二醇)混合而制备的栓剂；或在环境温度下是固体但在体温下是液体并且因此在直肠或阴道腔中熔融并且释放活性化合物的栓剂蜡。
[0246]
供经口施用的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、粉剂和颗粒剂。在这类固体剂型中，活性化合物与以下各者混合：至少一种医药学上可接受的惰性赋形剂或载剂，如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或a)填充剂或增量剂，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和硅酸；b)粘合剂，例如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；c)保湿剂，如甘油；d)崩解剂，如琼脂-琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；e)溶解阻滞剂，如石蜡；f)吸收促进剂，如季铵化合物；g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；h)吸收剂，如高岭土和膨润土；和i)润滑剂，如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠，和其混合物。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型还可以包含缓冲剂。
[0247]
还可以使用类似类型的固体组合物作为使用如乳糖(lactose/milk sugar)以及高分子量聚乙二醇等的赋形剂的软和硬填充明胶胶囊中的填充剂。固体剂型片剂、糖衣药丸、胶囊、丸剂及颗粒剂可以用包衣和外壳(如肠溶包衣和医药配制领域中所熟知的其它包衣)来制备。其可以任选地含有乳浊剂，并且还可以具有仅或在肠道的某一部分中，任选地以延迟方式释放活性成分的组合物。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。还可以使用类似类型的固体组合物作为使用如乳糖(lactose/milk sugar)以及高分子量聚乙二醇等的赋形剂的软和硬填充明胶胶囊中的填充剂。
[0248]
活性化合物还可以呈与一或多种如上文所示的赋形剂的微囊封形式。片剂、糖衣药丸、胶囊、丸剂以及颗粒剂的固体剂型可以用包衣和外壳(如肠溶包衣、释放控制包衣以及医药配制领域中所熟知的其它包衣)来制备。在这类固体剂型中，活性化合物可以与至少一种惰性稀释剂(如蔗糖、乳糖或淀粉)混合。正常实践时，这类剂型还可以包含除惰性稀释剂以外的额外物质，例如压片润滑剂和其它压片助剂，如硬脂酸镁和微晶纤维素。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型还可以包含缓冲剂。其可以任选地含有乳浊剂，并且还可以具有仅或在肠道的某一部分中，任选地以延迟方式释放活性成分的组合物。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。
[0249]
用于局部或经皮施用本发明化合物的剂型包括软膏、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、粉剂、溶液、喷雾剂、吸入剂或贴剂。需要时，将活性组分与医药学上可接受的载剂和任何所需防腐剂或缓冲剂在无菌条件下混合。眼科配制物、滴耳剂和滴眼剂也涵盖在本发明范围内。
此外，本发明涵盖了使用透皮贴剂，其具有提供化合物向身体的控制传递的额外优点。这类剂型可以通过将化合物溶解或分配于适当介质中制得。还可以使用吸收增强剂来提高化合物穿过皮肤的通量。可以通过提供速率控制膜或将化合物分散于聚合物基质或凝胶中来控制速率。
[0250]
取决于待治疗的特定病况或疾病，通常施用以治疗所述病况的额外治疗剂也可以存在于本发明的组合物中。如本文所用，通常施用以治疗特定疾病或病况的额外治疗剂被称为“适于所治疗的疾病或病况”。
[0251]
如以下实例中所描绘，在某些示例性实施例中，化合物根据以下一般程序制备和使用。应了解，虽然一般方法描绘了本发明的某些化合物的合成，但以下一般方法和所述领域普通技术人员已知的其它方法可以适用于如本文中所描述的所有化合物和这些化合物中的每一者的子类和物种。
[0252]
说明书中所引用的每个文件的内容以其全文引用的方式并入本文中。
[0253]
范例
[0254]
实例1：在对小鼠腹膜内施用之后mrs4322的药物动力学
[0255]
目的
[0256]
本研究经设计以测定在腹膜内施用用于小鼠光栓疗法和创伤性脑损伤模型的剂量之后mrs4322的血浆和脑浓度。
[0257]
方法
[0258]
化学物质：mrs4322获自国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所(the national institute of diabetes,digestive and kidney diseases)(马里兰州贝塞斯达(bethesda,md))的尊敬的肯
·
雅各布森(ken jacobson)博士。从第七波实验室(seventh wave laboratories)(密苏里州马里兰海茨(maryland heights,mo))的商业供应商获得分析级甲苯磺丁脲。所有其它化学物质都从西格玛-阿尔德里奇(sigma-aldrich)(密苏里州圣路易斯(st.louis,mo))获得。
[0259]
动物：体重大约为0.02kg的雌性c576bl/6j小鼠用于本研究，其由德克萨斯大学健康科学中心(university of texas health sciences center)供应(德克萨斯州圣安东尼奥(san antonio,tx))。所有研究在经过批准的德克萨斯大学健康科学中心iacuc方案下进行。
[0260]
药物施用：将mrs4322溶解于dmso中，并且接着在生理盐水中稀释以制备给药溶液。mrs4322的最终给药溶液浓度是100μm。对每只20克体重的每只小鼠腹膜內施用100μl体积的给药溶液；以0.16mg/kg或0.5μmol/kg腹膜內施用mrs4322。针对每个取样时间点对三只小鼠施用mrs4322。
[0261]
组织取样：血液和脑样品在给药后0、0.083、0.25、0.5、1、2和8小时获得。在每个时间点，将小鼠(3/时间点)在一氧化碳室中处死。通过心脏穿刺将全血获取到含有肝素的微量采血管中，并且立刻离心以制备血浆；血浆储存在-80℃下。在每个时间点，全脑样品通过断头处死获得，在冰冷的磷酸盐缓冲盐水中冲洗并且称重。脑样品接着立刻在液氮中快速冷冻并且储存在-80℃下。
[0262]
生物分析
[0263]
mrs4322的血浆和脑浓度通过lc-ms/ms利用甲苯磺丁脲作为内标物来测定。下表
概述所用lc和ms/ms条件：
[0264]
表1：mrs4322血浆和脑浓度测定的生物分析方法
[0265][0266][0267]
对于每种组织基质，形成标准曲线并且测定lloq/uloq浓度。mrs4322血浆浓度标准曲线的校准范围是2.42-242ng/ml。mrs4322脑浓度的校准范围是2.41-233ng/ml。
[0268]
对于mrs4322的脑浓度的生物分析，脑样品以4
×
稀释在冰冷的磷酸盐缓冲盐水中均匀化。所得稀释的脑匀浆的等分试样用乙腈处理并且由lc-ms/ms分析。由于4
×
匀浆稀释，mrs4322脑标准曲线的校准范围转变成9.64-932ng/gm。在几种样品中，可检测mrs4322，
但降到低于9.64ng/gm的脑lloq，但高于背景；在这些情况下最终报告的脑浓度基于ms峰高度外推。
[0269]
结果
[0270]
在向小鼠腹膜内施用之后，在血浆和脑样品中都可检测mrs4322浓度(图1a和表2)。应注意，如以下实例11中所描述并且如图1b和图16中所展示，在新生猪血浆和脑样品中可检测mrs4322浓度。在对新生猪静脉内施用之后，在血浆、脑、脑细胞外液和脑脊髓液样品中可检测mrs4322浓度(图1b和图16，表13)。
[0271]
表2：在腹膜内施用之后小鼠的mrs4322的血浆和脑浓度
[0272][0273][0274]
blq＝低于定量的下限(由于4
×
稀释，对于血浆2.40ng/ml，对于脑9.64ng/g)
[0275]
*将在85.0的1小时值下的动物f视为异常值，并且从概要统计中排除
[0276]
计算浓度《lloq。外推所报告的值
[0277]
血浆浓度使得允许tmax、cmax、半衰期和auc(表3)的初始估计值。
[0278]
表3：在腹膜内施用之后小鼠的mrs4322的血浆药物动力学
[0279][0280]
注意：blq值转化成零，包括外推值，并且对于pk分析排除1小时下的动物f
[0281]
尽管可检测脑浓度，但对于除cmax和tmax外的半衰期或其它药物动力学参数的估计，数据不充分。然而，基于可获得的血浆和脑数据，基于血浆和脑中的平均cmax浓度，估计全部药物的脑/血浆比是大约0.06。
[0282]
