一种基于代谢组差异筛选花蕾型灰毡毛忍冬的方法

1.本发明属于灰毡毛忍冬品种筛选技术领域，具体涉及一种基于代谢组差异筛选花蕾型灰毡毛忍冬的方法。


背景技术：

2.灰毡毛忍冬(lonicera macranthoides)作为山银花的一种基原植物，其主要有效成分为绿原酸类化合物(chlorogenic acids，cgas)，且总绿原酸含量以花蕾期最高，其量随着花冠开裂而降低。普通灰毡毛忍冬花冠开裂，蕾期较短，一般为3～7天，规模化种植时不便于采收加工等农事操作，常造成丰产不丰收。近年来，科研人员在灰毡毛忍冬中发现了花期花冠一直不开裂的优良变异类型，并选育出了花蕾型灰毡毛忍冬新品种，该表型品种花期花冠一直不开裂，花蕾整齐均呈含苞未放的棒状，蕾期长达15-25天。花蕾型灰毡毛忍冬的推广种植显著提高了药农生产效率和经济效益。
3.目前，灰毡毛忍冬作为大宗药材山银花的主要基原植物，市场需求量大，品种繁多，不同产地不同品种间的灰毡毛忍冬化学成分存在差异，市面上品种混乱，鱼目混珠，难以甄别，导致药材山银花质量良莠不齐。现阶段对于中药山银花基原植物的品种鉴别，性状和显微鉴定等形态学鉴定方法已难以满足人们快速、精准需要，同时鉴定结果容易夹带主观色彩，可靠性较差。而针对有效成分的理化鉴定，更适宜于定性辨明中药材真伪，但对于通过有效成分含量多少来进行品种鉴定则区分效果不明显，同时还要依赖于不同分析化学方法中所需仪器设备的稳定性。尽管已有少量可用的分子标记，但灰毡毛忍冬的分子标记资源仍然匮乏。为了便于日后对山银花主要基原植物灰毡毛忍冬各品种进行准确的识别鉴定、保护和栽培以及开展相关的遗传研究，亟待提供一种在非花期即可早早筛选花蕾型灰毡毛忍冬品种的方法。