这些结果证实，在光栓疗法和创伤性脑损伤的模型中所用的给药条件下，在对小鼠腹膜内施用之后可检测mrs4322的循环血浆浓度，并且mrs4322在这些给药条件下分布到
脑中。
[0283]
实例2：在对小鼠腹膜内施用mrs2365之后mrs4322的药物动力学
[0284]
目的
[0285]
本研究经设计以测定在以用于小鼠光栓疗法和创伤性脑损伤模型的剂量腹膜内施用p2y1激动剂mrs2365之后mrs4322的血浆和脑浓度。
[0286]
方法
[0287]
化学物质：mrs4322获自国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所(马里兰州贝塞斯达)的尊敬的ken jacobson博士。mrs2365从托克里斯生物科学(tocris biosciences)(英国布里斯托尔(bristol,uk))获得。从第七波实验室(密苏里州马里兰海茨)的商业供应商获得分析级的甲苯磺丁脲。所有其它化学物质都从西格玛-阿尔德里奇(密苏里州圣路易斯)获得。
[0288]
动物：体重大约为0.02kg的雌性c576bl/6j小鼠用于本研究，其由德克萨斯大学健康科学中心供应(德克萨斯州圣安东尼奥)。所有研究在经过批准的德克萨斯大学健康科学中心iacuc方案下进行。
[0289]
药物施用：将mrs2365溶解于磷酸盐缓冲盐水中并且接着在磷酸盐缓冲盐水中稀释以制备给药溶液。mrs2365的最终给药溶液浓度是100μm。对每个体重为20克的每个小鼠腹膜內施用100μl体积的给药溶液；以0.5μmol/kg或0.24mg/kg腹膜內施用mrs2365。针对每个取样时间点对三个小鼠施用mrs2365。
[0290]
组织取样：血液和脑样品在给药后0、0.083、0.25、0.5、1、2和8小时获得。在每个时间点，将小鼠(3/时间点)在一氧化碳室中处死。通过心脏穿刺将全血获取到含有肝素的微量采血管中，并且立刻离心以制备血浆；血浆存储在-80℃下。在每个时间点，全脑样品通过断头处死获得，在冰冷的磷酸盐缓冲盐水中冲洗并且称重。脑样品接着立刻在液氮中快速冷冻并且存储在-80℃下。
[0291]
生物分析：先前研究已展示，在腹膜内或静脉内施用之后观察到mrs2365的不可检测的循环和脑浓度，因此本研究仅关注其代谢物mrs4322的检测和定量。mrs4322的血浆和脑浓度通过lc-ms/ms利用甲苯磺丁脲作为内标物来测定。下表概述所用lc和ms/ms条件：
[0292]
表4：mrs4322血浆和脑浓度测定的生物分析方法
[0293]
[0294][0295]
对于每种组织基质，形成标准曲线并且测定lloq/uloq浓度。mrs4322血浆浓度标准曲线的校准范围是2.26-241ng/ml。mrs4322脑浓度的校准范围是2.35-242ng/ml。
[0296]
对于mrs4322的脑浓度的生物分析，脑样品以4
×
稀释在冰冷的磷酸盐缓冲盐水中均匀化。所得稀释的脑匀浆的等分试样用乙腈处理并且由lc-ms/ms分析。由于4
×
匀浆稀释，mrs4322脑标准曲线的校准范围转变成9.40-968ng/gm。在几种样品中，可检测mrs4322，但降到低于9.40ng/gm的脑lloq，但高于背景；在这些情况下最终报告的脑浓度基于ms峰高度外推。
[0297]
结果
[0298]
在向小鼠腹膜内施用mrs2365之后，在血浆和脑样品中都可检测mrs4322浓度(图2和表5)。
[0299]
表5：在腹膜内施用mrs2365之后小鼠的mrs4322的血浆和脑浓度
[0300][0301]
blq＝低于定量的下限(由于4倍稀释，对于血浆2.26ng/ml，对于脑9.40ng/g)
[0302]
*预计值；这些值低于定量的极限
[0303]a在接收后误标记0和0.083样品似乎是可能的
[0304]
血浆浓度使得允许tmax、cmax、半衰期和auc(表6)的初始估计值。
[0305]
表6：在腹膜内施用mrs2365之后小鼠的mrs4322的血浆药物动力学
[0306][0307]
blq值转化成零；对于pk分析包括外推值。
[0308]
尽管可检测脑浓度，但对于除cmax和tmax外的半衰期或其它药物动力学参数的估计，数据不充分。然而，基于可获得的血浆和脑数据，基于血浆和脑中的平均cmax浓度，估计全部药物的脑/血浆比是大约0.10。
[0309]
这些结果证实，在光栓疗法和创伤性脑损伤的模型中所用的给药条件下，在对小鼠腹膜内施用p2y1激动剂mrs2365之后可检测mrs4322的循环血浆浓度，并且mrs4322在这些给药条件下分布到脑中。
[0310]
在腹膜内施用mrs4322本身(参见实例1)之后和在腹膜内施用p2y1激动剂mrs2365之后，在两种不同研究中测定mrs4322血浆和脑浓度。在这些研究两者中，以0.5μmol/kg的等摩尔剂量施用mrs4322或mrs2365。比较两种研究的结果，观察到的mrs4322血浆浓度血浆浓度实际上一致，并且mrs4322的脑浓度非常相似(比较图1和图2)。在施用等摩尔剂量的mrs4322或mrs2365之后，在mrs4322的半衰期和auc值方面无统计学上显著的差异。这些数据表明，在对小鼠腹膜内施用之后，mrs2365快速并且完全代谢成mrs4322，导致mrs4322血浆和脑药物动力学非常类似于腹膜内施用mrs4322本身之后的药物动力学。
[0311]
实例3：mrs4322在小鼠中的血浆和脑结合
[0312]
目的
[0313]
本研究经设计以测定mrs4322在小鼠中的血浆和脑游离部分，并且将游离部分与原型腺苷a3受体激动剂mrs5698的那些进行比较。mrs5698具有以下化学结构：
[0314][0315]
方法
[0316]
化学物质：mrs4322获自国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所(马里兰州贝塞斯达)的尊敬的ken jacobson博士。mrs5698从托克里斯生物科学(英国布里斯托尔)获取。从第七波实验室(密苏里州马里兰海茨)的商业供应商获得分析级的磺胺甲基异恶唑和华法林(warfarin)。所有其它化学物质都从西格玛-阿尔德里奇(密苏里州圣路易斯)获得。
[0317]
动物和组织制备：来自雄性cd-1小鼠的血浆从bioreclamationivt(纽约韦斯特伯里(westbury,ny))获得，并且存储在-80℃下直到使用为止。雄性cd-1小鼠脑从bioreclamationivt(纽约韦斯特伯里)获得。
[0318]
血浆超滤空白样品通过解冻冷冻的血浆并且接着在37℃下于含湿气的5％co2室中预升温血浆60分钟来制备。将800μl的等分试样转移到centrifree离心过滤器(ultracel再生纤维素(nmwl 30,000amu)批次r5ja31736)中，并且在37℃下以2900rpm离心10分钟；收集血浆水滤液并且用于制备标准物、空白和qc标准物。
[0319]
称重脑，并且使用全组织均匀器用ph为7.4的1:9磷酸盐缓冲盐水均匀化。来自四个小鼠的脑被均匀化、汇集和混合以形成样品。
[0320]
血浆结合测定：将mrs4322、mrs5698、磺胺甲恶唑和华法林溶解于dmso中并且接着在1:1的乙腈:水中稀释以制备100μm透析储备溶液。利用磺胺甲恶唑和华法林作为具有已知血浆结合值的研究标准物。将血浆样品在维持在37℃下的含湿气的5％co2孵育箱中预升温60分钟。使用每种化合物的100μm储备溶液将3ml预升温血浆的等分试样各外加mrs4322、mrs5698、磺胺甲恶唑或华法林，导致最终测试浓度为1μm。在37℃下于含湿气的5％co2室中将外加的血浆样品在旋转式混合器上孵育最少60分钟。在60分钟之后，将三个800μl等分试样的每种样品加入centrifree离心过滤器。在37℃下使过滤器经历2900rpm下的离心10分钟。收集三个100μl等分试样的残余血浆以及超滤液以用于生物分析。
[0321]
脑结合测定：将mrs4322、mrs5698、磺胺甲恶唑和华法林溶解于dmso中并且在1:1的乙腈:水中稀释以制备100μm透析储备溶液。将汇集的均匀化的脑在维持在37℃下的含湿气的5％co2孵育箱中预升温60分钟。使用每种化合物的100μm储备溶液将3ml脑匀浆的等分试样各外加mrs4322、mrs5698、磺胺甲恶唑或华法林，导致最终外加浓度为1μm。将外加的汇
集的匀浆放置在维持在37℃下的含湿气的5％co2孵育箱中的盘旋馈入装置混合器(nutator mixer)上60分钟。在60分钟之后，将三个800μl等分试样的每种样品加入centrifree离心过滤器。在37℃下使过滤器经历2900rpm下的离心10分钟。收集残余脑匀浆和超滤液的等分试样以用于生物分析。
[0322]
生物分析
[0323]
mrs4322和mrs5698在外加血浆、脑匀浆和相关超滤液中的血浆和脑浓度利用甲苯磺丁脲作为内标物通过lc-ms/ms测定。磺胺甲恶唑和华法林的相关浓度也通过lc-ms/ms使用标准条件测定(数据未展示)。下表概述所用lc和ms/ms条件(表7和表8)。生物分析方法对于所有基质一致；标准曲线统计(例如拟合、截距、斜率、相关系数)针对每种基质测定，但无显著不同，表情因此未针对每种基质展示。
[0324]