技术实现要素：

4.本发明公开了一种基于代谢组差异筛选花蕾型灰毡毛忍冬的方法，通过代谢物质在灰毡毛忍冬不同品种间的差异分析，在非花期即可早早筛选花蕾型灰毡毛忍冬品种。
5.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
6.一种基于代谢组差异筛选花蕾型灰毡毛忍冬的方法，包括如下步骤：
7.(1)样品准备：
8.采集待测灰毡毛忍冬样品新鲜叶片，采集已确定的花蕾型灰毡毛忍冬和/或普通灰毡毛忍冬新鲜叶片，液氮速冻后于-80℃保存；
9.(2)样品提取：
10.样品干燥后研磨成粉末，使用提取液提取，离心吸取上清，过滤，用于uplc-ms/ms分析；
11.(3)uplc-ms/ms分析；
12.(4)数据分析：
13.基于代谢数据库，利用软件analyst 1.6.3和multiaquant 3.0.2对uplc-ms/ms分析结果进行数据分析；
14.根据待测灰毡毛忍冬样品与已确定的花蕾型灰毡毛忍冬和/或普通灰毡毛忍冬的uplc-ms/ms结果及数据分析确定差异代谢物，根据差异代谢物筛选待测灰毡毛忍冬样品中的花蕾型灰毡毛忍冬。
15.优选地，步骤(1)中，
16.叶片采集时间为花蕾期或非花蕾期。
17.优选地，步骤(2)中，
18.提取液为体积分数50％-70％的甲醇水溶液。
19.优选地，步骤(2)中，
20.样品粉末加入提取液后4℃过夜提取，提取期间进行4-8次涡旋处理。
21.优选地，步骤(2)中，
22.离心条件为转速10000g，10min；
23.过滤采用0.22μm微孔滤膜。
24.优选地，步骤(3)中，
25.液相条件：
26.色谱柱waters acquity uplc hss t3 c18 1.8μm，2.1mm*100mm；
27.流动相a相为添加有0.04v/v％乙酸的超纯水，b相为添加有0.04v/v％乙酸的乙腈；
28.洗脱梯度：0.00min b相比例为5％，10.00min内b相比例线性增加到95％，并维持在95％1min，11.00-11.10min，b相比例降为5％；并以5％平衡至14min；
29.流速0.35ml/min，柱温40℃，进样量4μl。
30.优选地，步骤(3)中，
31.质谱条件：电喷雾离子源温度550℃，质谱电压5500v，帘气30psi。
32.综上所述，本发明方法样品前处理方法简单快捷，方法建立后对检测人员操作技术要求较低；利用开源在线数据库massbank对差异性物质(潜在生物标示物)进行鉴定，结果以正交偏最小二乘判别分析(opls-da)得分图的形式展示，能够直观的判别其分类情况，有效区分花蕾型灰毡毛忍冬和普通品种，检测结果准确可靠；应用代谢组学技术结合超高效液相色谱串联四级杆-飞行时间高分辨质谱技术对灰毡毛忍冬植株样品中次级代谢产物分析，信服力高；非靶向代谢组学技术可以对代谢物的整体情况进行研究，更能反映样本的整体情况。
附图说明
33.图1所示分别为花蕾型灰毡毛忍冬(a)和普通灰毡毛忍冬(b)。
34.图2所示为花蕾型灰毡毛忍冬和普通灰毡毛忍冬代谢物质比较示意图；
35.其中，bm：普通灰毡毛忍冬；lm：花蕾型灰毡毛忍冬；1、2、3分别对应非花期、花蕾早期、花蕾晚期。
36.图3所示为差异代谢物条形图。
37.图4所示为opls-da得分图。
具体实施方式
38.下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
39.实施例1
40.一种基于代谢组差异筛选花蕾型灰毡毛忍冬的方法，包括以下步骤：
41.(1)样品准备：
42.分别以非花蕾期、花蕾早期、花蕾晚期为采集时期，采集三棵花蕾型灰毡毛忍冬和三棵普通灰毡毛忍冬植株样品(图1)新鲜的叶，共计6个样品，分别在液氮中速冻，然后放在-80℃超低温冰箱中保存用作生物材料样本。
43.(2)样品提取：
44.生物材料样本真空冷冻干燥，利用研磨仪(mm400,retsch)研磨(30hz，1.5min)至粉末状；称取100mg粉末，加入0.6ml 60％甲醇水溶液中，4℃冰箱过夜，期间涡旋六次，提高提取率；离心(转速10000g，10min)后吸取上清，用微孔滤膜(0.22μm)过滤样品，并保存于进样瓶中，用于uplc-ms/ms分析。
45.(3)色谱质谱采集条件：
46.1)液相条件：色谱柱waters acquity uplc hss t3c18 1.8μm，2.1mm*100mm；流动相a相为超纯水(加入0.04％的乙酸)，b相为乙腈(加入0.04％的乙酸)；洗脱梯度：0.00min b相比例为5％，10.00min内b相比例线性增加到95％，并维持在95％1min，11.00-11.10min，b相比例降为5％；并以5％平衡至14min；流速0.35ml/min，柱温40℃，进样量4μl。
47.2)质谱条件：电喷雾离子源(esi)温度550℃，质谱电压5500v，帘气(cur)30psi，碰撞诱导电离(cad)参数设置为高。在三重四级杆(qqq)中，每个离子对是根据优化的去簇电压(dp)和碰撞能(ce)进行扫描检测。
48.(4)数据结果分析：
49.基于开源在线数据库massbank，利用软件analyst 1.6.3和multiaquant 3.0.2对样本代谢物进行质谱定性定量分析。并根据后续各分析方法对数据进行预处理后，开展主成分分析(pca)、正交偏最小二乘判别分析(opls-da)、结果可靠性验证和差异代谢物kegg代谢通路富集分析。
50.基于6个样品检测到742个代谢物，比较花蕾型灰毡毛忍冬和普通灰毡毛忍冬的叶在非花蕾期、花蕾早期、花蕾晚期之间代谢组差异，发现210个差异代谢物，结果如图2所示。在对所检测到的代谢物进行定性和定量分析后，结合具体样品的分组情况，比较在各分组中代谢物定量信息发生的差异倍数变化，各分组比较中差异倍数log2处理后，将变化排在前面的差异表达代谢物结果展示，如图3所示。opls-da结合了正交信号矫正(osc)和pls-da方法，能够将x矩阵信息分解成与y相关和不相关的两类信息，通过去除不相关的差异来筛选差异变量；根据opls-da模型分析代谢组数据，绘制各分组的得分图，进一步展示各个分组之间的差异，结果如图4所示，根据差异代谢物可有效区分花蕾型灰毡毛忍冬和普通灰毡毛忍冬。
51.进一步地，结合差异代谢物kegg代谢通路富集分析，有利于筛选能够区别花蕾型
灰毡毛忍冬和普通灰毡毛忍冬的标志性代谢物及代谢通路，进而为后续花蕾型灰毡毛忍冬筛选的进一步简化提供依据。
52.本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
53.对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。