表7：用于测定血浆、脑匀浆、血浆超滤液和脑匀浆超滤液浓度的mrs4322的生物分析方法
[0325][0326][0327]
表8：用于测定血浆、脑匀浆、血浆超滤液和脑匀浆超滤液浓度的mrs5698的生物分析方法
[0328][0329]
对于每种组织基质，形成标准曲线并且测定lloq/uloq浓度。mrs4322和mrs5698血浆浓度标准曲线的校准范围是400-1200nm。mrs4322和mrs5698血浆超滤液标准曲线的校准范围是100-1200nm。mrs4322脑匀浆和脑匀浆超滤液标准曲线的校准范围分别是400-1200nm和100-1200nm。mrs5698脑匀浆和脑匀浆超滤液标准曲线的校准范围分别是400-1200nm和1-500nm。
[0330]
结果
[0331]
利用血浆超过滤测定mrs4322和mrs5698的血浆结合和游离部分。mrs4322的血浆结合是25.8％；有关游离部分是0.742(表9)。
[0332]
在血浆超滤液中未检测到mrs5698浓度；在从centrifree装置的供体侧中获得的残余外加血浆样品中完全恢复mrs5698(数据未展示)。这表明低mrs5698超滤液浓度不是由于化合物的低分析恢复。所有这些数据与报告在文献(tosh,d.k.等人嘌呤能信号传递(2015)11:371-387)中的小鼠血浆和组织中的mrs5698的高蛋白质结合(99.88％)一致。研究标准物磺胺甲恶唑和华法林的结合与文献值一致。
[0333]
表9：mrs4322和mrs5698在小鼠血浆中的未结合部分和结合
[0334][0335]
*mrs5698的血浆超滤液浓度是blq
[0336]
利用脑匀浆超过滤测定mrs4322和mrs5698的脑结合和游离部分。mrs4322的脑结合是87％；有关游离部分是0.13(表10)。
[0337]
在脑匀浆超滤液中未检测到mrs5698浓度。出于估计的目的，利用mrs5698脑匀浆
超滤液lloq以计算脑结合值。所得脑结合值是99.99％。所有这些数据与报告在文献(tosh,d.k.等人嘌呤能信号传递(2015)11:371-387)中的小鼠血浆和组织中的mrs5698的高蛋白质结合(99.88％)一致。研究标准物磺胺甲恶唑和华法林的结合与文献值一致。
[0338]
表10：mrs4322和mrs5698在小鼠脑匀浆中的未结合部分和结合
[0339][0340]
*在超滤液中未检测到mrs5698；利用分析lloq以计算估计的结合值
[0341]
所有这些数据表明mrs4322具有实质上与血浆和脑中的腺苷a3激动剂mrs5698相比更高的游离部分和下部蛋白质结合。这些数据表明对于所给全部血浆或脑浓度，与将可用于mrs5698相比，实质上更高浓度的mrs4322将可用以与效应部位相互作用。
[0342]
实例4：mrs2365在小鼠和人类血液和血浆中的活体外稳定性和代谢
[0343]
目的
[0344]
本研究经设计以确定p2y1激动剂mrs2365在小鼠和人类血液和血浆中的活体外稳定性和代谢去向。
[0345]
方法
[0346]
化学物质：mrs2365从托克里斯生物科学(英国布里斯托尔)获得。mrs4322获自国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所(马里兰州贝塞斯达)的尊敬的ken jacobson博士。所有其它化学物质都从西格玛-阿尔德里奇(密苏里州圣路易斯)获得。分别使用依那普利(enalapril)和普鲁卡因(procaine)作为小鼠和人类的血浆和血液稳定性标准物。
[0347]
组织制备：来自雄性cd-1小鼠和人类的血浆从bioreclamationivt(纽约韦斯特伯里)获得，并且存储在-80℃下直到使用为止。从第七波实验室(密苏里州马里兰海茨)处的雄性cd-1小鼠和人类志愿者获得全血。使用edta(1mm)或肝素锂作为抗凝剂制备血浆和血液样品。
[0348]
血浆稳定性测定：将mrs2365、依那普利和普鲁卡因溶解于ph为7.4的磷酸盐缓冲盐水中。血浆样品(由用edta或肝素锂作为抗凝血剂的血液制备)在维持在37℃下的含湿气的5％co2孵育箱中预升温60分钟。随着添加mrs2365(1μm最终浓度)开始稳定性孵育。edta产生的血浆中的稳定性的初始评价利用0、10、30、60、120和240分钟的孵育时间点(图3和4)。比较edta产生和肝素产生的血浆的后续研究利用0、1、2.5、5、7.5、10和30分钟的孵育时间点(图7)。比较edta产生和肝素产生的血浆的额外血浆稳定性孵育使用0、5、10、20、30、45、60和90秒的时间点为(图8)。对于代谢物寻找分析，mrs2365以100μm的浓度在肝素化人类血浆中孵育10或30分钟(图9)。在所有研究中，将血浆立刻放置在微量采血管中，在干冰上冷冻并且存储在-80℃下直到分析为止。
[0349]
血液稳定性测定：将mrs2365、依那普利和普鲁卡因溶解于ph为7.4的磷酸盐缓冲盐水中。在维持在37℃下的含湿气的5％co2孵育箱中预升温血液样品(经过edta或肝素锂处理)60分钟。随着添加mrs2365(1μm最终浓度)(图5和6)开始稳定性孵育。血液样品等分试样在0、1、2.5、7.5、10和30分钟获得，并且放置在微量采血管中。对于代谢物寻找分析，
mrs2365以100μm的浓度在肝素化人类全血中孵育10或30分钟(图10)。在所有研究中，血浆立刻通过在4℃下离心制备，放置在微量采血管中，在干冰上冷冻并且存储在-80℃下直到分析为止。
[0350]
生物分析
[0351]
mrs2365的血浆和血液浓度通过lc-ms/ms利用甲苯磺丁脲作为内标物来测定。下表概述所用lc和ms/ms条件(表11)。生物分析方法对于所有基质一致；标准曲线统计(例如拟合、截距、斜率、相关系数)针对每种基质测定，但无显著不同，表情因此未针对每种基质展示。
[0352]
表11：用于测定血浆和血液浓度在活体外稳定性测定中的mrs2365的生物分析方法
[0353][0354]
对于每种组织基质，形成标准曲线并且测定lloq/uloq浓度。mrs2365血浆和血液浓度标准曲线的校准范围是5-5000ng/ml。在32、160、800和4000ng/ml的浓度下利用质量控制样品。
[0355]
还利用基于lc-ms/ms的“代谢物寻找”方案定性分析mrs2365代谢物的血浆和血液样品。从检视其它核苷酸(例如atp、adp)的代谢路径中，假设mrs2365的最可能代谢物会是去磷酸化的(即，单磷酸盐)代谢物(mrs2347，mw＝403.07)和/或完全去磷酸化的核苷代谢物(mrs4322，mw＝323.10)。对于母体化合物和代谢物，通过正离子和负离子lc/ms-ms分析血液和血浆样品，正如预期磷酸化的化合物将优选地产生负离子，而核苷mrs4322将优选地产生正离子。在正离子模式中，萃取离子色谱图监测质量在323.7-324.7和403.7-404.7的范围内以分别找到mrs4322和mrs2347。进一步分析这些范围内的任何离子峰以针对这些离
子色谱图峰产生产物离子光谱。在负离子模式中，萃取离子色谱图分别监测321.70-322.70、401.70-402.70和481.70-482.70的范围内的质量以找到mrs4322、mrs2347和mrs2365；进一步分析峰以产生产物离子光谱。因为不可获得mrs4322和mrs2347的可靠标准物，仅可对代谢物进行定性鉴别，因为由于电离效率的可能差异不可比较离子峰高度/面积。
[0356]
结果
[0357]
两种时程方案用于评估mrs2365在小鼠和人类血浆中的血浆稳定性。用edta制备的血浆经240分钟时程产生初始数据。后续研究利用孵育后1-30分钟的时间点，并且最终研究利用孵育后5-90秒的较短时程。在所有方案中，在由用edta或肝素锂作为抗凝血剂的血液制备的血浆中分析血浆稳定性。血浆和全血中的依那普利(小鼠)和普鲁卡因(人类)的活体外稳定性数据与公开值一致(数据未展示)。
[0358]
在利用edta制备的血浆的血浆稳定性研究中，mrs2365经孵育出到孵育后240分钟的时程基本上稳定(图3和4)。经孵育的时程不可计算半衰期值，并且因此》240分钟。在后续代谢物寻找分析中，不可检测到mrs2347或mrs4322。这些数据表明，mrs2365在小鼠和人类血浆中是活体外稳定的。
[0359]
当在已用edta作为抗凝血剂处理的小鼠和人类全血中评估mrs2365的稳定性时，进行类似观察(图5和6)。在那些研究中，经过edta处理的小鼠全血中的mrs2365的半衰期是47分钟，表明edta并不完全抑制mrs2365在这一基质中的清除率。然而，mrs2365在经过edta处理的人类全血中再次完全稳定，估计的半衰期》240分钟。在这些全血研究中检测不到代谢物。
[0360]
这些数据与为血浆制备而利用肝素作为血液抗凝血剂的小鼠中的mrs2365的初始活体内药物动力学评价不一致，其中mrs2365似乎以逼近心输出量的速率快速清除，表明化合物的深入肝外清除率。众所周知，edta螯合外核苷酸酶(负责去磷酸化核苷酸的酶，其存在于细胞膜的两个表面上并且在血液和血浆中循环)的酶促活性所需的二价阳离子(参见ziganshin等人欧洲生理学杂志(1995)429:412-418)。因此，p2y1激动剂核苷酸类似物mrs2365的主要代谢路径被用于制备上文所描述的研究的血浆和全血的edta完全抑制是可能的。
[0361]
为研究这一可能性，进行额外的稳定性研究以比较已有edta或肝素锂产生的血浆中的mrs2365的稳定性，肝素锂为对外核苷酸酶无报导抑制性作用的抗凝血剂。研究首先用肝素化血浆和全血经0-30分钟的时程进行。mrs2365浓度的定量揭露在所有时间点与不充分数据下mrs2365的极其低的浓度，以计算活体外半衰期(数据未展示)。由于在甚至本研究中的最短时间点(0和1分钟)下观察到低/不可检测的mrs2365浓度，用显著较短时程(0-90秒)重复研究以比较经过edta处理和经过肝素处理的血浆中的活体外稳定性并且试图计算活体外半衰期。在这一较短研究中，mrs2365在经过edta处理的小鼠和人类血浆中相对较稳定(图5和6)；mrs2365浓度的变化可能是由于在短的时程的起始时的不完全混合以及经90秒孵育时间的时程在多个时间点取样的变化。然而，在经过肝素处理的血浆中，mrs2365浓度在甚至最短(0和5秒)时间点下极其低。mrs2365在磷酸盐缓冲盐水中孵育时完全稳定。
[0362]
这些数据共同表明，尽管mrs2365在溶液中固有地稳定，但其通过由edta抑制的过程快速降解在小鼠和人类血浆和血液中。考虑到mrs2365是核苷酸类似物，并且edta是使核
苷酸去磷酸化的外核苷酸酶的已知抑制剂，这些数据强烈表明mrs2365易受血浆和全血中的快速去磷酸化影响，与小鼠中的mrs2365产生的活体内药物动力学数据一致。
[0363]
为进一步研究mrs2365的去磷酸化的可能性作为小鼠和人类血浆和全血中不稳定性的原因，代谢物寻找在100μm下孵育mrs2365之后在肝素化人类血浆和血液中进行10或30分钟；更高底物浓度用于确保所形成的任何代谢物的检测。说明在正电离条件下的代表性离子色谱图和产物离子光谱(图7和8)；负电离色谱图和产物离子光谱得到类似结果(数据未展示)。尽管化学标准物的缺乏防止测定代谢物的绝对浓度，但相较于代谢物m2，从孵育后10到30分钟，代谢物m1的相对丰度增加。在两种电离条件下的代谢物m2和m1母离子色谱图和所得产物离子光谱分别与去磷酸化的单磷酸盐代谢物mrs2347和完全去磷酸化的核苷代谢物mrs4322的质量和结构一致(图9)。两种代谢物的检测和代谢物m1(mrs4322)相对于代谢物m2(mrs2347)的丰度表明在人类血浆和血液中逐步地去磷酸化mrs2365，通过单磷酸化中间体mrs2347进行，所述中间体接着进一步去磷酸化成未磷酸化的核苷mrs4322。
[0364]
这些数据共同支持假定mrs2365在血浆和血液中通过循环去磷酸化母体化合物的外核苷酸酶快速代谢，最终产生未磷酸化的核苷mrs4322。这一过程由edta(已知螯合外核苷酸酶活性所需的二价阳离子的试剂)抑制。
[0365]
实例5：在小鼠的tbi之后的mrs4322的神经保护性功效
[0366]
目的
[0367]
本研究经设计以确定经历创伤性脑损伤(tbi)的小鼠中的mrs4322的神经保护性功效，并且比较用mrs2365和腺苷a3受体完全激动剂cl-ib-meca处理的自由小鼠。
[0368]
方法
[0369]
化学物质：mrs4322获自国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所(马里兰州贝塞斯达)的尊敬的ken jacobson博士。cl-ib-meca可购自托克里斯生物科学(英国布里斯托尔)和几个其它供应商。所有其它化学物质都从西格玛-阿尔德里奇(密苏里州圣路易斯)获得。
[0370]
动物和创伤性脑损伤(tbi)：tbi用如talley-watts等人2012(神经外伤杂志(j.neurotrauma)30,55-66)中所描述的受控封闭的颅骨损伤模型进行。根据其中描述的方法，气动冲击装置用于产生留下颅骨和硬脑膜物质物质完整的中度tbi。为实现这，c57bl/6小鼠用含异氟醚(3％诱发，1％维持)的100％氧气麻醉。使用温度受控加热手术台维持37℃的体温。使用无菌手术技术在头皮上做出小的中线切口。5mm不锈钢片位于颅骨上并且使用超强力胶水固定在躯体感觉皮层上方的前囟与lamda之间的右顶骨上。接着将小鼠位于气动冲击尖端正下方的载物台上。在2mm的深度下以4.5m/s传递校准冲击，其在小鼠中产生中度损伤。使用4-0尼龙编织的缝合线闭合头皮切口，并且将抗生素软膏涂覆到切口上。将小鼠放置在热重病监护室(braintree科学模型fv-1；37℃；27％o2)中并且进行监测直到完全清醒和自由移动为止。损伤或假处理组(未受损伤)之后三十分钟，小鼠用媒剂(生理盐水)或药物(mrs4322、cl-ib-meca或mrs2365)处理。mrs4322、cl-ib-meca和mrs2365的剂量分别是0.16、0.24和0.2mg/kg，每个等效于大约0.5μmol/kg的等摩尔剂量。
[0371]
gfap的蛋白质印迹分析：在选定存活时间下，小鼠在异氟醚下麻醉并且处死。脑被去除并且放置在冰上以解剖成受到冲击和未受到冲击的脑半球。分离的组织使用惠顿玻璃杜恩斯(wheaton glass dounce)(20个中风)在冰上在冷冻的均匀化缓冲液(0.32m蔗糖，1mm edta，1m tris-hcl ph＝7.8)中快速均匀化。将匀浆转移到2ml管中并且在4℃下在
1000g下离心10分钟，并且收集和分析上澄液。通过使用1:50稀释的bca分析测定蛋白质浓度。随着添加每种样品和含有勒姆利缓冲液(laemmli buffer)的β-巯基乙醇的等分试样去除100μg蛋白质，并且在95℃下将样品放置在加热块中3分钟。样品负载在12％凝胶上并且在80v下运行20分钟之后在130v下运行40分钟。在100v下将样品转移到硝酸纤维膜上维持1小时。膜用5％牛奶在tbs-t中封闭30分钟。添加gfap(1:1000-imgenex img-5083-a)，并且放置在4℃下过夜。膜用tbs-t洗涤三次达10分钟。在室温下施加gfap的第二抗体(donkey抗兔hrp共轭的(immunojackson实验室(immunojackson laboratories)；711-035-152；1:20000)达1小时。膜用tbs-t洗涤15分钟(3次)并且按照制造商的说明使用西方闪电加ecl套件(western lightning plus-ecl kit)(珀金埃尔默公司(perkinelmer,inc.))显影。
[0372]
结果
[0373]
mrs4322减少在tbi之后的小鼠脑中的gfap表达。胶质细胞原纤维酸性蛋白(gfap)表达用作tbi之后的反应性神经胶质增生的生物标记(talley-watts等人2012；sofroniew,2005)我们进行假处理组、tbi或tbi再处理(mrs4322或mrs2365)的小鼠中的gfap表达的蛋白质印迹分析，所述小鼠在损伤后7天处死。首先，蛋白质印迹分析证实tbi诱发gfap表达在损伤后7天时脑的同侧(其中冲击居中)和对侧中显著增加(图12a)。gfap表达在来自用mrs4322或mrs2365处理的小鼠的印迹中显著减少，所述小鼠在初始创伤的30分钟内注射(图12a)。对于负载对照，使用β-肌动蛋白蛋白质印迹并且在相应通路下展示。图12a中展示的蛋白质印迹全部从代表性实验中获得并且在相同凝胶上运行。从3个单独实验中平均化并且展示gfap/肌动蛋白比率的相对变化的数据(在图像j软件中测量的谱带强度)以平均 /-sem呈现于图12b中。在第7天(100％)已将值归一化到tbi含量，以合并数据。给定实验处理的小鼠的总数在图12b中由n表示。
[0374]
mrs4322和腺苷a3受体激动剂减少在tbi之后小鼠血浆的gfap表达。由于创伤后血脑屏障(bbb)的分解，血浆中的gfap水平也已用作tbi的生物标记。因此，我们也从tbi小鼠中收集第7天的血浆样品。类似于脑组织，我们发现通过蛋白质印迹分析易于在第7天检测到gfap水平(图12c)。更重要的是，我们发现获自用mrs4322或cl-ib-meca(腺苷a3受体激动剂)处理的tbi小鼠的血浆的蛋白质印迹呈现相对于肌动蛋白显著减少水平的gfap(图12c)。每种实验条件的平均gfap/肌动蛋白比率的直方图呈现于图12d中。每次实验处理的小鼠的总数由值n表示。
[0375]
mrs4322是小鼠中a3受体的低亲和力(4900nm)激动剂。相反地，cl-ib-meca是小鼠中的高亲和力(0.18nm)激动剂-这两种化合物的亲和力差异是大约25,000倍。然而，在小鼠光栓塞中风和tbi模型中，mrs4322展示由a3拮抗剂mrs1523阻断的显著功效，而cl-ib-meca是非活性(中风)或弱活性的(tbi，图12)。这显然是来自受体亲和力的观点的非显而易见的结果。我们对此发现的当前解释是基于吾等已针对mrs4322和cl-ib-meca产生的专属adme/pk数据。cl-ib-meca是亲脂性化合物(clogp大约2.5)，其高度结合到血浆蛋白质(游离部分0.002)并且非特异性高度结合到脑组织(游离部分0.002)。mrs4322是非常亲水性的化合物(clogp《0)，其具有非常大的未结合的血浆部分(0.74)和脑部分(0.13)。仅未结合药物可用于分布在膜中并且与受体相互作用。因此，尽管其较低的受体亲和力，这些小鼠模型中可用以与a3受体相互作用的mrs4322的部分比cl-ib-meca的至少高出1000倍。我们认为，在这些小鼠模型中，相比于cl-ib-meca(和mrs5698，另一种亲脂性和高度结合的/高亲和力完全
a3r激动剂)，化合物物理化学特性和adme/pk特征的这些显著差异有助于mrs4322的非显而易见的功效。
[0376]
偏向激动作用。腺苷a3受体是g蛋白质偶合的多效性受体，即这种受体的激动作用通过多个g蛋白质以及β-抑制蛋白潜在地活化多个下游路径。由a3受体激动作用活化的路径当前已被鉴别出，但可能并不限于gq11介导的细胞内钙移动、camp产生的gi介导的调节和erk1/2和akt的gi介导的磷酸化。我们的发现的一个方面在于细胞内钙的a3介导的移动，导致星形胶质细胞中粒线体atp产生的促进。
[0377]
受体药理学中出现的概念是偏向激动作用。这一概念说明对于多效性的受体，存在实际上不同类别的激动剂，其中一些可活化所有下游路径，而其它的则展示在活化下游路径的子组中的偏向。在药物发现和受体药理学中，偏向激动作用引入具有较少脱靶作用，即较少副作用的路径活化中的增加的特异性的可能性。对于a3受体，存在偏向激动作用的证据。然而，如cl-ib-meca和mrs5698的原型高亲和力激动剂是完全激动剂，其不展示前述下游路径的偏向活化。因此，并且不希望受任何具体的理论所束缚，人们相信mrs4322是在较少/不活化其它a3介导的路径的情况下优选地活化细胞内钙移动的偏向激动剂。这一发现解释相对于完全无偏性的激动剂cl-ib-meca和mrs5698，在小鼠中风和tbi模型中观察到的mrs4322功效。
[0378]
实例6：在小鼠的中风之后的mrs4322的神经保护性功效
[0379]
目的
[0380]
本研究经设计以确定经历中风的小鼠中的mrs4322的神经保护性功效，并且在存在和不存在a3受体拮抗剂mrs1523下以及与完全a3r激动剂mrs5698和cl-ib-meca相比，比较用mrs2365处理的小鼠。mrs1523具有以下结构：
[0381][0382]
方法
[0383]
化学物质：mrs4322获自国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所(马里兰州贝塞斯达)的尊敬的ken jacobson博士。cl-ib-meca、mrs5698和mrs2365可购自托克里斯生命科学(英国布里斯托尔)和几个其它供应商。所有其它化学物质都从西格玛-阿尔德里奇(密苏里州圣路易斯)获得。
[0384]
光栓疗法诱发的中风：光栓疗法如zheng等人2010(科学公共图书馆综合卷(plos one)5(12):e14401)中所描述进行。简单来说，孟加拉玫瑰红(rose bengal)是一种荧光染料，其在注入血管系统并且受激时产生伤害内皮壁并且诱发局部血栓(凝块)的单态氧。使用这种技术，在人工脑脊髓液(acsf)中对小鼠给出灭菌的孟加拉玫瑰红(rb，美国西格玛(sigma,u.s.a.))的0.1ml尾部静脉注射液。rb浓度是20mg/ml。皮层区域在成像区中居中，并且使用0.8-na40
×
水浸没的物镜(东京尼康(nikon,tokyo))用绿色激光(543nm，5mw)照亮。实时监测凝块形成直到靶血管或下游毛细血管牢固地堵塞为止。稳定的凝块随后由高
度荧光区域结束的非荧光血管分段鉴别出。在对照实验中，激光照亮或孟加拉玫瑰红本身并不导致凝块形成。治疗、mrs4322(0.16mg/kg；0.5μmol/kg)或mrs2365(0.24mg/kg；0.5μmol/kg)通过腹膜内注射(i.p.)引入。对于a3受体拮抗剂mrs1523的实验，在0和2小时时间点对小鼠施用腹膜内注射液(2mg/kg)以确保在整个研究的时程中的受体拮抗作用。
[0385]
动物和光栓疗法诱发的中风：中风如zheng等人2010(科学公共图书馆综合卷5(12):e14401)中所描述进行。雌性c57bl/6小鼠(4-6个月)用于本研究。从这一手稿的方法中：小鼠在3％异氟醚与100％氧气下麻醉，并且随后通过鼻椎体维持在1％异氟醚下。根据生命体征、夹捏缩回和眨眼监测和调控麻醉的深度。通过反馈受控加热垫将体温维持在37℃(gaymar t/泵)。通过使用mouseox系统(starr生命科学(starr life sciences))不断监测包括氧气饱和、呼吸速率和心率的生命体征。修剪每个小鼠头部上的毛发，并且在头皮中做出小切口以暴露颅骨。用vetbond组织粘着剂(3m,st paul,mn)将定制的不锈钢板胶合到颅骨上。视实验而定，颅侧变薄的颅骨成像窗口在右边初级躯体感觉皮层上方形成(约1.5mm前囟的后方和从中线的2mm外侧)。简单来说，颅骨的大区域首先用电钻井变薄，并且接着用手术刀片进一步变薄。变薄颅骨的最终厚度是大约50μm。在颅侧成像窗口形成之后，将小鼠转移到显微镜载物台上并且用于光栓疗法或成像实验。对于重复成像实验，将所述板谨慎地脱离颅骨并且缝合头皮(ethicon 6-0sild缝合线)。在每个实验之后，将小鼠返回到笼中直到下一时间点为止或处死。由圣安东尼奥市的德克萨斯大学健康科学中心的机构动物护理和使用委员会(institutional animal care and use committee，iacuc)批准所有程序。中风或假处理组(未受损伤)之后三十分钟，小鼠用媒剂(生理盐水)或药物(mrs4322、mrs2365、mrs5698或cl-ibmeca)处理。
[0386]
光栓塞梗塞后评估。使用如zheng等人2010(科学公共图书馆综合卷5(12):e14401)中所描述的2,3,5-氯化三苯基四氮唑(ttc)染色评估脑梗塞的尺寸。简单来说，用ttc染色脑片中的rb诱发的病灶。ttc是无色染料，其在由粒线体酶丁二酰基去氢酶还原时将健康脑组织染成红色(bederson jb等人,1986)。接着使用坏死组织中的染色缺失界定脑梗塞的区域。通过颈部脱臼处死小鼠，去除其脑，并且接着放置在冰冷的hbss中3分钟。随后将脑转移到脑模具(kopf)中，切成1mm切片并且在37℃下浸没在2％ttc中(5min)。在4℃下将切片在10％缓冲甲醛溶液中定影过夜。切片在平面扫描器(hp scanjet 8300)上成像以在1200dpi下分析病灶尺寸。
[0387]
结果
[0388]
mrs4322治疗减少中风后的脑梗塞。多个血管光栓塞中风与如上文所描述的rb一起使用尾部静脉注射在小鼠中诱发。在凝块形成的30分钟内，向小鼠腹膜內注射媒剂(生理盐水对照)、mrs4322(0.16mg/kg；0.5μmol/kg)或mrs2365(0.24mg/kg；0.5μmol/kg)。初始中风的二十四小时后，如上文所描述用ttc染色评估脑梗塞尺寸。代表性ttc染色的脑片呈现于图13a中。我们发现mrs4322和mrs2365都显著减小脑梗塞的尺寸。经过媒剂、mrs4322、mrs2365、mrs5698或cl-ibmeca处理的小鼠的脑梗塞的平均尺寸的直方图呈现于图13c中。这些数据从2个非依赖性实验中汇集。n是指所测试小鼠的总数。
[0389]
a3受体拮抗剂mrs1523抑制中风后mrs4322和mrs2365治疗的神经保护。多个血管光栓塞中风在如上文所描述的小鼠中诱发。然而，在这一实验中，小鼠在0和2小时时间点用腹膜内注射a3受体拮抗剂、mrs1523(2mg/kg)处理以确保受体拮抗作用。接着在凝块形成的
30分钟内以上文所描述的浓度用媒剂、mrs4322、mrs2365、mrs5698或cl-ibmeca注射小鼠。二十四小时后，用ttc染色评估脑梗塞尺寸。代表性ttc染色的脑片呈现于图13b中。我们发现，用mrs1523预处理的小鼠中的脑梗塞尺寸通过用mrs4322或mrs2365、或mrs5698处理不减少。这些实验的脑梗塞的平均尺寸的直方图呈现于图13d中。数据从2个非依赖性实验中汇集。n是指所测试小鼠的总数。
[0390]
实例7：在小鼠的中风之后的mrs1873的神经保护性功效
[0391]
目的
[0392]
本研究经设计以确定mrs1873的神经保护性功效，其是对应的mrs4322的2-氯类似物。实验在经历中风的小鼠中进行，并且比较用mrs4322处理和经过媒剂处理的小鼠。
[0393]
方法
[0394]
化学物质：mrs1873和mrs4322获自国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所(马里兰州贝塞斯达)的尊敬的ken jacobson博士。mrs1873具有以下结构：
[0395][0396]
光栓疗法诱发的中风：光栓疗法如zheng等人2010(科学公共图书馆综合卷5(12):e14401)中所描述进行。简单来说，孟加拉玫瑰红(rose bengal)是一种荧光染料，其在注入血管系统并且受激时产生伤害内皮壁并且诱发局部血栓(凝块)的单态氧。使用这种技术，在人工脑脊髓液(acsf)中对小鼠给出灭菌的孟加拉玫瑰红(rb，美国西格玛)的0.1ml尾部静脉注射液。rb浓度是20mg/ml。皮层区域在成像区中居中，并且使用0.8-na 40
×
水浸没的物镜(东京尼康)用绿色雷射(543nm，5mw)照亮。实时监测凝块形成直到靶血管或下游毛细血管牢固地堵塞为止。稳定的凝块随后由高度荧光区域结束的非荧光血管分段鉴别出。在对照实验中，激光照亮或孟加拉玫瑰红本身并不导致凝块形成。治疗、mrs1873(100ul的100um)或mrs4322(100ul的100um)通过腹膜内注射(i.p.)引入。
[0397]
动物和光栓疗法诱发的中风：中风如zheng等人2010(科学公共图书馆综合卷5(12):e14401)中所描述进行。雌性c57bl/6小鼠(4-6个月)用于本研究。从这一手稿的方法中：小鼠在3％异氟醚与100％氧气下麻醉，并且随后通过鼻椎体维持在1％异氟醚下。根据生命体征、夹捏缩回和眨眼监测和调控麻醉的深度。通过反馈受控加热垫将体温维持在37℃(gaymar t/泵)。通过使用mouseox系统(starr生命科学)不断监测包括氧气饱和、呼吸速率和心率的生命体征。修剪小鼠头部上的毛发，并且在头皮中做出小切口以暴露颅骨。用vetbond组织粘着剂(3m,st paul,mn)将定制的不锈钢板胶合到颅骨上。视实验而定，颅侧变薄的颅骨成像窗口在右边初级躯体感觉皮层上方形成(约1.5mm前囟的后方和从中线的2mm外侧)。简单来说，颅骨的大区域首先用电钻井变薄，并且接着用手术刀片进一步变薄。变薄颅骨的最终厚度是大约50μm。在颅侧成像窗口形成之后，将小鼠转移到显微镜载物台上并且用于光栓疗法或成像实验。对于重复成像实验，将所述板谨慎地脱离颅骨并且缝合
头皮(ethicon 6-0sild缝合线)。在每个实验之后，将小鼠返回到笼中直到下一时间点为止或处死。由圣安东尼奥市的德克萨斯大学健康科学中心的机构动物护理和使用委员会(iacuc)批准所有程序。中风或假处理组(未受损伤)之后三十分钟，小鼠用媒剂(生理盐水)或药物(mrs4322或mrs2365)处理。
[0398]
光栓塞梗塞后评估。使用如zheng等人2010(科学公共图书馆综合卷5(12):e14401)中所描述的2,3,5-氯化三苯基四氮唑(ttc)染色评估脑梗塞的尺寸。简单来说，用ttc染色脑片中的rb诱发的病灶。ttc是无色染料，其在由粒线体酶丁二酰基去氢酶还原时将健康脑组织染成红色(bederson jb等人,1986)。接着使用坏死组织中的染色缺失界定脑梗塞的区域。通过颈部脱臼处死小鼠，去除其脑，并且接着放置在冰冷的hbss中3分钟。随后将脑转移到脑模具(kopf)中，切成1mm切片并且在37℃下浸没在2％ttc中(5min)。在4℃下将切片在10％缓冲甲醛溶液中定影过夜。切片在平面扫描器(hp scanjet 8300)上成像以在1200dpi下分析病灶尺寸。
[0399]
结果
[0400]
mrs1873治疗减少中风后的脑梗塞：多血管光栓塞中风与如上文所描述的rb一起使用尾部静脉注射在小鼠中诱发。在凝块形成的30分钟内，向小鼠腹膜內注射媒剂(生理盐水对照)、mrs1873(100ul的100um)或mrs4322(100ul的100um)。初始中风的二十四小时后，如上所描述用ttc染色评估脑梗塞尺寸。代表性ttc染色的脑片呈现于图14b中。我们发现mrs1873和mrs4322都显著减小脑梗塞的尺寸。经过媒剂、mrs1873和mrs4322处理的小鼠的脑梗塞的平均尺寸的直方图呈现于图14b中。这些数据从3个非依赖性实验中汇集。n是指所测试小鼠的总数。
[0401]
功效的药物动力学和基本原理
[0402]
mrs1873是mrs4322的2-cl类似物并且也是腺苷a3激动剂。在低分子量、亲水性(clogp《0)和拓扑极性表面积方面，mrs1873物理化学特性与mrs4322的那些一致。由于adme/pk参数，如血浆和脑结合、清除率和分布体积由这些物理化学特性驱使，我们已展示mrs4322和mrs1873的相似药物动力学。另外，我们已展示鼠类光栓塞中风模型中的mrs4322和mrs1873的类似功效。
[0403]
实例8：用于确定a3腺苷受体(a3r)下的化合物的偏向激动作用的实验方案
[0404]
以下分析可用于确定所公开的化合物，如mrs4322或mrs1873，是否呈现a3受体处的偏向的激动作用(也称为功能选择性或激动剂运输)。
[0405]
材料。fluo-4，杜氏改良伊格尔培养基(dulbecco's modified eagle's medium，dmem)和青霉素-链霉素可购自英杰公司(invitrogen)(加利福尼亚州卡尔斯巴德(carlsbad,ca))。腺苷脱氨酶(adenosine deaminase，ada)和湿霉素-b可购自罗奇(roche)(瑞士巴塞尔(basel,switzerland))。胎牛血清(fetal bovine serum，fbs)可购自thermotrace(澳大利亚墨尔本(melbourne,australia))。alphascreen surefire细胞外信号调控的激酶1和2(erk1/2)、akt 1/2/3和camp套件可从珀金埃尔默(perkinelmer)(马萨诸塞州波士顿(boston,ma))中获得。前缀是mrs的所有化合物可如先前所描述进行合成(tosh等人,2012a,b)。所有其它试剂都购自西格玛-阿尔德里奇(密苏里州圣路易斯)。
[0406]
细胞培养。使用事先描述的方法，人类a3r的序列可克隆到gateway进入载体pdonr201中，并且接着在gateway目的载体pef5/frt/v5-dest中转移(stewart等人,2009)。a3-flpin-cho细胞可使用事先described的方法产生(may等人,2007)并且在含有补充有10％fbs和选择抗生素湿霉素-b(500μg/ml)的dmem中的5％co2的含湿气孵育箱中维持在37℃下。为了细胞存活、erk1/2磷酸化、akt 1/2/3磷酸化和钙移动分析，细胞可以4
×
104个细胞/孔的密度接种到96孔培养板中。6小时后，细胞用无血清dmem洗涤并且在分析之前在37℃下在5％co2中维持在无血清dmem中12-18小鼠。为了camp分析，细胞可以2
×
104个细胞/孔的密度接种到96孔培养板中并且在分析之前在37℃下在5％co2中孵育过夜。
[0407]
细胞存活分析。在缺失和存在a3r配体的情况下，介质被去除并且被含有ada(1u/ml)和青霉素-链霉素(0.05u/ml)的hepes-缓冲盐水溶液(10mm 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(hepes)、146mm nacl、10mm d-葡萄糖、5mm kcl、1mm mgso4、1.3mm cacl2和1.5mm nahco3，ph是7.45)置换。板接着在含湿气孵育箱中维持在37℃24小时，之后将5mg/ml碘化丙锭加入细胞。板可接着在envision读盘器(珀金埃尔默)上读取，其中激励和发射分别设定为320nm和615nm。数据将归一化到100％细胞存活和0测定％细胞存活，分别在hepes缓冲液中在t＝0小时并且在milli-q水中在t＝24小时测定。
[0408]
erk1/2和akt 1/2/3磷酸化分析。每个配体的erk1/2和akt 1/2/3磷酸化的浓度响应曲线可以在含有1u/ml ada的无血清dmem中进行(在37℃下暴露5分钟)。激动剂刺激可通过去除介质并且将100ml surefire裂解缓冲液加入每个孔中来终止。接着搅动板5分钟。perk1/2的检测可涉及384孔proxiplate中的11ml的总体积的裂解物:活化缓冲液:反应缓冲液:alphascreen受体珠粒:alphascreen供体珠粒的80:20:120:1:1v/v/v/v/v稀释。在37℃下可将板在暗处孵育1小时，之后通过envision读盘器(珀金埃尔默)来测量荧光，其中激励和发射分别设定为630nm和520-620nm。akt 1/2/3磷酸化的检测可采用384孔proxiplate中的9l的总体积的裂解物:活化缓冲液:反应缓冲液:alphascreen受体珠粒的40:9.8:39.2:1v/v/v/v稀释。在室温下可将板在暗处孵育2小时，之后可添加11μl的总体积的稀释缓冲液:alphascreen供体珠粒的19:1v/v稀释物。在室温下可再将板在暗处孵育2小时，之后通过envision读盘器(珀金埃尔默)来测量荧光，其中激励和发射分别设定为630nm和520-620nm。将激动剂浓度-响应曲线归一化到由10％fbs介导的磷酸化(5分钟刺激)。
[0409]
钙移动分析。介质可从96孔板中去除并且被含有1u/ml ada、2.5mm丙磺舒、0.5％牛血清白蛋白(bsa)和1m fluo4的hepes缓冲盐水溶液置换。可在含湿气孵育箱中在37℃下将板在暗处孵育1小时。flexstation读盘器(加利福尼亚州森尼韦尔分子仪器公司(molecular devices,sunnyvale,ca))可在缺失和存在激动剂和所测量荧光(激励，485nm；发射，520nm)下每1.52秒进行添加hepes缓冲盐水溶液达75秒。峰与基线荧光之间的差异可测量为细胞内ca
2
移动的标记物。a3r激动剂浓度响应曲线可归一化到由100μm atp介导的响应以解释细胞数量和负载效率的差异。
[0410]
camp积累分析的抑制。介质可以被刺激缓冲液(140mm nacl，5mm kcl，0.8mmgso4，0.2mm na2hpo4，0.44mm kh2po4，1.3mm cacl2，5.6mm d-葡萄糖，5mm hepes，0.1％bsa，1u/ml ada和10μm咯利普兰，ph 7.45)置换并且在37℃下孵育1小时。camp积累的抑制可通过与a3r激动剂一起预孵育a
3-flpin-cho细胞10分钟来评估，此后再添加3μm弗斯可林(forskolin)30分钟。反应可通过快速去除缓冲液和添加50μl冰冷的100％乙醇来终止。在添加50μl检测缓冲液(0.1％bsa，0.3％吐温-20，5mm hepes，ph 7.45)之前使乙醇蒸发。搅动板10分钟，此后将10μl裂解物转移到384孔optiplate中。检测可采用添加alphascreen受体珠粒:刺激缓
冲液的5μl 1:49v/v稀释物。然后，15μl的alphascreen供体珠粒:检测缓冲液:3.3u/μl的1:146:3v/v/v稀释物生物素标记camp以形成30μl的总体积。供体珠粒/生物素标记的camp混合物可在添加之前平衡30分钟。在室温下可将板在暗处孵育过夜，之后通过envision读盘器(珀金埃尔默)来测量荧光，其中激励和发射分别设定为630nm和520-620nm。激动剂浓度响应曲线可归一化到仅由3μm弗斯可林(0％)或缓冲液(100％)介导的响应。
[0411]
分子建模。对接模拟可使用人类a3r的同源模型针对在本研究中研究的所有化合物进行。具体地说，可使用三个事先报告的模型：完全基于激动剂结合的ha
2a
ar晶体结构的模型(pdb id:3qak)、基于混合a
2a
ar-β2肾上腺素受体模板的模型和基于混合a
2a
ar-视蛋白模板的模型(β2肾上腺素受体x射线结构pdb id:3sn6；视蛋白晶体x射线晶体结构pdb id:3dqb)(tosh等人,2012a)。与基于a
2a
ar的模型相比，基于混合模板的模型将展现tm2的朝外移动。使用实施于套件中的增效剂和ligprep工具可针对对接建构和制备a3r配体的结构(释放2013-3,llc,纽约(new york),ny,2013)。配体在a3r模型下的分子对接可借助于套件的格力得包装部分进行。具体地说，glide栅格可在腺苷受体，即phe(el2)、asn(6.55)、trp(6.48)和his(7.43)的结合袋的一些关键残余物的图心上居中。glide栅格可使用的内盒(配体直径中点盒)和在每一方向上从内盒延伸的外盒(其中必须含有所有配体的盒)建构。配体的对接可以使用xp(超精确度)程序在刚性结合部位中进行。每种配体的顶部评分对接构象可经历蛋白质-配体相互作用的目测和分析以选择与实验数据一致的所提出的结合构象。
[0412]
数据分析。统计分析和曲线拟合可以使用prism 6(加利福尼亚州圣地亚哥graphpad软件(graphpad software,san diego,ca))进行。为定量信号传递偏向，激动剂浓度-响应曲线可使用如先前所描述的激动作用的black-leff操作模型的求导通过非线性消退来分析(kenakin等人,2012；wootten等人,2013；van der westhuizen等人,2014)。转导系数τ/ka[表述为对数，log(τ/ka)]可用于定量偏向激动作用。为解释对激动剂响应的细胞依赖性作用，转导比率可归一化到针对参考激动剂ib-meca获得的值以产生alog(τ/ka)。为测定每种激动剂在不同信号传递路径下的偏向，alog(τ/ka)将归一化到参考路径perk1/2以产生aalog(τ/ka)。偏向可定义为10
aalog(τ/ka)
，其中偏向的缺乏将产生不在统计上不同于1或0的值，同时表述为对数。所有结果可表述为平均6s.e.m。统计分析将涉及f测试或图克(tukey)或邓尼特(dunnett)事后测试的单因素方差分析，统计显著性测定为p，0.05。
[0413]
实例9：mrs4322的合成途径
[0414]
mrs4322和类似化合物，如mrs1873可根据所属领域中已知的方法制备。举例来说，mrs4322可通过描述于choi,w.j.等人.有机化学杂志(j.org.chem.)2004,69,2634-2636,tosh,d.k.等人嘌呤能信号传导2015,11,371-387；和欧洲化学(chem.eur.j.),2009,15,6244-6257中的以下途径由d-核糖制备。以下流程1和2展现合成途径。
[0415]
流程1：mrs4322的合成
[0416][0417]
zhan cat-1b具有以下结构：
[0418][0419]
流程2展示合成的剩余部分。
[0420]
流程2：mrs4322的合成(接上)
[0421][0422]
实例10：所公开的化合物的心肌保护的基本原理
[0423]
我们已展示p2y1激动剂极其快速和定量去磷酸化成化合物，如，是腺苷a3激动剂的mrs4322。出人意料地发现这些腺苷a3激动剂在如本文所描述的中风和创伤性脑损伤的多个鼠类模型中有效。不希望受任何具体的理论所束缚，人们相信当前描述的a3激动剂，如mrs4322和mrs1873作为心脏保护剂是有效的。
[0424]
展示将mrs2365和相关磷酸化的核苷快速和定量去磷酸化成化合物(如mrs4322和mrs1873)的我们的数据支持我们的权利要求，这些p2x4激动剂的传说的心脏保护功效实际上是由于其去磷酸化代谢物的腺苷a3激动作用。实际上，我们已展示mrs1873是在中风和创伤性脑损伤模型中有效的腺苷a3激动剂。
[0425]
实例11：在向新生猪静脉内施用之后mrs4322的药物动力学和结合
[0426]
目的
[0427]
本研究经设计以测定在向新生猪静脉内施用之后mrs4322的血浆、脑和csf浓度。
[0428]
方法
[0429]
化学物质。mrs4322获自国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所(马里兰州贝塞斯达)的尊敬的ken jacobson博士。
[0430]
动物。称重为大约7.5kg的四周大的雌性新生猪用于本研究，由宾夕法尼亚州大学(university of pennsylvania)(宾夕法尼亚州费城(philadelphia,pa.))生物工程部门供应。为在研究期间药物浓度测定，动物配备有脑微透析探针以获得脑细胞外液样品。所有研究在经过批准的宾夕法尼亚州大学iacuc方案下进行。
[0431]
药物施用：将mrs4322溶解于dmso中，并且接着在生理盐水中稀释以制备给药溶液。通过向每个新生猪(n＝3)静脉内推注施用来施用10ml体积的给药溶液。
[0432]
组织取样：血液样品在给药后0.25、0.5、1、2、4和6小时获得。脑细胞外液样品在给药后1、4和6小时从移植的微透析探针中获得。在每个时间点获得全血(1ml)，并且放置在含
有肝素的真空采血系统管中，并且立刻离心以制备血浆；血浆存储在-80℃下。脑细胞外液和脑脊髓液样品存储在-80℃下。在处死时(剂量后6小时)，获得和冷冻脑脊髓液样品，而来自皮层和海马体的脑样品通过断头处死获得，在冰冷的磷酸盐缓冲盐水中冲洗并且称重。脑样品接着立刻在液氮中快速冷冻并且存储在-80℃下。
[0433]
生物分析
[0434]
利用甲苯磺丁脲作为内标物通过lc-ms/ms来测定mrs4322的血浆、脑、脑细胞外液和脑脊髓液浓度。下表概述所用lc和ms/ms条件：
[0435]
表12：mrs4322血浆、脑、脑细胞外液和脑脊髓液浓度测定的生物分析方法
[0436]
[0437][0438]
对于每种组织基质，形成标准曲线并且测定lloq/uloq浓度。所有mrs4322基质的标准曲线的校准范围是0.1-1000ng/ml。
[0439]
对于mrs4322的脑浓度的生物分析，脑样品以4
×
稀释在冰冷的磷酸盐缓冲盐水中均匀化。所得稀释的脑匀浆的等分试样用乙腈处理并且由lc-ms/ms分析。
[0440]
结果
[0441]
在对新生猪静脉内施用之后，在血浆、脑、脑细胞外液和脑脊髓液样品中可检测mrs4322浓度(图1b和图16，表13)。
[0442]
表13：在静脉内施用之后新生猪中的mrs4322的血浆、脑、脑细胞外液和脑脊髓液浓度
[0443]
[0444][0445]
blq＝低于定量的下限(对于血浆0 0975ng/ml)
[0446]
表14：在静脉内施用之后新生猪中的mrs4322的血浆药物动力学
[0447][0448]
血浆浓度使得允许tmax、cmax、血浆清除率、分布体积、半衰期和auc(表14)的初始估计值。
[0449]
尽管在脑、脑细胞外液和脑脊髓液中可检测到mrs4322浓度，但除cmax和tmax外对于半衰期或其它药物动力学参数的估计数据是不充分的。然而，基于在获得所有基质的样品时在给药后6小时可获得的血浆和脑数据，基于血浆和脑中的平均浓度，估计全部药物的脑/血浆比率是大约0.3。
[0450]
这些结果证实mrs4322的循环血浆浓度在向新生猪静脉内施用之后可检测，并且在给药条件下将mrs4322良好分布到脑。
[0451]
实例12：新生猪中的mrs4322的血浆和脑结合
[0452]
目的
[0453]
本研究经设计以测定新生猪中的mrs4322的血浆和脑游离部分。
[0454]
方法
[0455]
化学物质。mrs4322获自国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所(马里兰州贝塞斯达)的尊敬的ken jacobson博士。从第七波实验室(密苏里州马里兰海茨)的商业供应商获得分析级的磺胺甲基异恶唑和华法林。所有其它化学物质都从西格玛-阿尔德里奇(密苏里州圣路易斯)获得。
[0456]
动物和组织制备。来自雌性新生猪的血浆和脑样品从宾夕法尼亚州大学获得并且存储在-80℃下直到使用为止。
[0457]
血浆超滤空白样品通过解冻冷冻的血浆并且接着在37℃下于含湿气的5％co2室中预升温血浆60分钟来制备。将800ul的等分试样转移到centrifree离心过滤器(ultracel
再生纤维素(nmwl 30,000amu)批次r5ja31736)中，并且在37℃下以2900rpm离心10分钟；收集血浆水滤液并且用于制备标准物、空白和qc标准物。
[0458]
称重脑，并且使用全组织均匀器用ph为7.4的1:9磷酸盐缓冲盐水均匀化。来自四个小鼠的脑被均匀化、汇集和混合以形成样品。
[0459]
血浆结合测定。将mrs4322、磺胺甲恶唑和华法林溶解于dmso中并且接着在1:1的乙腈:水中稀释以制备100um透析储备溶液。利用磺胺甲恶唑和华法林作为具有已知血浆结合值的研究标准物。将血浆样品在维持在37℃下的含湿气的5％co2孵育箱中预升温60分钟。使用每种化合物的100μm储备溶液将3ml预升温血浆的等分试样各外加mrs4322、磺胺甲恶唑或华法林，导致最终测试浓度为1μm。在37℃下于含湿气的5％co2室中将外加的血浆样品在旋转式混合器上孵育最少60分钟。在60分钟之后，将三个800ul等分试样的每种样品加入centrifree离心过滤器。在37℃下使过滤器经历2900rpm下的离心10分钟。收集三个100ul等分试样的残余血浆以及超滤液以用于生物分析。
[0460]
脑结合测定：将mrs4322、磺胺甲恶唑和华法林溶解于dmso中并且在1:1的乙腈:水中稀释以制备100μm透析储备溶液。将汇集的均匀化的脑在维持在37℃下的含湿气的5％co2孵育箱中预升温60分钟。使用每种化合物的100μm储备溶液将3ml脑匀浆的等分试样各外加mrs4322、磺胺甲恶唑或华法林，导致最终外加浓度为1μm。将外加的汇集的匀浆放置在维持在37℃下的含湿气的5％co2孵育箱中的盘旋馈入装置混合器(nutator mixer)上60分钟。在60分钟之后，将三个800ul等分试样的每种样品加入centrifree离心过滤器。在37℃下使过滤器经历2900rpm下的离心10分钟。收集残余脑匀浆和超滤液的等分试样以用于生物分析。
[0461]
生物分析
[0462]
mrs4322在外加血浆、脑匀浆和相关超滤液中的血浆和脑浓度利用甲苯磺丁脲作为内标物通过lc-ms/ms测定。磺胺甲恶唑和华法林的相关浓度也通过lc-ms/ms使用标准条件测定(数据未展示)。下表概述所用lc和ms/ms条件(表15和表16)。生物分析方法对于所有基质一致；标准曲线统计(例如拟合、截距、斜率、相关系数)针对每种基质测定，但无显著不同，表情因此未针对每种基质展示。
[0463]
表15：用于测定血浆、脑匀浆、血浆超滤液和脑匀浆超滤液浓度的mrs4322的生物分析方法
[0464]
血浆、脑匀浆、血浆超滤液和脑匀浆超滤液样品的生物分析
[0465][0466]
对于每种组织基质，形成标准曲线并且测定lloq/uloq浓度。mrs4322血浆浓度标准曲线的校准范围是5-1000nm。mrs4322血浆超滤液标准曲线的校准范围是5-1000nm。mrs4322脑匀浆和脑匀浆超滤液标准曲线的校准范围分别是5-1000nm和5-1000nm。
[0467]
结果
[0468]
利用血浆超过滤测定mrs4322的血浆结合和游离部分。mrs4322的血浆结合是21.6％；有关游离部分是0.784(表16)。研究标准物磺胺甲恶唑和华法林的结合与文献值一致。
[0469]
表16：mrs4322在新生猪血浆中的未结合部分和结合
[0470][0471][0472]
*mrs5698的血浆超滤液浓度是blq。
[0473]
利用脑匀浆超过滤测定mrs4322的脑结合和游离部分。mrs4322的脑结合是74.7％；有关游离部分是0.253(表17)。研究标准物磺胺甲恶唑和华法林的结合与文献值一致。
[0474]
表17：mrs4322在猪脑匀浆中的未结合部分和结合
[0475]
[0476]
这些数据表明对于所给全部血浆或脑浓度，mrs4322的实质性未结合的药物浓度将可在与腺苷a3受体相互作用的脑中获得。这些结果与也在小鼠中观察到的结果一致。
[0477]
实例13：mrs4322的药理学特征
[0478]
化合物mrs4322在使用细胞膜制剂以重组方式在中国仓鼠卵巢(cho)细胞中表达的人类和小鼠a3腺苷受体处在竞争结合研究中研究。[3h]neca用作a3激动剂放射性配体。因为cho细胞本身不表达腺苷受体，所以可使用非选择性激动剂neca。测定mr4322的放射性配体的浓度依赖性转移。
[0479]
另外，camp实验分别在以重组方式表达人类a3或小鼠a3腺苷受体的cho细胞下进行。非选择性激动剂neca用作对照。
[0480]
结果
[0481]
mrs4322展示相对于[3h]neca，在放射性配体结合研究中，在人类a3受体处的ki值为1490
±
410nm，并且在小鼠a3受体处的ki值为4940
±
974nm。
[0482]
在表达a3腺苷受体的cho细胞中的功能camp积累实验中，mrs4322展示在人类a3受体处的ec
50
值为3630
±
370nm并且在小鼠a3受体处的ec
50
值为759
±
170nm的激动活性。gpcr处的激动剂的ec
50
值取决于受体表达水平。与小鼠a3受体的细胞系相比，人类a3受体细胞系似乎具有更低表达水平，因为观察到更高的ec
50
值，其也是对照激动剂neca的情况。
[0483]
表18：在放射性配体结合研究中测定的cho细胞中稳定表达的腺苷受体处的激动剂的亲和力[ki±
sem(nm)]
[0484][0485]
a alnouri m.w等人选择性是物种依赖性的：人类、大鼠和小鼠腺苷受体处的标准激动剂和拮抗剂的特征(selectivity is species-dependent:characterization of standard agonists and antagonists at human,rat,and mouse adenosine receptors.)嘌呤能信号2015,11,389-407。相同细胞系用于本发明并且用于所公开研究。
[0486]
表19：在camp积累分析中测定的cho细胞中稳定表达的a3腺苷受体处的激动剂效力
[0487][0488]
图17展示相对于在cho细胞中表达的人类a3受体处的a3激动剂放射性配体[3h]neca(10nm)，mrs4322的竞争结合实验。mrs4322的计算出的ki值是1490
±
410nm。
[0489]
图18展示相对于在cho细胞中表达的小鼠a3受体处的a3激动剂放射性配体[3h]neca(10nm)，mrs4322的竞争结合实验。mrs4322的计算出的ki值是4940
±
974nm。图19展示在cho细胞中表达的人类a3受体处的mrs4322和neca的camp积累实验。mrs4322的计算出的ec
50
值是3630
±
370nm；对于neca，测定41.8
±
6.3nm的ec
50
值。图20展示在cho细胞中表达的小鼠a3受体处的mrs4322和neca的camp积累实验。mrs4322的计算出的ec
50
值是759
±
170nm；对于neca，测定6.85
±
0.88nm的ec
50
值。
[0490]
这些结果低于但与mrs1873的已知结合数据相关。人类a3、ki数据：mrs1873 ki＝353nm；ec50＝803nm，公开于：药物化学杂志(j.med.chem.)2002 45:4471-4484.“a3腺苷受体活化的结构决定因素：激动剂/拮抗剂边界处的核苷配体”,gao,z-g.等人。
[0491]
早前文章列出呈85nm的人类a
3 ki：生物有机化学和药物化学通讯(bioorganic and medicinal chemistry letters)2001 11:1333-1337.“环受限的(n)-甲醇碳核苷作为腺苷受体激动剂”,lee,k.等人。
[0492]
当描述多个本发明的实施例时，应理解，上文所描述的特定实例可使用常规实验更改以提供利用本发明的化合物和方法的其它实施例。因此，应了解，本发明的范围仅由所附权利要求书而不由已提供的具体实施例定义。